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膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤,居我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位。其发病率随年龄增长而增加,且男性膀胱癌发病率为女性的3~4倍[1]。而研究膀胱癌肿瘤浸润和转移的机制可能有助于确定膀胱癌治疗的潜在分子靶点。
肿瘤微环境是影响肿瘤进展和转移的主要因素。巨噬细胞是免疫相关基质细胞中重要的细胞之一,且系沟通天然免疫和适应性免疫的枢纽,在临床和实验研究中已经证实巨噬细胞能够促进肿瘤的发生和发展[2-3]。因此,肿瘤微环境中的巨噬细胞可以作为治疗干预的潜在靶标。
外泌体是肿瘤细胞与巨噬细胞之间相互作用的重要介导者[4]。外泌体是由多种类型细胞产生的微泡,其源自吞多泡体与质膜的融合。当它们释放到细胞外环境中时,外泌体可以与受体细胞结合并转移细胞细胞表面的分子。研究已经报道了多种生物分子,如脂质、蛋白质和核酸(包括mRNA、microRNA和DNA等)都存在于外泌体中,并且能够调节受体细胞的生物活性[5]。
肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis, TWEAK)是TNF超家族成员之一[6]。它是一种多功能细胞因子,能够与其同源受体成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14(fibroblast growth factor induces early reactive protein 14, Fn-14)结合,并影响许多类型癌细胞的生物学性质[6]。这表明TWEAK在调节免疫应答中起着重要作用,并且可能调控肿瘤浸润巨噬细胞的抗肿瘤效应[6-7]。
为探讨TWEAK在膀胱癌中的生物学功能,在本研究中,我们利用ATCC 5637膀胱癌细胞系检测源自肿瘤相关组织巨噬细胞(TMs)的外泌体对其发挥调节作用。现作报道。
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5637细胞内化PMA诱导THP-1单核细胞24 h后,圆形浮动的THP-1细胞变成了贴壁的扁平细胞(见图 1A)。巨噬细胞的两个公认的标志物,CD36和CD71的表达显著性增加(见图 1B);行马尔文纳米颗粒分析仪观察,其外泌体直径主要分布在92 nm左右(见图 2A和图 2B)。且激光共聚焦显微镜观察,其能够被ATCC 5637细胞内化(见图 3)。
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经miRNAs芯片检测,TWEAK处理TMs产生的外泌体中差异表达1 852种miRNAs,其中9种显著高表达miRNAs被罗列(见表 1);在获得TWEAK处理TMs产生的外泌体、GW4869预处理的TMs以及接受外泌体的受体细胞ATCC5637中,发现TWEAK处理后TMs及外泌体中miRNA-17-3P水平均高于未处理组,差异均有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01);而受体细胞同样在接受TWEAK处理组的外泌体后,miRNA-17-3P水平均高于未处理组,差异均有统计学意义(P < 0.01)(见表 2)。
miRNAs 倍数(x±s) t P miR-17-3p 9.35±1.85 — — miR-1539 5.90±0.60 3.07 < 0.05* miR-148a-3p 5.15±0.25 3.89 < 0.05* miR-625-5p 4.71±0.12 4.37 < 0.05* miR-4773 3.93±0.20 5.09 < 0.01* miR-140-5p 3.44±0.52 5.37 < 0.01* miR-181b-5p 2.65±0.45 6.09 < 0.01* miR-296-5p 2.55±0.28 6.30 < 0.01* miR-23a-5p 2.10±0.17 6.77 < 0.01* *示与miR-17-3p水平的比较 表 1 TWEAK诱导TMs产生的外泌体中高表达的部分miRNAs(n=3)
胞体 Tweak处理 倍数(x±s) t′ P 巨噬细胞 -
+1.55±0.25
6.01 ±1.206.28* < 0.01 巨噬细胞外泌体 -
+1.55±0.34
9.15 ±2.756.69 < 0.01 ATCC 5637细胞 -
+1.85±0.25
5.55 ±0.758.10 < 0.01 表 2 TWEAK诱导前后不同胞体内miRNA-17-3p水平的比较(n=3)
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通过Transwells实验验证,细胞数,未处理组高于PBS处理组,PBS处理组高于TWEAK处理组,差异均有统计学意义(P < 0.01),说明TWEAK诱导的TMs能够通过外泌体抑制ATCC5637细胞的转移(见表 3);而GW4869预处理能够抑制TWEAK激发巨噬细胞外泌体的释放;TWEAK预处理后的DMSO组和PBS组比较,2组ATCC5637细胞转移数目差异无统计学意义(P>0.05)(见表 4)。
分组 n 细胞数(x±s) PBS处理组 3 276.66±22.546 未处理组 3 297.00±12.12** TWEAK处理组 3 151.00±9.53**△△ F — 75.41 P — < 0.01 MS组内 — 248.769 q检验:与PBS处理组比较**P < 0.01;与未处理组比较△△P < 0.01 表 3 不同处理组巨噬细胞产生的外泌体对ATCC 5637细胞转移的影响
分组 n 细胞数(x±s) DMSO预处理巨噬细胞+PBS处理组 3 266.66±22.54 GW4869预处理巨噬细胞+TWEAK处理组 3 258.33±10.40 DMSO预处理巨噬细胞+ TWEAK处理组 3 154.33±14.01**△△ TWEAK预处理巨噬细胞+PBS处理组 3 151.66±17.55**△△ F — 42.91 P — < 0.01 MS组内 — 280.314 q检验:与DMSO预处理巨噬细胞+PBS处理组比较**P < 0.01;与GW4869预处理巨噬细胞+TWEAK处理组比较△△P < 0.01 表 4 TWEAK诱导的巨噬细胞产生的外泌体对ATCC 5637细胞转移的影响
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本研究分别使用不同处理的巨噬细胞(未处理组、TWEAK处理TMs组、TWEAK处理转染antagomiR-17-3p的TMs组及TWEAK处理转染antagomiR-NC的TMs组)分泌的外泌体与ATCC 5637细胞一起孵育,并且通过qRT-PCR和Transwell实验验证了通过干扰TMs中miRNA-17-3p的表达水平,从而影响受体细胞ATCC 5637中miRNA-17-3p的摄入水平(见表 5),进而影响ATCC 5637细胞转移(见表 6);通过Western blotting检测ATCC 5637细胞中EGFR、磷酸化AKT和ERK1/2的表达。结果表明,TWEAK刺激的巨噬细胞源性的外泌体在ATCC 5637细胞中均能抑制EGFR的表达,并抑制AKT和ERK1/2的磷酸化,但不影响总AKT和ERK1/2的表达(见图 4)。
分组 n 倍数(x±s) 未处理组 3 1.85±0.25 TWEAK处理组 3 6.00±1.00** TWEAK+antagomiR-17-3p处理组 3 1.90±0.40△△ TWEAK+antagomiR-NC处理组 3 6.35±1.05**## F — 31.92 P — < 0.01 MS组内 — 0.581 q检验:与未处理组比较**P < 0.01;与TWEAK处理组比较△△P < 0.01;与TWEAK+antagomiR-17-3p处理组比较##P < 0.01 表 5 不同处理组巨噬细胞外泌体作用于ATCC 5637细胞对其miRNA-17-3p的表达的影响
分组 n 细胞数(x±s) 未处理组 3 258.33±40.41 TWEAK处理组 3 136.66±16.07** TWEAK+antagomiR-17-3p处理组 3 253.66±49.60△△ TWEAK+antagomiR-NC处理组 3 146.66±15.27**## F — 11.46 P — < 0.01 MS组内 — 1 146.137 q检验:与未处理组比较**P < 0.01;与TWEAK处理组比较△△P < 0.01;与TWEAK+antagomiR-17-3p处理组比较##P < 0.01 表 6 不同处理组巨噬细胞外泌体作用于ATCC 5637细胞对其转移的影响
TWEAK诱导巨噬细胞源性外泌体miRNA抑制膀胱癌转移的研究
TWEAK-stimulated macrophages inhibit metastasis of bladder cancer via exosomal microRNAs
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摘要:
目的研究肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)诱导的肿瘤相关巨噬细胞(TMs)源性的外泌体对膀胱癌细胞的转移影响。 方法使用TWEAK刺激THP-1诱导分化的TMs,检测其外泌体的特征。并使用miRNAs芯片检测TWEAK诱导的TMs中miRNAs的水平变化;随后通过激光共聚焦显微镜观察外泌体被膀胱癌ATCC 5637细胞系内化以及内化后ATCC 5637细胞中miRNAs的水平;同时检测外泌体处理对细胞的侵袭功能的影响以及活化的信号通路。 结果TWEAK不仅增加巨噬细胞及其分泌的外泌体中miRNA-17-3p的水平,而且还导致受体ATCC 5637细胞中miRNA-17-3p的水平升高,这最终降低了表皮生长因子受体(epidermal growth factor recepto,EGFR)/苏氨酸激酶(threonine kinase,AKT)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK1)1/2途径的活性。在TMs中预先转染antagomiR-17-3p显著性降低了巨噬细胞、巨噬细胞分泌的外泌体和受体ATCC 5637细胞中miR-17-3p的水平,并伴随着ATCC 5637的转移增强,表明TMs源性的外泌体miR-17-3p参与了ATCC 5637细胞转移的调节,且通过抑制EGFR/AKT/ERK1/2途径得以实现。 结论TWEAK通过TMs将外泌体miRNAs转移到膀胱癌细胞中来抑制EGFR/AKT/ERK1/2途径,从而导致膀胱癌细胞的转移受到抑制。 -
关键词:
- 膀胱肿瘤 /
- 肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子 /
- 巨噬细胞 /
- 外泌体 /
- 微小RNA-17-3p /
- 转移
Abstract:ObjectiveTo explore the effect of exosomal-miRNAs from tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis(TWEAK)-stimulated macrophages(TMs) on the metastasis of bladder cancer cells. MethodsThe characteristics of exosomes derived from TWEAK-stimulated TMs, THP-1 induced differentiation were observed.Through the miRNAs microarray analysis, the expressions of miRNAs in exosomes derived from TMs treated with or without TWEAK were detected.The internalization of bladder cancer ATCC5637 cells and miRNAs after the internalization were detected by the laser scanning confocal microscope.The effect of exosome from TWEAK-stimulated TMs on metastasis and signal-pathway in ATCC5637 cells were detected. ResultsTWEAK not only increased the levels of miR-17-3p in TMs and the secreted exosomes, but also resulted in an elevated levels of miR-17-3p in recipient ATCC 5637 cells, which eventually reduced the activity of the EGFR/AKT/ERK 1/2 pathway.Pre-transfection of antagomiR-17-3p in TMs substantially decreased the levels of miR-17-3p in macrophages, its secreted exosomes and the recipient ATCC 5637 cells with a concomitant enhancement of ATCC 5637metastasis, suggesting an involvement of exosomal miR-17-3p from TMs in modulating the metastasis of ATCC 5637cells.And miR-17-3p inhibited the metastasis of bladder cancer cells via the EGFR/AKT/ERK 1/2 pathway. ConclusionsTWEAK transfers exosomal miRNAs to bladder cancer cells via TMs to inhibit the EGFR/AKT/ERK 1/2 pathway, resulting in the inhibition of metastasis in bladder cancer cells. -
表 1 TWEAK诱导TMs产生的外泌体中高表达的部分miRNAs(n=3)
miRNAs 倍数(x±s) t P miR-17-3p 9.35±1.85 — — miR-1539 5.90±0.60 3.07 < 0.05* miR-148a-3p 5.15±0.25 3.89 < 0.05* miR-625-5p 4.71±0.12 4.37 < 0.05* miR-4773 3.93±0.20 5.09 < 0.01* miR-140-5p 3.44±0.52 5.37 < 0.01* miR-181b-5p 2.65±0.45 6.09 < 0.01* miR-296-5p 2.55±0.28 6.30 < 0.01* miR-23a-5p 2.10±0.17 6.77 < 0.01* *示与miR-17-3p水平的比较 表 2 TWEAK诱导前后不同胞体内miRNA-17-3p水平的比较(n=3)
胞体 Tweak处理 倍数(x±s) t′ P 巨噬细胞 -
+1.55±0.25
6.01 ±1.206.28* < 0.01 巨噬细胞外泌体 -
+1.55±0.34
9.15 ±2.756.69 < 0.01 ATCC 5637细胞 -
+1.85±0.25
5.55 ±0.758.10 < 0.01 表 3 不同处理组巨噬细胞产生的外泌体对ATCC 5637细胞转移的影响
分组 n 细胞数(x±s) PBS处理组 3 276.66±22.546 未处理组 3 297.00±12.12** TWEAK处理组 3 151.00±9.53**△△ F — 75.41 P — < 0.01 MS组内 — 248.769 q检验:与PBS处理组比较**P < 0.01;与未处理组比较△△P < 0.01 表 4 TWEAK诱导的巨噬细胞产生的外泌体对ATCC 5637细胞转移的影响
分组 n 细胞数(x±s) DMSO预处理巨噬细胞+PBS处理组 3 266.66±22.54 GW4869预处理巨噬细胞+TWEAK处理组 3 258.33±10.40 DMSO预处理巨噬细胞+ TWEAK处理组 3 154.33±14.01**△△ TWEAK预处理巨噬细胞+PBS处理组 3 151.66±17.55**△△ F — 42.91 P — < 0.01 MS组内 — 280.314 q检验:与DMSO预处理巨噬细胞+PBS处理组比较**P < 0.01;与GW4869预处理巨噬细胞+TWEAK处理组比较△△P < 0.01 表 5 不同处理组巨噬细胞外泌体作用于ATCC 5637细胞对其miRNA-17-3p的表达的影响
分组 n 倍数(x±s) 未处理组 3 1.85±0.25 TWEAK处理组 3 6.00±1.00** TWEAK+antagomiR-17-3p处理组 3 1.90±0.40△△ TWEAK+antagomiR-NC处理组 3 6.35±1.05**## F — 31.92 P — < 0.01 MS组内 — 0.581 q检验:与未处理组比较**P < 0.01;与TWEAK处理组比较△△P < 0.01;与TWEAK+antagomiR-17-3p处理组比较##P < 0.01 表 6 不同处理组巨噬细胞外泌体作用于ATCC 5637细胞对其转移的影响
分组 n 细胞数(x±s) 未处理组 3 258.33±40.41 TWEAK处理组 3 136.66±16.07** TWEAK+antagomiR-17-3p处理组 3 253.66±49.60△△ TWEAK+antagomiR-NC处理组 3 146.66±15.27**## F — 11.46 P — < 0.01 MS组内 — 1 146.137 q检验:与未处理组比较**P < 0.01;与TWEAK处理组比较△△P < 0.01;与TWEAK+antagomiR-17-3p处理组比较##P < 0.01 -
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