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糖尿病病人心血管并发症之一为糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM),DCM是危险且常见的并发症,其重要的病理生理学特征改变是心肌细胞原发性损伤会引起结构异常而导致心肌纤维化[1]。研究[2]显示,Wnt信号通路在心脏发育与血管生成过程中承担重要调控作用。Wnt信号通路在心脏发育早期被激活,加速心脏祖细胞的增殖和迁移,但其活性在心脏发育晚期则被抑制,促进心肌细胞分化[3]。因此,阻断Wnt信号通路的异常激活可以在临床上用作糖尿病心肌纤维化干预及治疗的方法[4]。
药材丹参首次被记录在《神农本草经》里,并在上品之列,它含有众多化学成分,其中酚酸类物质是主要水溶性成分,为丹参抗心血管疾病的主要活性物质。酚酸类化合物具有加强心肌收缩能力、调节心脏功能、平衡心肌耗氧量;扩张冠状动脉, 增加血流量;防止血小板聚集、抗血栓形成, 并影响血液流变学;改善肝脏微循环、降低血脂等效果[5-6]。丹参作为活血化瘀之要药在中医药领域广泛使用,但其主要有效成分丹酚酸A作用于心肌纤维化的效果研究不多见。本研究使用由高浓度葡萄糖诱导心肌成纤维细胞体外培养模型,观察丹酚酸A对心肌成纤维细胞中Wnt信号传导途径的调节。
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SD大鼠乳鼠心肌CFs在2~3 d会迅速生长成为融合状态。细胞体大,多为细胞质透明的梭形,具有一个卵圆形的核,通常含有1~2个核仁(见图 1、2),无自发性搏动。细胞台盼兰染色后细胞存活率>90%,经免疫组织化学染色鉴定Vinentin染色呈阳性,抗原呈红色(见图 3);Desmin染色呈阴性(见图 4)者为实验需要的CFs,细胞纯度为98%。
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在高浓度葡萄糖条件下培养24、48 h,细胞的增殖活性均高于正常对照组(P < 0.01和P < 0.05)(见表 1)。高渗对照组细胞增殖活性与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05),高浓度葡萄糖可以诱导CFs增殖(P < 0.01)。干预24 h后,高浓度葡萄糖可以诱导心肌成纤维细胞明显增殖(P < 0.01);与模型对照组相比,用药组均可明显抑制细胞增殖(P < 0.01),以西药对照组作用效果最明显(P < 0.01)。干预48 h后,高浓度葡萄糖可以诱导心肌成纤维细胞明显增殖(P < 0.01);与模型对照组相比,用药组均可明显抑制细胞增殖(P < 0.01),西药对照组作用效果最明显(P < 0.01)(见表 2)。
分组 OD 24 h 48 h 正常对照组 0.118±0.006 0.142±0.018 模型对照组 0.138±0.010 0.166±0.015 t 4.20 2.51 P < 0.01 < 0.05 表 1 高浓度葡萄糖在不同时间点对CFs增殖活性的作用(ni=6;x±s)
分组 OD 24 h 48 h 正常对照组 0.118±0.006 0.142±0.018 模型对照组 0.138±0.010## 0.166±0.015## 高渗对照组 0.129±0.013 0.150±0.016 100 mg/L丹酚酸A组 0.102±0.002##** 0.114±0.012** 50 mg/L丹酚酸A组 0.118±0.006**▲▲ 0.119±0.008##** 25 mg/L丹酚酸A组 0.126±0.009#**▲▲ 0.131±0.008##**▲ 西药对照组 0.080±0.003##**▲▲■■△△ 0.068±0.002##**▲▲■ ■△△ F 36.25 38.88 P < 0.01 < 0.01 MS组内 0.000 0.000 q检验:与正常对照组比较#P < 0.05,##P < 0.01;与模型对照组比较**P < 0.01;与100 mg/L丹酚酸A组比较▲P < 0.05,▲▲P < 0.01;与50 mg/L丹酚酸A组比较■■P < 0.01;与25 mg/L丹酚酸A组比较△△P < 0.01 表 2 丹酚酸A对CFs在高浓度葡萄糖培养下细胞增殖的影响(ni=6;x±s)
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与正常对照组相比,高浓度葡萄糖可以明显降低G0+G1期CFs数量百分比(P < 0.01),明显增加S+G2+M期CFs数量百分比(P < 0.01)。与模型对照组相比,用药组能明显增加G0+G1期CFs数量百分比(P < 0.01),同时降低S+G2+M期CFs数量百分比(P < 0.01),且100 mg/L丹酚酸A的作用明显优于50 mg/L丹酚酸A(P < 0.01)(见图 5、表 3)。
分组 细胞周期(G0+G1)/% 细胞周期(S+G2+M)/% 正常对照组 97.131±0.530 2.869±0.530 模型对照组 88.987±0.929## 11.013±0.929## 100 mg/L丹酚酸A组 96.628±0.035** 3.372±0.035** 50 mg/L丹酚酸A组 92.533±0.728##**▲▲ 7.467±0.728##**▲▲ F 104.74 104.71 P < 0.01 < 0.01 MS组内 0.419 0.419 q检验:与正常对照组比较##P < 0.01;与模型对照组比较**P < 0.01;与100 mg/L丹酚酸A组比较▲▲P < 0.01 表 3 丹酚酸A对CFs在高浓度葡萄糖培养下细胞增殖周期的影响(ni=6;x±s)
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与正常对照组相比,高浓度葡萄糖可以明显诱导CFs分泌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原(P < 0.01)。与模型对照组相比,丹酚酸A各浓度组均能抑制CFs Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的分泌(P < 0.05~P < 0.01),西药对照组对Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原分泌没有明显影响(P>0.05)(见表 4)。
分组 Ⅰ型胶原/(pg/mL) Ⅲ型胶原/(ng/mL) 正常对照组 628.11±126.89 5.31±0.24 模型对照组 2 081.69±525.70## 10.00±0.96## 100 mg/L丹酚酸A组 1 359.87±59.15##** 6.18±1.48##** 50 mg/L丹酚酸A组 1 361.94±145.35##** 6.87±2.61** 25 mg/L丹酚酸A组 1 624.49±38.06##* 6.95±1.44** 西药对照组 1 834.19±168.65##▲■ 10.12±1.12##▲▲■ ■△△ F 17.46 9.37 P < 0.01 < 0.01 MS组内 57 829.716 2.217 q检验:与正常对照组比较##P < 0.01;与模型对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与100 mg/L丹酚酸A组比较▲P < 0.05,▲▲P < 0.01;与50 mg/L丹酚酸A组比较■P < 0.05,■■P < 0.01;与25 mg/L丹酚酸A组比较△△P < 0.01 表 4 丹酚酸A对CFs在高浓度葡萄糖培养下Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原分泌的影响(ni=6;x±s)
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与正常对照组相比,高浓度葡萄糖糖可以明显诱导CFs合成TGF-β1(P < 0.01)。与模型对照组相比,100、50 mg/L丹酚酸A及西药对照组能明显抑制TGF-β1的合成(P < 0.01)(见表 5)。
分组 TGF-β1/(pg/mL) 正常对照组 70.75±5.73 模型对照组 127.46±27.00## 100 mg/L丹酚酸A组 54.18±1.35** 50 mg/L丹酚酸A组 73.70±26.88** 25 mg/L丹酚酸A组 138.87±17.55##▲▲■■ 西药对照组 63.02±11.12**△△ F 20.07 P < 0.01 MS组内 319.632 q检验:与正常对照组比较##P < 0.01;与模型对照组比较**P < 0.01;与100 mg/L丹酚酸A组比较▲▲P < 0.01;与50 mg/L丹酚酸A组比较■■P < 0.01;与25 mg/L丹酚酸A组比较△△P < 0.01 表 5 丹酚酸A对CFs在高浓度葡萄糖培养下TGF-β1合成的影响(ni=6;x±s)
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与正常对照组相比,高浓度葡萄糖可以诱导CFs中β-catenin蛋白表达明显升高(P < 0.01),且明显下调p-GSK-3β的表达(P < 0.01)。与模型对照组比较,用药组均可明显抑制β-catenin的表达(P < 0.01),100 mg/L丹酚酸A可以上调p-GSK-3β的表达(P < 0.05)(见表 6)。
分组 β-catenin GSK-3β p-GSK-3β 正常对照组 0.203±0.037 0.311±0.015 0.255±0.023 模型对照组 0.493±0.039## 0.336±0.023 0.144±0.282## 100 mg/L丹酚酸A组 0.231±0.024** 0.313±0.028 0.222±0.088* 50 mg/L丹酚酸A组 0.259±0.038#** 0.330±0.016 0.191±0.046# 西药对照组 0.249±0.041#** 0.320±0.023 0.195±0.043# F 62.42 1.50 0.55 P < 0.01 >0.05 >0.05 MS组内 0.001 0.001 0.018 q检验:与正常对照组比较#P < 0.05,##P < 0.01;与模型对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与100 mg/L丹酚酸A组比较▲P < 0.05;与50 mg/L丹酚酸A组比较■P < 0.05;与25mg/L丹酚酸A组比较△ P < 0.05 表 6 丹酚酸A对CFs在高浓度葡萄糖培养下Wnt信号通路蛋白表达的影响(ni=6;x±s)
丹酚酸A对心肌成纤维细胞在高浓度葡萄糖刺激下Wnt信号通路的影响
Effects of salvianolic acid A on Wnt signaling pathway in cardiac fibroblasts stimulated by high concentration glucose
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摘要:
目的探讨丹酚酸A对高浓度葡萄糖诱导的心肌成纤维细胞(CFs)Wnt信号通路的影响及作用机制。 方法采用高浓度葡萄糖刺激CFs构建细胞增殖模型,以22 mg/L卡托普利为西药对照,不同浓度丹酚酸A处理CFs。MTT比色法检测细胞的增殖能力,流式细胞术分析细胞增殖周期,ELISA法测定细胞中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的生成和转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白的分泌,蛋白质印迹法检测β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白的表达水平。 结果干预24、48 h,与模型对照组相比,25、50、100 mg/L丹酚酸A均可明显抑制细胞增殖(P < 0.01)。与模型对照组相比,25、50、100 mg/L丹酚酸A均能抑制CFs Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的分泌(P < 0.05~P < 0.01);50、100 mg/L丹酚酸A均能明显抑制TGF-β1的合成及β-catenin的表达(P < 0.01);100 mg/L丹酚酸A可以上调p-GSK-3β的表达(P < 0.05)。 结论丹酚酸A可抑制高浓度葡萄糖诱导的CFs增殖、胶原蛋白分泌和TGF-β1的合成,其机制可能与抑制Wnt信号通路有关。 Abstract:ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of salvianolic acid A on Wnt signaling pathway in cardiac fibroblasts(CFs) induced by high concentration glucose. MethodsCell proliferation model was established by stimulating CFs with high concentration glucose, 22 mg/L captopril was used as western medicine control, and CFs were treated with different concentrations of salvianolic acid A.MTT assay was used to detect the proliferation ability of cells, flow cytometry was applied to analyze the cell proliferation cycle, and ELISA was employed to determine the production of type Ⅰ collagen, type Ⅲ collagen and protein secretion of transforming growth factor-β1(TGF-β1), and Western blotting was performed to detect the protein expression level of β-catenin, GSK-3β and p-GSK-3β. ResultsAfter treatment for 24 and 48 hours, compared with the model control group, 25, 50 and 100 mg/L salvianolic acid A could significantly inhibit cell proliferation(P < 0.01).Compared with the model control group, 25, 50 and 100 mg/L salvianolic acid A inhibited the secretion of type Ⅰ collagen and type Ⅲ collagen in CFs(P < 0.05 to P < 0.01);50 and 100 mg/L salvianolic acid A significantly inhibited the TGF-β1 production and β-catenin expression(P < 0.01);100 mg/L salvianolic acid A upregulated p-GSK-3β expression(P < 0.05). ConclusionsSalvianolic acid A can inhibit the proliferation, collagen secretion and TGF-β1 production of CFs induced by high concentration glucose, the mechanism of which may be related to the inhibition of Wnt signaling pathway. -
表 1 高浓度葡萄糖在不同时间点对CFs增殖活性的作用(ni=6;x±s)
分组 OD 24 h 48 h 正常对照组 0.118±0.006 0.142±0.018 模型对照组 0.138±0.010 0.166±0.015 t 4.20 2.51 P < 0.01 < 0.05 表 2 丹酚酸A对CFs在高浓度葡萄糖培养下细胞增殖的影响(ni=6;x±s)
分组 OD 24 h 48 h 正常对照组 0.118±0.006 0.142±0.018 模型对照组 0.138±0.010## 0.166±0.015## 高渗对照组 0.129±0.013 0.150±0.016 100 mg/L丹酚酸A组 0.102±0.002##** 0.114±0.012** 50 mg/L丹酚酸A组 0.118±0.006**▲▲ 0.119±0.008##** 25 mg/L丹酚酸A组 0.126±0.009#**▲▲ 0.131±0.008##**▲ 西药对照组 0.080±0.003##**▲▲■■△△ 0.068±0.002##**▲▲■ ■△△ F 36.25 38.88 P < 0.01 < 0.01 MS组内 0.000 0.000 q检验:与正常对照组比较#P < 0.05,##P < 0.01;与模型对照组比较**P < 0.01;与100 mg/L丹酚酸A组比较▲P < 0.05,▲▲P < 0.01;与50 mg/L丹酚酸A组比较■■P < 0.01;与25 mg/L丹酚酸A组比较△△P < 0.01 表 3 丹酚酸A对CFs在高浓度葡萄糖培养下细胞增殖周期的影响(ni=6;x±s)
分组 细胞周期(G0+G1)/% 细胞周期(S+G2+M)/% 正常对照组 97.131±0.530 2.869±0.530 模型对照组 88.987±0.929## 11.013±0.929## 100 mg/L丹酚酸A组 96.628±0.035** 3.372±0.035** 50 mg/L丹酚酸A组 92.533±0.728##**▲▲ 7.467±0.728##**▲▲ F 104.74 104.71 P < 0.01 < 0.01 MS组内 0.419 0.419 q检验:与正常对照组比较##P < 0.01;与模型对照组比较**P < 0.01;与100 mg/L丹酚酸A组比较▲▲P < 0.01 表 4 丹酚酸A对CFs在高浓度葡萄糖培养下Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原分泌的影响(ni=6;x±s)
分组 Ⅰ型胶原/(pg/mL) Ⅲ型胶原/(ng/mL) 正常对照组 628.11±126.89 5.31±0.24 模型对照组 2 081.69±525.70## 10.00±0.96## 100 mg/L丹酚酸A组 1 359.87±59.15##** 6.18±1.48##** 50 mg/L丹酚酸A组 1 361.94±145.35##** 6.87±2.61** 25 mg/L丹酚酸A组 1 624.49±38.06##* 6.95±1.44** 西药对照组 1 834.19±168.65##▲■ 10.12±1.12##▲▲■ ■△△ F 17.46 9.37 P < 0.01 < 0.01 MS组内 57 829.716 2.217 q检验:与正常对照组比较##P < 0.01;与模型对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与100 mg/L丹酚酸A组比较▲P < 0.05,▲▲P < 0.01;与50 mg/L丹酚酸A组比较■P < 0.05,■■P < 0.01;与25 mg/L丹酚酸A组比较△△P < 0.01 表 5 丹酚酸A对CFs在高浓度葡萄糖培养下TGF-β1合成的影响(ni=6;x±s)
分组 TGF-β1/(pg/mL) 正常对照组 70.75±5.73 模型对照组 127.46±27.00## 100 mg/L丹酚酸A组 54.18±1.35** 50 mg/L丹酚酸A组 73.70±26.88** 25 mg/L丹酚酸A组 138.87±17.55##▲▲■■ 西药对照组 63.02±11.12**△△ F 20.07 P < 0.01 MS组内 319.632 q检验:与正常对照组比较##P < 0.01;与模型对照组比较**P < 0.01;与100 mg/L丹酚酸A组比较▲▲P < 0.01;与50 mg/L丹酚酸A组比较■■P < 0.01;与25 mg/L丹酚酸A组比较△△P < 0.01 表 6 丹酚酸A对CFs在高浓度葡萄糖培养下Wnt信号通路蛋白表达的影响(ni=6;x±s)
分组 β-catenin GSK-3β p-GSK-3β 正常对照组 0.203±0.037 0.311±0.015 0.255±0.023 模型对照组 0.493±0.039## 0.336±0.023 0.144±0.282## 100 mg/L丹酚酸A组 0.231±0.024** 0.313±0.028 0.222±0.088* 50 mg/L丹酚酸A组 0.259±0.038#** 0.330±0.016 0.191±0.046# 西药对照组 0.249±0.041#** 0.320±0.023 0.195±0.043# F 62.42 1.50 0.55 P < 0.01 >0.05 >0.05 MS组内 0.001 0.001 0.018 q检验:与正常对照组比较#P < 0.05,##P < 0.01;与模型对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与100 mg/L丹酚酸A组比较▲P < 0.05;与50 mg/L丹酚酸A组比较■P < 0.05;与25mg/L丹酚酸A组比较△ P < 0.05 -
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