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在肝癌病理过程中，多种趋化因子、生长因子和细胞因子发挥着调控肿瘤细胞增殖和迁移的作用[1-2]。血管紧张素Ⅱ是肾素-血管紧张素系统的主要效应分子，具有诱导肝癌细胞增殖、侵袭及转移等多种生物学行为的作用，但其具体机制目前并未阐明[3]，而肾素-血管紧张素系统是机体内的一种重要神经-体液调节系统[4]。细胞内各种信号分子生物学作用的发挥与细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)1/2磷酸化密切相关，并且各种刺激活化的ERK1/2具有调控不同细胞生物学行为的作用[5]。本研究探讨血管紧张素Ⅱ对肝癌细胞增殖的影响及其相关机制。
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人肝癌细胞株HepG2由中国科学院上海细胞库研究所提供；血管紧张素Ⅱ和血管紧张素1型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)抗体购自英国Abcam公司；胎牛血清与DMEM培养基均购自美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购自广州研创生物技术发展有限公司；ERK1/2抗体购自美国Cell Signaling公司。
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取肝癌HepG2细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，培养箱设置37 ℃、5% CO2、饱和湿度环境。每日定期换液，待细胞融合度达90%后，采用0.25%胰酶消化并进行细胞传代。
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取生长状况良好且处于对数生长期细胞，细胞融合度约为80%。用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，对细胞进行计数，调整细胞密度为25 000/mL。将肝癌细胞以1×108/L密度置于96孔板中，更换培养基(含血管紧张素Ⅱ浓度分别为10-8、10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L)，设置对照组(不含药物的培养基)，分别培养24、48 h后取出。加入CCK-8试剂，继续培养90 min后，采用酶标仪(美国BIO-RAD公司)在检测波长450 nm处测定各孔的吸光度值。
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经血管紧张素Ⅱ处理24 h后，对细胞进行裂解，置于抗凝管中，12 000 r/min离心15 min，取上清液。测定蛋白浓度，加入缓冲液，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳处理，转膜、封闭。加入一抗，4 ℃孵育过夜，次日洗膜，加入二抗，室温孵育2 h，加入化学发光液，化学发光、显影、定影后凝胶图像分析，以目的条带与β-actin光密度值作为目的条带的相对表达值。
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采用t检验、方差分析和q检验。
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作用24 h，10-6、10-5 mol/L血管紧张素Ⅱ处理的HepG2细胞吸光度值均高于对照组(P < 0.05)；10-5 mol/L血管紧张素Ⅱ处理的HepG2细胞吸光度值高于10-8 mol/L血管紧张素Ⅱ组(P < 0.05)。作用48 h，10-8、10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L血管紧张素Ⅱ处理的HepG2细胞吸光度值均高于对照组(P < 0.05)(见表 1)。
分组 n 24 h 48 h t P 对照组 5 0.68±0.06 0.71±0.09 0.62 >0.05 血管紧张素Ⅱ/(mol/L) 10-8 5 0.74±0.07 1.17±0.14* 6.14 < 0.01 10-7 5 0.78±0.14 1.19±0.18* 4.02 < 0.01 10-6 5 0.94±0.11* 1.29±0.07* 6.00 < 0.01 10-5 5 0.99±0.12*# 1.24±0.16* 2.80 < 0.05 10-4 5 0.83±0.10 1.20±0.15* 4.59 < 0.01 F — 6.57 11.89 — — P — < 0.01 < 0.01 — — MS组内 — 0.011 0.019 — — q检验：与对照组比较*P < 0.05；与10-8 mol/L比较#P < 0.05 表 1 各组HepG2细胞吸光度值比较(x±s)
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10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L血管紧张素Ⅱ处理的HepG2细胞中AT1R蛋白表达水平均高于对照组(P < 0.05)。10-8、10-6、10-5、10-4 mol/L血管紧张素Ⅱ各亚组比较，HepG2细胞AT1R蛋白表达随着药物浓度的升高而升高(P < 0.01)(见表 2)。
分组 n AT1R蛋白表达 对照组 5 0.43±0.07 血管紧张素Ⅱ/(mol/L) 10-8 5 0.55±0.09 10-7 5 0.62±0.04* 10-6 5 0.68±0.08* 10-5 5 0.75±0.09*# 10-4 5 0.93±0.12*#▲■△ F — 20.41 P — < 0.01 MS组内 — 0.007 q检验：与对照组比较*P < 0.05；与10-8 mol/L比较#P < 0.05；与10-7 mol/L比较▲P < 0.05；与10-6 mol/L比较■P < 0.05；与10-5 mol/L比较△P < 0.05 表 2 各组HepG2细胞AT1R蛋白表达比较(x±s)
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10-6 mol/L血管紧张素Ⅱ处理HepG2细胞5、10、20、30 min后ERK1/2蛋白表达量并无明显改变(P>0.05)，而在处理5、10 min后磷酸化ERK1/2蛋白表达量高于0、20、30 min(P < 0.05)(见表 3)。
时间/ min ERK1/2蛋白 磷酸化ERK1/2蛋白 0 1.00±0.06 0.91±0.09 5 1.01±0.12 1.23±0.16* 10 1.03±0.09 1.20±0.13* 20 1.05±0.12 0.95±0.11#▲ 30 1.07±0.14 0.89±0.12#▲ F 0.34 8.85 P >0.05 < 0.01 MS组内 0.012 0.015 q检验：与0 min比较*P < 0.05；与5 min比较#P < 0.05；与10 min比较▲P < 0.05 表 3 各组HepG2细胞ERK1/2蛋白及磷酸化ERK1/2蛋白表达的比较(n=5；x±s)
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既往研究[6-7]证实，血管紧张素Ⅱ可通过诱导子宫内膜癌、乳腺癌、肺癌等多种癌细胞血管内皮生长因子的表达而诱导肿瘤新生血管的形成，最终可诱导肿瘤生长和转移。血管紧张素Ⅱ具有调节血管平滑肌收缩、促使血压水平升高[8]。动物实验[9]研究表明，血管紧张素Ⅱ与去甲肾上腺素共同作用可促使大鼠心肌细胞胰岛素受体β亚基酪氨酸磷酸化水平下降，使得胰岛素受体底物1酪氨酸磷酸化水平增高，同时血管紧张素Ⅱ含量增加是引起胰岛素受体底物1酪氨酸磷酸化水平上升的可能原因。而在细胞增殖方面，研究认为可能与AT1R相关[10]。AT1R广泛分布于人体各个组织，AT1R属于G蛋白受体，本身不具备内在酪氨酸激酶活性，但因具有类似于表皮生长因子受体基序YLPP、血小板源性生长因子受体基序YIIP的YIPP，因此，能够与络氨酸激酶结合，并激活MAPK通路通过级联效应调控细胞生长、增殖。本研究结果显示，10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L血管紧张素Ⅱ处理的HepG2细胞中AT1R蛋白表达水平均高于对照组，提示血管紧张素Ⅱ可调控AT1R蛋白表达水平。
既往研究[11-12]证实，AT1R与肿瘤细胞增殖和迁移等行为存在密切关系。本研究结果显示，10-6、10-5 mol/L血管紧张素Ⅱ处理HepG2细胞24 h，其吸光度值均高于对照组。与AT1R蛋白表达在10-8~10-4 mol/L均呈上升趋势相比，HepG2细胞吸光度至10-5 mol/L便不再升高，提示血管紧张素Ⅱ调控HepG2细胞增殖有上限。ERK是一种重要的信号激酶，其主要通过Ras/Raf/ERK 1/2途径进行酶促级联反应[13]，进而调控细胞的生长、发育和分化。既往研究[14]证实，MEK、Raf、ERK1等信号通路与肝癌的发生、发展密切相关。另有研究[15]表明，ERK1/2信号通路可通过血管紧张素Ⅱ诱导乳腺癌细胞的增殖。本实验中，以10-6 mol/L血管紧张素Ⅱ干预HepG2细胞，HepG2细胞经药物处理5、10、20、30 min后，磷酸化ERK1/2蛋白表达量明显上调，且在5、10 min时表达水平上调最为明显。提示，血管紧张素Ⅱ可通过ERK1/2信号通路进而参与肝癌细胞的增殖。本研究结果也显示，尽管磷酸化ERK1/2蛋白表达量差异有统计学意义，但ERK1/2蛋白并无明显差异，提示血管紧张素Ⅱ可能通过促进ERK1/ 2磷酸化而参与肝癌细胞生长、分化。
综上，血管紧张素Ⅱ可能通过上调AT1R的蛋白表达，促进ERK1/2磷酸化，以促进肝癌HepG2细胞异常增殖。
血管紧张素Ⅱ对肝癌细胞增殖的影响及其机制研究
Effect of angiotensin Ⅱ on the proliferation of hepatoma cells and its mechanism
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摘要:
目的研究血管紧张素Ⅱ对肝癌HepG2细胞增殖的影响及其机制。 方法采用CCK-8法测定不同浓度血管紧张素Ⅱ作用24、48 h对HepG2细胞增殖的影响。通过蛋白质免疫印迹法测定血管紧张素Ⅱ处理后HepG2细胞内细胞外信号调节激酶（ERK）1/2和血管紧张素Ⅱ-1型受体（AT1R）蛋白表达水平。 结果作用24 h，10-6、10-5 mol/L血管紧张素Ⅱ处理的HepG2细胞吸光度值均高于对照组（P < 0.05）；10-5 mol/L血管紧张素Ⅱ处理的HepG2细胞吸光度值高于10-8 mol/L血管紧张素Ⅱ组（P < 0.05）。作用48 h，10-8、10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L血管紧张素Ⅱ处理的HepG2细胞吸光度值均高于对照组（P < 0.05）。10-7、10-6、10-5、10-4 mol/L血管紧张素Ⅱ处理的HepG2细胞中AT1R蛋白表达水平均高于对照组（P < 0.05）。10-8、10-6、10-5、10-4 mol/L血管紧张素Ⅱ各亚组比较，HepG2细胞AT1R蛋白表达随着药物浓度的升高而升高（P < 0.01）。10-6 mol/L血管紧张素Ⅱ处理HepG2细胞5、10、20、30 min后ERK1/2蛋白表达量并无明显改变（P>0.05），而在处理5、10 min后磷酸化ERK1/2蛋白表达量高于0、20、30 min（P < 0.05）。 结论血管紧张素Ⅱ可能通过上调AT1R的蛋白表达，促进ERK1/2磷酸化，以促进肝癌HepG2细胞异常增殖。 Abstract:ObjectiveTo study the effect of angiotensin Ⅱ on the proliferation of hepatoma HepG2 cells and its mechanism. MethodsCCK-8 method was used to determine the effects of different concentrations of angiotensin Ⅱ on the proliferation of HepG2 cells treated for 24 and 48 hours.The expression levels of extracellular signal regulated kinase(ERK) 1/2 and angiotensin Ⅱ type 1 receptor(AT1R) in HepG2 cells treated with angiotensin Ⅱ were measured by Western blotting. ResultsThe absorbance values of HepG2 cells treated with 10-6 and 10-5 mol/L angiotensin Ⅱ for 24 hours were higher than those in control group(P < 0.05), which in 10-5 mol/L angiotensin Ⅱ group was higher than that in 10-8 mol/L angiotensin Ⅱ group(P < 0.05).The absorbance values of HepG2 cells treated with 10-8, 10-7, 10-6, 10-5 and 10-4 mol/L angiotensin Ⅱ for 48 hours were higher than those in control group(P < 0.05).The expression levels of AT1R protein in HepG2 cells treated with 10-7, 10-6, 10-5 and 10-4 mol/L angiotensin Ⅱ were higher than those in the control group(P < 0.05).Among the 10-8, 10-6, 10-5 and 10-4 mol/L angiotensin Ⅱ groups, the expression of AT1R protein in HepG2 cells increased with the increase of drug concentration(P < 0.01).The expression of ERK1/2 protein in HepG2 cells treated with 10-6 mol/L angiotensin Ⅱ for 5, 10, 20 and 30 minutes did not change significantly(P>0.05), but the expression of phosphorylated ERK1/2 protein treated for 5 and 10 minutes was higher than that for 0, 20 and 30 minutes(P < 0.05). ConclusionsAngiotensin Ⅱ may be through upregulating AT1R protein expression and promoting ERK1/2 phosphorylation to promote the abnormal proliferation of hepatoma HepG2 cells. -
表 1 各组HepG2细胞吸光度值比较(x±s)
分组 n 24 h 48 h t P 对照组 5 0.68±0.06 0.71±0.09 0.62 >0.05 血管紧张素Ⅱ/(mol/L) 10-8 5 0.74±0.07 1.17±0.14* 6.14 < 0.01 10-7 5 0.78±0.14 1.19±0.18* 4.02 < 0.01 10-6 5 0.94±0.11* 1.29±0.07* 6.00 < 0.01 10-5 5 0.99±0.12*# 1.24±0.16* 2.80 < 0.05 10-4 5 0.83±0.10 1.20±0.15* 4.59 < 0.01 F — 6.57 11.89 — — P — < 0.01 < 0.01 — — MS组内 — 0.011 0.019 — — q检验：与对照组比较*P < 0.05；与10-8 mol/L比较#P < 0.05 
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表 2 各组HepG2细胞AT1R蛋白表达比较(x±s)
分组 n AT1R蛋白表达 对照组 5 0.43±0.07 血管紧张素Ⅱ/(mol/L) 10-8 5 0.55±0.09 10-7 5 0.62±0.04* 10-6 5 0.68±0.08* 10-5 5 0.75±0.09*# 10-4 5 0.93±0.12*#▲■△ F — 20.41 P — < 0.01 MS组内 — 0.007 q检验：与对照组比较*P < 0.05；与10-8 mol/L比较#P < 0.05；与10-7 mol/L比较▲P < 0.05；与10-6 mol/L比较■P < 0.05；与10-5 mol/L比较△P < 0.05
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表 3 各组HepG2细胞ERK1/2蛋白及磷酸化ERK1/2蛋白表达的比较(n=5；x±s)
时间/ min ERK1/2蛋白 磷酸化ERK1/2蛋白 0 1.00±0.06 0.91±0.09 5 1.01±0.12 1.23±0.16* 10 1.03±0.09 1.20±0.13* 20 1.05±0.12 0.95±0.11#▲ 30 1.07±0.14 0.89±0.12#▲ F 0.34 8.85 P >0.05 < 0.01 MS组内 0.012 0.015 q检验：与0 min比较*P < 0.05；与5 min比较#P < 0.05；与10 min比较▲P < 0.05
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