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circ_0000515靶向miR-1258调控结肠癌细胞增殖和凋亡的机制研究

汪景坤 樊丽伟 李洵 付晓霞 赵彦焕 张东姣 赵玉红 张磊

引用本文:
Citation:

circ_0000515靶向miR-1258调控结肠癌细胞增殖和凋亡的机制研究

    作者简介: 汪景坤(1983-), 女, 硕士, 副主任医师
    通讯作者: 张磊, gjke32@163.com
  • 基金项目:

    河北省保定市科技计划项目 18ZF181

  • 中图分类号: R735.35

Effect of circ_0000515 targeting miR-1258 on the proliferation and apoptosis in the colon cancer cells

    Corresponding author: ZHANG Lei, gjke32@163.com
  • CLC number: R735.35

  • 摘要: 目的探讨circ_0000515调控结肠癌细胞增殖和凋亡的分子机制。方法选取41例结肠癌病人癌组织及癌旁组织标本,用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测circ_0000515和miR-1258的表达水平;结肠癌细胞SW620分为si-circ_0000515组、si-NC组、miR-1258组、miR-NC组、si-circ_0000515+anti-miR-NC组、si-circ_0000515+anti-miR-1258组。四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测SW620细胞活性;流式细胞术检测SW620细胞凋亡;双荧光素酶报告实验检测circ_0000515和miR-1258的靶向关系。结果与癌旁组织比较,结肠癌组织中circ_0000515表达水平升高,miR-1258表达水平降低(P < 0.01)。抑制circ_0000515表达或过表达miR-1258,SW620细胞活性降低,SW620细胞的凋亡率升高(P < 0.01)。circ_0000515靶向调控miR-1258;干扰miR-1258表达逆转了抑制circ_0000515表达对结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的作用。结论抑制circ_0000515表达通过靶向上调miR-1258抑制结肠癌细胞增殖,促进凋亡。
  • 图 1  抑制circ_0000515表达对结肠癌患者SW620细胞增殖和凋亡情况

    图 2  circ_0000515与miR-1258的结合位点

    图 3  miR-1258过表达对结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响

    图 4  干扰miR-1258表达逆转了抑制circ_0000515表达对结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的作用

    表 1  circ_0000515和miR-1258在结肠癌组织中的表达(x±s)

    分组 n circ_0000515 miR-1258
    癌旁组织 41 1.00±0.07 1.00±0.07
    结肠癌组织 41 3.90±0.24 0.33±0.03
    t 78.17 67.49
    P < 0.01 < 0.01
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    表 2  抑制circ_0000515表达对结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响(x±s)

    分组 n circ_0000515 OD值(450 nm) 凋亡率/% Ki-67蛋白 Bcl-2蛋白 Bax蛋白
    si-NC 9 1.00±0.07 0.84±0.06 7.16±0.65 0.72±0.05 0.61±0.04 0.16±0.02
    si-circ_0000515 9 0.36±0.03 0.48±0.04 25.90±2.08 0.32±0.03 0.26±0.03 0.59±0.04
    t 25.21* 14.98 25.80* 20.58 21.00 28.85
    P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
      *t′值
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    表 3  双荧光素酶报告实验(x±s)

    分组 n WT-circ_0000515 MUT-circ_0000515
    miR-NC 9 0.99±0.05 0.97±0.06
    miR-1258 9 0.42±0.04 1.00±0.07
    t 26.71 0.98
    P < 0.01 >0.05
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    表 4  circ_0000515调控miR-1258的表达(x±s)

    分组 n miR-1258
    pcDNA 9 1.00±0.06
    pcDNA-circ_0000515 9 0.33±0.03*
    si-NC 9 0.99±0.06
    si-circ_0000515 9 2.74±0.21#
    F 734.64
    P < 0.01
    MS组内 0.013
    q检验:与pcDNA组比较*P < 0.05;与si-NC组比较#P < 0.05
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    表 5  过表达miR-1258对结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响(x±s)

    分组 n miR-1258 OD值(450 nm) 凋亡率/% Ki-67蛋白 Bcl-2蛋白 Bax蛋白
    miR-NC 9 1.00±0.06 0.87±0.05 6.87±0.55 0.74±0.05 0.64±0.05 0.13±0.02
    miR-1258 9 3.40±0.29 0.53±0.04 19.98±1.89 0.39±0.03 0.33±0.03 0.52±0.04
    t 24.31* 15.93 19.98* 18.01 15.95 26.16
    P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
      *示t′值
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    表 6  干扰miR-1258表达逆转了抑制circ_0000515表达对结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的作用(x±s)

    分组 n miR-1258 OD值(450 nm) 凋亡率/% Ki-67蛋白 Bcl-2蛋白 Bax蛋白
    si-circ_0000515+anti-miR-NC 9 1.00±0.05 0.46±0.04 27.35±2.23 0.30±0.02 0.25±0.02 0.60±0.04
    si-circ_0000515+anti-miR-1258 9 0.29±0.03 0.73±0.06 11.84±1.17 0.64±0.05 0.48±0.04 0.27±0.02
    t 36.53 11.23 18.48 18.94 15.43 22.14
    P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-04-12
  • 录用日期:  2021-10-25
  • 刊出日期:  2021-12-15

circ_0000515靶向miR-1258调控结肠癌细胞增殖和凋亡的机制研究

    通讯作者: 张磊, gjke32@163.com
    作者简介: 汪景坤(1983-), 女, 硕士, 副主任医师
  • 中国人民解放军陆军第八十二集团军医院 消化内科, 河北 保定 071000
基金项目:  河北省保定市科技计划项目 18ZF181

摘要: 目的探讨circ_0000515调控结肠癌细胞增殖和凋亡的分子机制。方法选取41例结肠癌病人癌组织及癌旁组织标本,用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测circ_0000515和miR-1258的表达水平;结肠癌细胞SW620分为si-circ_0000515组、si-NC组、miR-1258组、miR-NC组、si-circ_0000515+anti-miR-NC组、si-circ_0000515+anti-miR-1258组。四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测SW620细胞活性;流式细胞术检测SW620细胞凋亡;双荧光素酶报告实验检测circ_0000515和miR-1258的靶向关系。结果与癌旁组织比较,结肠癌组织中circ_0000515表达水平升高,miR-1258表达水平降低(P < 0.01)。抑制circ_0000515表达或过表达miR-1258,SW620细胞活性降低,SW620细胞的凋亡率升高(P < 0.01)。circ_0000515靶向调控miR-1258;干扰miR-1258表达逆转了抑制circ_0000515表达对结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的作用。结论抑制circ_0000515表达通过靶向上调miR-1258抑制结肠癌细胞增殖,促进凋亡。

English Abstract

  • 结肠癌是世界上最高发的恶性肿瘤之一,尽管外科手术治疗取得一定进展,但其死亡率一直居高不下,对于晚期及转移性结肠癌,多学科的综合治疗是其重要手段,其中靶向治疗越来越受到关注[1-3]。研究[4]表明circRNA参与调控结肠癌的进展,可作为潜在的生物标志物,为结肠癌提供潜在的治疗靶点。circ_0000515位于chr14:20811305-20811534,又名circRPPH1,circ_0000515低表达与宫颈癌病人预后良好相关;circ_0000515充当miR-326海绵通过上调ELK1促进宫颈癌的进展[5]。circRPPH1在体内促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和血管生成以及肿瘤生长[6]。然而circ_0000515对结肠癌细胞增殖和凋亡的影响及机制尚不清楚。研究[7-8]报道上调的miR-1258可抑制结直肠癌细胞的增殖和迁移。miR-1258上调显著抑制骨肉瘤细胞增殖,并促进细胞周期停滞在G0/G1[9]。circ_0101432通过靶向miR-1258和miR-622并上调MAPK1表达来抑制肝癌细胞凋亡,促进细胞增殖,侵袭能力和肿瘤生长[10]。然而circ_0000515是否通过调控miR-1258影响结肠癌细胞增殖和凋亡尚不清楚。

    • 选取我院病理科存档且已确诊的结肠癌病人癌组织及癌旁组织标本41例,其中男24例,女17例,年龄33~75岁,平均(39.9±1.1)岁;所有病人均知情且同意。

    • 结肠癌细胞株SW620购自美国ATCC;RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司;Trizol试剂和荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司;MTT试剂盒、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自日本同仁研究所;蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物有限公司;双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海沪震实业有限公司。

    • 结肠癌细胞株SW620用RPMI-1640培养基常规培养,将circ_0000515干扰表达载体及其阴性对照、miR-1258模拟物及其阴性对照转染至SW620细胞中,记为si-circ_0000515组、si-NC组、miR-1258组、miR-NC组;将circ_0000515干扰表达载体分别与miR-1258抑制剂及其阴性对照转染至SW620细胞中,记为si-circ_0000515+anti-miR-1258组、si-circ_0000515+anti-miR-NC组。

    • 提取结肠癌组织及细胞总RNA,按试剂盒使用说明进行RT-qPCR,PCR反应条件:95 ℃预变性3 min,95 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40个循环;融解曲线:95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,95 ℃ 15 s。相对表达量用2-△△Ct法计算。

    • 细胞培养48 h,按试剂盒说明操作,用酶标仪于450 nm处检测吸光度(OD)值。

    • 收集培养48 h细胞,按试剂盒说明书操作,上流式细胞仪检测。

    • 收集细胞,提取总蛋白,取50 μL样品进行SDS-PAGE,电转至PVDF,封闭后加入一抗,4 ℃过夜,加入二抗室温1 h,显影、定影,成像后检测蛋白条带灰度水平,以GAPDH为内参计算蛋白表达水平。

    • 构建circ_0000515的野生型和突变型荧光素酶载体WT-circ_0000515和MUT-circ_0000515,将其分别与miR-NC和miR-1258共转染至SW620细胞中,按照说明书检测荧光素酶活性。

      将circ_0000515干扰表达载体、过表达载体及其阴性对照转染至SW620细胞中,按1.4中方法检测miR-1258表达水平。

    • 采用两独立样本t(或t′)检验、配对t检验、单因素方差分析和q检验。

    • 与癌旁组织比较,结肠癌组织中circ_0000515表达水平升高,miR-1258表达水平降低,差异均有统计学意义(P < 0.01)(见表 1)。

      分组 n circ_0000515 miR-1258
      癌旁组织 41 1.00±0.07 1.00±0.07
      结肠癌组织 41 3.90±0.24 0.33±0.03
      t 78.17 67.49
      P < 0.01 < 0.01

      表 1  circ_0000515和miR-1258在结肠癌组织中的表达(x±s)

    • 与si-NC组比较,si-circ_0000515组circ_0000515表达水平降低,SW620细胞活性降低,SW620细胞的凋亡率升高,SW620细胞中Ki-67、Bcl-2表达水平降低,Bax表达水平升高,差异均有统计学意义(P < 0.01)(见图 1表 2)。

      图  1  抑制circ_0000515表达对结肠癌患者SW620细胞增殖和凋亡情况

      分组 n circ_0000515 OD值(450 nm) 凋亡率/% Ki-67蛋白 Bcl-2蛋白 Bax蛋白
      si-NC 9 1.00±0.07 0.84±0.06 7.16±0.65 0.72±0.05 0.61±0.04 0.16±0.02
      si-circ_0000515 9 0.36±0.03 0.48±0.04 25.90±2.08 0.32±0.03 0.26±0.03 0.59±0.04
      t 25.21* 14.98 25.80* 20.58 21.00 28.85
      P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
        *t′值

      表 2  抑制circ_0000515表达对结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响(x±s)

    • Circular RNA Interactome预测显示circ_0000515的序列中含有与miR-1258互补的核苷酸序列(见图 2);miR-1258与WT-circ_0000515共转染的SW620细胞荧光素酶活性降低,差异有统计学意义(P < 0.01),而与MUT-circ_0000515共转染的SW620细胞荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)(见表 3)。过表达circ_0000515后miR-1258表达水平降低,抑制circ_0000515表达后miR-1258表达水平升高,差异均有统计学意义(P < 0.05)(见表 4)。

      图  2  circ_0000515与miR-1258的结合位点

      分组 n WT-circ_0000515 MUT-circ_0000515
      miR-NC 9 0.99±0.05 0.97±0.06
      miR-1258 9 0.42±0.04 1.00±0.07
      t 26.71 0.98
      P < 0.01 >0.05

      表 3  双荧光素酶报告实验(x±s)

      分组 n miR-1258
      pcDNA 9 1.00±0.06
      pcDNA-circ_0000515 9 0.33±0.03*
      si-NC 9 0.99±0.06
      si-circ_0000515 9 2.74±0.21#
      F 734.64
      P < 0.01
      MS组内 0.013
      q检验:与pcDNA组比较*P < 0.05;与si-NC组比较#P < 0.05

      表 4  circ_0000515调控miR-1258的表达(x±s)

    • 与miR-NC组比较,miR-1258组miR-1258表达水平升高,SW620细胞活性降低,SW620细胞的凋亡率升高,SW620细胞中Ki-67、Bcl-2表达水平降低,Bax表达水平升高,差异均有统计学意义(P < 0.01)(见图 3表 5)。

      图  3  miR-1258过表达对结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响

      分组 n miR-1258 OD值(450 nm) 凋亡率/% Ki-67蛋白 Bcl-2蛋白 Bax蛋白
      miR-NC 9 1.00±0.06 0.87±0.05 6.87±0.55 0.74±0.05 0.64±0.05 0.13±0.02
      miR-1258 9 3.40±0.29 0.53±0.04 19.98±1.89 0.39±0.03 0.33±0.03 0.52±0.04
      t 24.31* 15.93 19.98* 18.01 15.95 26.16
      P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
        *示t′值

      表 5  过表达miR-1258对结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的影响(x±s)

    • 与si-circ_0000515+anti-miR-NC组比较,si-circ_0000515+anti-miR-1258组miR-1258表达水平降低,SW620细胞活性升高,SW620细胞的凋亡率降低,SW620细胞中Ki-67、Bcl-2表达水平升高,Bax表达水平降低,差异均有统计学意义(P < 0.01)(见图 4表 6)。

      图  4  干扰miR-1258表达逆转了抑制circ_0000515表达对结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的作用

      分组 n miR-1258 OD值(450 nm) 凋亡率/% Ki-67蛋白 Bcl-2蛋白 Bax蛋白
      si-circ_0000515+anti-miR-NC 9 1.00±0.05 0.46±0.04 27.35±2.23 0.30±0.02 0.25±0.02 0.60±0.04
      si-circ_0000515+anti-miR-1258 9 0.29±0.03 0.73±0.06 11.84±1.17 0.64±0.05 0.48±0.04 0.27±0.02
      t 36.53 11.23 18.48 18.94 15.43 22.14
      P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01

      表 6  干扰miR-1258表达逆转了抑制circ_0000515表达对结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的作用(x±s)

    • 分子靶向治疗作为新型癌症治疗方法,其在结肠癌的治疗中也具有重要意义,而寻找可靠的分子靶点是实现靶向药物治疗的关键[11-12]。研究[13]报道circ_0000515在肝癌组织和细胞系中上调,可用于预测肝癌的肿瘤分期,淋巴转移和预后;敲除circ_0000515可减弱肝癌Hep3B和MHCC88H细胞的增殖和迁移能力。circ_0000515通过调控miR-296-5p/CXCL10轴促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭[14]。circ_0000515在肿瘤中可能起促癌作用。本实验结果显示,结肠癌组织中circ_0000515表达水平升高;抑制circ_0000515表达后,SW620细胞活性降低,SW620细胞的凋亡率升高,SW620细胞中Ki-67、Bcl-2表达水平降低,Bax表达水平升高;说明抑制circ_0000515表达可抑制结肠癌细胞增殖、促进细胞凋亡。

      研究[15]报道miR-1258通过GRB2/Ras/Erk途径抑制非小细胞肺癌细胞增殖并诱导衰老和凋亡。miR-1258的过表达抑制了甲状腺乳头状癌KTC-1细胞的活力以及迁移和侵袭的能力[16]。本实验结果显示,结肠癌组织中miR-1258表达水平降低;过表达miR-1258抑制SW620细胞增殖,促进细胞凋亡。研究发现circ_0046599可以通过使miR-1258海绵化而增加RPN2表达来促进肝细胞癌的发展[17]。circ_002178通过调节miR-1258/KDM7A轴来促进乳腺癌细胞的生长和迁移[18]。说明circRNA可通过调控miR-1258影响肿瘤进展。本实验结果显示,circ_0000515靶向调控miR-1258;干扰miR-1258表达逆转了抑制circ_0000515表达对结肠癌SW620细胞增殖和凋亡的作用。

      综上所述,抑制circ_0000515表达通过靶向上调miR-1258抑制结肠癌细胞增殖,促进凋亡。

参考文献 (18)

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