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丁香水提物的抑菌效应及对兔标本保存效果的研究

祖文轩 侯文瀚 王银燕 林娜 桂航 张倩楠 陈士文

引用本文:
Citation:

丁香水提物的抑菌效应及对兔标本保存效果的研究

    作者简介: 祖文轩(1987-), 男, 实验师
    通讯作者: 陈士文, chenshiwen1010@163.com
  • 基金项目:

    蚌埠医学院自然科学基金重点项目 BYKY2019010ZD

    国家级大学生创新创业训练计划项目 201910367022

  • 中图分类号: R322.34

Effect of the antimicrobial activities of water extracts from clove on rabbit specimen preservation

    Corresponding author: CHEN Shi-wen, chenshiwen1010@163.com
  • CLC number: R322.34

  • 摘要: 目的探讨丁香水提物的抑菌及组织保存作用。方法用水提法提取丁香主要成分液体,以10%甲醛及蒸馏水作对照,测定3组液体对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的抑菌圈大小,和对兔皮组织保存效果,并采用二倍稀释法测定丁香水提抑菌液的最小抑菌浓度。结果丁香水提液无刺激性气味,对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均有抑菌作用,最小抑菌浓度分别为125 mg/mL和62.5 mg/mL。作为保存液在12周内未有细菌检出。结论丁香水提物具有一定的抑菌作用,在一定时间内有较好的组织保存作用。
  • 图 1  第12周时3组液体对兔皮肤组织保存效果对比

    表 1  3组保存液的抑菌圈直径(x±s;mm)

    分组 n 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌
    实验组(丁香水提抑菌液) 3 8.67±0.58 10.27 ±0.83
    阴性对照组(蒸馏水) 3 - -
    阳性对照组(10%甲醛) 3 9.84±0.76 10.93 ±1.15
    “-”表示无抑菌圈
    下载: 导出CSV

    表 2  丁香水提液的最小抑菌浓度测定

    孔号 稀释倍数 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌
    1 1∶2 - -
    2 1∶4 - -
    3 1∶8 - -
    4 1∶16 + -
    5 1∶32 + +
    6 1∶64 + +
    7 1∶128 + +
    ~ ~ ~ ~
    13 + +
    “+”代表有细菌生长; “-”代表无细菌生长
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-07-30
  • 录用日期:  2021-03-20
  • 刊出日期:  2021-11-15

丁香水提物的抑菌效应及对兔标本保存效果的研究

    通讯作者: 陈士文, chenshiwen1010@163.com
    作者简介: 祖文轩(1987-), 男, 实验师
  • 1. 蚌埠医学院 解剖教研室, 安徽 蚌埠 233030
  • 2. 蚌埠医学院 临床医学院, 安徽 蚌埠 233030
  • 3. 蚌埠医学院 公共基础学院, 安徽 蚌埠 233030
基金项目:  蚌埠医学院自然科学基金重点项目 BYKY2019010ZD国家级大学生创新创业训练计划项目 201910367022

摘要: 目的探讨丁香水提物的抑菌及组织保存作用。方法用水提法提取丁香主要成分液体,以10%甲醛及蒸馏水作对照,测定3组液体对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的抑菌圈大小,和对兔皮组织保存效果,并采用二倍稀释法测定丁香水提抑菌液的最小抑菌浓度。结果丁香水提液无刺激性气味,对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均有抑菌作用,最小抑菌浓度分别为125 mg/mL和62.5 mg/mL。作为保存液在12周内未有细菌检出。结论丁香水提物具有一定的抑菌作用,在一定时间内有较好的组织保存作用。

English Abstract

  • 在解剖教学及各类动植物标本保存的过程中,保存液浸泡保存是最经济、便携的处理方式。而目前广泛应用的保存液成分主要是甲醛、乙醇、醋酸等化学试剂[1-2]。但这类保存液易挥发,伴有刺激性气味,长期使用甚至会损伤操作人员的呼吸系统及血液系统[3]。新型环保试剂已经成为业界研究的热点,研发一种兼顾组织保存和无毒无刺激气味的保存液对本学科的发展有着重要的贡献及意义。辛香料在食品保存产业中应用十分广泛,其中不乏一些具有防腐抗菌作用的品种。然而,辛香料作为主要成分的保存液研发及应用仍不多见,本研究选取丁香作为实验辛香料,与传统甲醛保存液相比较,探究其提取液的抑菌和保存时间,为辛香料为主要成分保存液的开发提供实验基础。

    • 将保存液分为阴性对照组(蒸馏水),实验组(丁香水提原液),阳性对照组(10%甲醛)。实验组丁香药材购于蚌埠市丰原大药房中草药专柜,蒸馏水及10%甲醛由蚌埠医学院实验中心解剖教研室实验室提供。

    • 称取10 g丁香放入三角烧瓶, 加入100 mL蒸馏水,静置2.5 h。用组装好的蒸馏仪器80 ℃下蒸馏提取6 h[4],将蒸馏完毕的提取液进行旋转蒸发:将提取液放入旋转烧瓶内,调整旋转蒸发仪转速为50 r/min,将提取液蒸发至10 mL,浓度为1 g/mL,装入试管内保存待用。

    • 采用金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌两种常见细菌,均由蚌埠医学院微生物实验室提供。分别取100 μL菌液加入0.9%氯化钠溶液,用麦氏比浊法确定两种菌的浓度,将菌液浓度调整为1.0×107 CFU/mL,于琼脂板涂布。取打孔器将滤纸裁剪成直径6 mm的圆形滤纸片,蒸汽灭菌烘干。将无菌滤纸片浸泡于3组保存液中,1 h后取出晾干。将含菌琼脂板等面划分3个区域,再将各组滤纸片分别等距贴放于区域内,标记,每组重复3次。将琼脂板放置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h,测量各组抑菌圈直径。

    • 采用双倍稀释法。(1)细菌悬液的备制:将2种细菌接种于冷凉肉汤培养基中,放入37 ℃温箱中培养24 h,使生长浊度达到9.0×108 CFU/mL。(2)丁香水提抑菌液的稀释:取26支无菌试管,标记编号,分成2组,每组13支。将菌液作1∶ 10 000倍稀释,第一号试管中加入稀释后菌液1.0 mL,余下12支试管加入1.0 mL。于第1号试管中加入1 g/mL丁香水提抑菌液1.0 mL,混合后吸出1 mL加入第2号试管,以此类推直至第12号试管,弃去12号试管中1 mL混合液,此时每只试管中液体量相同,第13号管为对照管。(3)将2组试管放入37 ℃温箱中培养24 h后送检,无细菌生长管次中最高药物稀释度为最小抑菌浓度。

    • 取新鲜新西兰兔标本,备皮,于深筋膜浅层完整剥离皮肤及皮下组织。用组织剪备制成1 cm×1 cm大小组织方块。分别取3组液体20 mL,将组织方块完全浸泡于液体后,封管,每组重复6次。比较3组保存液液体颜色,并取样送细菌培养,检测有无细菌生长。

    • 实验组及阳性对照组对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌及革兰氏阴性大肠埃希菌均有抑菌作用,其中丁香水提物对2种细菌的抑菌圈直径分别为(8.67±0.58)mm和(10.27 ±0.83)mm(见表 1)。

      分组 n 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌
      实验组(丁香水提抑菌液) 3 8.67±0.58 10.27 ±0.83
      阴性对照组(蒸馏水) 3 - -
      阳性对照组(10%甲醛) 3 9.84±0.76 10.93 ±1.15
      “-”表示无抑菌圈

      表 1  3组保存液的抑菌圈直径(x±s;mm)

    • 记录2组菌落培养液中细菌生长的最大药物稀释倍数,即最小药物浓度,并计算丁香水提液的最小抑菌浓度,金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌的最小抑菌浓度分别125 mg/mL和62.5 mg/mL(见表 2)。

      孔号 稀释倍数 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌
      1 1∶2 - -
      2 1∶4 - -
      3 1∶8 - -
      4 1∶16 + -
      5 1∶32 + +
      6 1∶64 + +
      7 1∶128 + +
      ~ ~ ~ ~
      13 + +
      “+”代表有细菌生长; “-”代表无细菌生长

      表 2  丁香水提液的最小抑菌浓度测定

    • 每周观察并取样一次,阴性对照组于第1周即被检出细菌产生,且兔皮肤组织软化,溃烂,试管内液体出现浑浊,伴有气味。阳性对照组无细菌检出,兔皮肤组织硬化,弹性差,试管内液体呈透明状,无沉淀及霉菌孢子,保存液刺激性强。实验组于第12周开始陆续检出细菌,6组重复试验中最长无细菌检出时间可达15周,最短为12周。该段时间内,兔皮肤组织弹性较阳性实验组佳,无明显刺激性及异味,随着细菌的检出,试管内液体逐渐浑浊,出现腐败气味(见图 1)。

      图  1  第12周时3组液体对兔皮肤组织保存效果对比

    • 甲醛在室温时易挥发, 并且随着温度的上升会加快挥发速度,产生很强的刺激性气味,对人体皮肤和黏膜刺激性大,眼结膜和呼吸道的刺激尤为强烈,在我国有毒化学品优先控制名单上甲醛高居第二位,并且已经被世界卫生组织确定为致癌和致畸形物质[5],危害人体健康。因此, 探求无刺激性保存液取代甲醛液, 长期以来为解剖学界所普遍关注,并提出了很多改良方法。例如异噻唑啉酮类混合防腐液、苯甲酸乙醇保存液等[6], 但效果并不满意,存在标本质地硬、易撕裂,液体易霉变、浑浊,消耗量大等问题。低温保存技术可以较好保存人体标本,但使用技术要求高,标本反复升降温会滋生细菌,且成本高昂[7]。生物塑化技术自二十世纪80年代发明以来,在人体解剖学标本制作中得到广泛应用,虽然其固定效果好,但固定后的标本理化性质完全改变,仅适用于标本陈列,并不适合实验教学和科学研究。国内关于离子保存液研究较少,且制作难度大,使用成本高[8]。近些年来,随着化学技术发展,将新型防腐组分引入人体标本保存技术已成为可能[1, 9]。利用新型防腐组分用于人体标本保存,对于提高人体标本保存效果方面具有较乐观的前景。

      辛香料作为防腐制品最早可以追溯到原始时代,当时人们发现剩余的食物如果和一些植物的茎叶一起储藏,可以抑制食品的腐败,遮盖异味。而我国辛香料作为防腐增味剂在食品加工储藏运输中已经广泛应用[3, 10]。本课题组在前期预实验中筛选了26种辛香料材,采用水提法得到提取液,初次实验观察到丁香有较好的防霉作用,在本研究中进行了进一步的验证。

      植物的提纯方法包括水提法、盐提法、醇提法和碱提法[11]等。本实验主要检测提取物的抑菌作用,为了排除溶剂本身对细菌的抑制作用,降低实验结果的偏移,本实验采用水提法提取丁香活性液。丁香属木樨科植物,含紫丁香醇、苯乙醇、芳樟醇、大茴香醛等,在我国华北、东北、西北、华东等地区有着广泛的种植与栽培,购置成本低,提取物无明显的刺激性气味。进一步的实验发现,丁香水提物对金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌的抑菌圈大小相较于10%甲醛无明显差异。且在12周内对兔皮肤组织有着较好的保存作用。

      综上,丁香水提物具有一定的抑菌作用,在一定时间内有较好的组织保存作用,为新型环保保存液的研究提供一定的实验基础。但其有效抑菌成分的纯化及长效保存能力的保证仍需进一步的探索。

参考文献 (11)

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