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长链非编码RNA LINC00319在肝细胞癌中表达上调并促进肝癌细胞迁移和侵袭

杨楠 陈天翔 刘润坤 牛永申 刘志奎

引用本文:
Citation:

长链非编码RNA LINC00319在肝细胞癌中表达上调并促进肝癌细胞迁移和侵袭

    作者简介: 杨楠(1989-), 女, 住院医师
    通讯作者: 刘志奎, liuzk0319@xjtufh.edu.cn
  • 基金项目:

    西安交通大学第一附属医院基金项目 2020QN-10

    西安交通大学第一附属医院基金项目 2019QN-24

  • 中图分类号: R735.7

Observation of the high-expression of long-chain non-coding RNA LINC00319 and promotion of cell migration and invasion in hepatocellular carcinoma

    Corresponding author: LIU Zhi-kui, liuzk0319@xjtufh.edu.cn
  • CLC number: R735.7

  • 摘要: 目的探讨LINC00319在肝细胞癌(HCC)组织中的表达、临床意义及可能的分子机制。方法实时定量PCR检测LINC00319在HCC及癌旁组织中的表达水平,并分析LINC00319表达水平与临床病理特征的关系及生存率。Transwell实验检测LINC00319对HCC细胞的侵袭及迁移作用,Western blotting法检测LINC00319对HCC细胞EMT的影响。结果LINC00319在肝癌组织中表达水平明显高于相应癌旁组织(P < 0.01);肝癌组织LINC00319高表达与TNM分期及血管侵犯相关(P < 0.01和P < 0.05);高表达LINC00319病人5年生存率明显高于低表达组(P < 0.01);LINC00319下调可显著抑制HCC细胞的侵袭及迁移(P < 0.01);LINC00319下调抑制HCC细胞EMT的发生(P < 0.01)。结论LINC00319在肝癌组织中表达升高,其高表达与肝癌恶性临床病理特征有关,LINC00319能够通过调控HCC细胞EMT促进其侵袭和迁移。
  • 图 1  不同LINC00319表达水平肝癌病人总体生存率情况

    表 1  LINC00319的表达与肝癌临床病理特征关系[n;构成比(%)]

    临床病理 n LINC00319 χ2 P
    高表达组 低表达组
    年龄/岁
       < 60
      ≥60
    64
    33
    31(48.44)
    18(54.54)
    33(51.56)
    15(45.46)
    0.33 >0.05
    性别
      男
      女
    80
    17
    40(50.00)
    9(52.94)
    40(50.00)
    8(47.06)
    0.05 >0.05
    肿瘤大小/cm
       < 5
      ≥5
    68
    29
    30(44.12)
    19(65.52)
    38(55.88)
    10(34.48)
    3.72 >0.05
    肿瘤数量
      单发
      多发
    84
    13
    40(47.62)
    9(69.23)
    44(52.38)
    4(30.77)
    2.10 >0.05
    病理分级
      Ⅰ+Ⅱ
      Ⅲ+Ⅳ
    23
    74
    9(39.13)
    40(54.05)
    14(60.87)
    34(45.95)
    1.56 >0.05
    TNM分期
      Ⅰ+Ⅱ
      Ⅲ+Ⅳ
    72
    25
    30(41.67)
    19(76.00)
    42(58.33)
    6(24.00)
    8.75 < 0.01
    血管侵犯
      是
      否
    16
    81
    12(75.00)
    37(45.68)
    4(25.00)
    44(54.32)
    4.60 < 0.05
    甲胎蛋白/(ng/mL)
       < 400
      ≥400
    22
    75
    13(59.09)
    36(48.00)
    9(40.91)
    39(52.00)
    0.84 >0.05
    乙肝表面抗原
      阳性
      阴性
    89
    8
    45(50.56)
    4(50.00)
    44(49.44)
    4(50.00)
    0.01 >0.05
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    表 2  LINC00319在不同肝癌细胞系中的表达水平(x±s)

    细胞系 n LINC00319表达水平 F P MS组内
    L02 3 1.00±0.02 22.34 < 0.01 0.001
    Hep3B 3 1.89±0.12*
    SMMC-7721
    Huh7
    3
    3
    1.96±0.11*
    2.56 ±0.15**△#
    MHCC-97H 3 3.23±0.12**△△##▲
    HCCLM3 3 3.65±0.13**△△##▲▲
    q检验:与L02比较*P < 0.05,**P < 0.01;与Hep3B比较△P < 0.05,△△P < 0.01;与SMMC-7721比较#P < 0.05,##P < 0.01;与Huh7比较▲P < 0.05,▲▲P < 0.01
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    表 3  各组细胞中LINC00319表达水平(x±s)

    分组 n LINC00319/MHCC-97H LINC00319/HCCLM3
    si-Control 3 1.00±0.05 1.00±0.03
    siRNA#1 3 0.32±0.05** 0.30±0.05**
    siRNA#2 3 0.23±0.04** 0.28±0.04**
    F 52.26 35.67
    P < 0.01 < 0.01
    MS组内 0.003 0.001
    q检验:与si-Control组比较**P < 0.01
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    表 4  siRNA干扰LINC00319表达水平后细胞迁移及侵袭能力(x±s)

    分组 n MHCC-97H HCCLM3
    迁移细胞数 侵袭细胞 迁移细胞数 侵袭细胞数
    si-Control 3 155.23±14.35 95.63±9.56 172.39±14.83 89.64±8.37
    siRNA#1 3 65.43±8.25** 42.38±5.26** 58.43±8.75** 41.35±5.59**
    siRNA#2 3 43.23±7.14** 38.65±4.15** 45.28±7.24** 35.62±4.25**
    F 54.08 59.64 93.45 55.04
    P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
    MS组内 0.002 0.001 0.001 0.001
    q检验:与si-Control组比较** P < 0.01
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    表 5  siRNA干扰LINC00319表达水平后EMT相关蛋白的表达量(x±s)

    分组 n MHCC-97H HCCLM3
    E-cadherin N-cadherin Vimentin E-cadherin N-cadherin Vimentin
    si-Control 3 1.00±0.02 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.02 1.00±0.04 1.00±0.02
    siRNA#1 3 2.53±0.12** 0.37±0.05** 0.29±0.05** 2.60±0.12** 0.42±0.05** 0.31±0.05**
    siRNA#2 3 2.10±0.11** 0.26±0.04** 0.23±0.04** 2.21±0.11** 0.31±0.04** 0.38±0.04**
    F 54.08 65.34 89.36 67.38 46.35 56.89
    P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
    MS组内 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001
    q检验:与si-Control组比较**P < 0.01
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-02-26
  • 录用日期:  2020-11-23
  • 刊出日期:  2022-02-15

长链非编码RNA LINC00319在肝细胞癌中表达上调并促进肝癌细胞迁移和侵袭

    通讯作者: 刘志奎, liuzk0319@xjtufh.edu.cn
    作者简介: 杨楠(1989-), 女, 住院医师
  • 1. 西安交通大学第一附属医院 感染科, 陕西 西安 710061
  • 2. 西安交通大学第一附属医院 肝胆外科, 陕西 西安 710061
基金项目:  西安交通大学第一附属医院基金项目 2020QN-10西安交通大学第一附属医院基金项目 2019QN-24

摘要: 目的探讨LINC00319在肝细胞癌(HCC)组织中的表达、临床意义及可能的分子机制。方法实时定量PCR检测LINC00319在HCC及癌旁组织中的表达水平,并分析LINC00319表达水平与临床病理特征的关系及生存率。Transwell实验检测LINC00319对HCC细胞的侵袭及迁移作用,Western blotting法检测LINC00319对HCC细胞EMT的影响。结果LINC00319在肝癌组织中表达水平明显高于相应癌旁组织(P < 0.01);肝癌组织LINC00319高表达与TNM分期及血管侵犯相关(P < 0.01和P < 0.05);高表达LINC00319病人5年生存率明显高于低表达组(P < 0.01);LINC00319下调可显著抑制HCC细胞的侵袭及迁移(P < 0.01);LINC00319下调抑制HCC细胞EMT的发生(P < 0.01)。结论LINC00319在肝癌组织中表达升高,其高表达与肝癌恶性临床病理特征有关,LINC00319能够通过调控HCC细胞EMT促进其侵袭和迁移。

English Abstract

  • 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种常见的消化道恶性肿瘤之一,其死亡率高居恶性肿瘤第3位[1]。但因其起病隐匿,早期多无明显临床症状,大部分病人在初次诊断时已为晚期,失去了手术机会。近年来,尽管在手术治疗、放化疗以及靶向治疗等方面取得很大进展,但由于其高侵袭性、转移、复发等因素,HCC病人预后仍相对较差[2-3]。因此,探究肝癌侵袭转移的机制,确定有效的作用靶点或预后标志物成为目前HCC研究的重要方向。长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA, LncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的不编码蛋白质的RNA[4]。LncRNA可以通过调控肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡、血管生成等方面参与肿瘤的发生、发展过程[5-6]。LINC00319是肿瘤相关lncRNA的一种[7-8]。LINC00319通过分子海绵吸附miR-335-5p上调ADCY3从而促进胃癌细胞的肿瘤生长和远处转移[9],通过调控miR-32的表达促进肺癌的增殖和侵袭[10],通过调控miR-3127-5p/RPP25轴促进宫颈癌细胞迁移、侵袭和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)[11]。但是,LINC00319在肝癌中的表达水平及其临床意义仍不清楚。因此,本研究旨在探讨LINC00319在肝细胞癌组织中的表达及临床意义,及其对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响。

    • 收集并筛选2013年在我院肝胆外科手术治疗后经病理证实的HCC病人。所有入组病人均签署知情同意书。病人术前均未接受放疗、化疗等其他辅助治疗。癌旁组织为距肿瘤边缘 < 2 cm的肝组织,所有组织为术后获得的新鲜标本组织,组织获得后立即转移至液氮。

    • 人肝癌细胞株和正常永生化肝细胞株(L02)细胞购自中国科学院上海生命研究所。DMEM细胞培养基、胰蛋白酶购自Hyclone公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;E-cahderin、N-cadherin、Vimentin和GAPDH购自Cell signaling technology公司;脂质体(Lipofectamine 2000)购自Invitrogen公司;LINC00319 siRNA及对照siRNA购自上海吉凯公司;Transwell小室购自Millipore公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物技术研究所,ECL化学发光试剂盒购自Milipore公司。

    • 参照按TRIZOL说明书提取总RNA。紫外分光光度计检测提取RNA的浓度及纯度。采用Takara公司的逆转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。qRT-PCR以GAPDH为内参对照,采用2-ΔΔCt法分析定量PCR的结果。

    • 按照RIPA(强)试剂盒说明书提取相应细胞内的蛋白,经BCA蛋白定量后。用SDS-PAGE制10%分离胶后,每组样品加20 μg,经湿转转膜仪将蛋白移至PVDF膜上。50 g/L脱脂牛奶封闭2 h,加PBS稀释的一抗(1:1 000),把抗体孵育盒放入4 ℃冰箱孵育最少12 h;TBST洗膜3次,分别加HRP标记的抗兔或抗小鼠二抗(1:10 000),室温孵育2 h;TBST洗膜3次,在用超敏发光试剂盒显影并进行半定量分析。

    • 取转染48 h后的HCC细胞,重悬细胞调整细胞数为1×106个/毫升。50 mg/L Matrigel胶1:8稀释液包被Transwell小室(孔径8 μm)底部(侵袭实验铺胶、迁移实验未铺胶)。取各组细胞悬液200 μL加入Transwell小室,向24孔板下室加650 μL 10% FBS的完全培养基。每组重复3个样本。常规培养24 h后取出小室,用PBS冲洗小室,4%多聚甲醛固定,PBS冲洗,1 g/L结晶紫染色,用棉棒擦去小室内层细胞,在倒置显微镜下观察移至微孔膜下层的细胞数,每个样本随机选取8个200倍视野求细胞计数平均数。

    • 采用t检验、单因素方差分析和q检验、χ2检验和Kaplan-Meier曲线。

    • 肝癌组织中的LINC00319在肝癌组织中的表达(0.57±0.02)明显高于癌旁组织(0.27±0.01)(t=15.02,P < 0.01)。

    • 将LINC00319按中位数分为LINC高表达组(n=49)和低表达组(n=48)。结果显示LINC00319高表达与TNM分期(Ⅲ+Ⅳ)和血管侵犯均相关(P < 0.01和P < 0.05)(见表 1)。

      临床病理 n LINC00319 χ2 P
      高表达组 低表达组
      年龄/岁
         < 60
        ≥60
      64
      33
      31(48.44)
      18(54.54)
      33(51.56)
      15(45.46)
      0.33 >0.05
      性别
        男
        女
      80
      17
      40(50.00)
      9(52.94)
      40(50.00)
      8(47.06)
      0.05 >0.05
      肿瘤大小/cm
         < 5
        ≥5
      68
      29
      30(44.12)
      19(65.52)
      38(55.88)
      10(34.48)
      3.72 >0.05
      肿瘤数量
        单发
        多发
      84
      13
      40(47.62)
      9(69.23)
      44(52.38)
      4(30.77)
      2.10 >0.05
      病理分级
        Ⅰ+Ⅱ
        Ⅲ+Ⅳ
      23
      74
      9(39.13)
      40(54.05)
      14(60.87)
      34(45.95)
      1.56 >0.05
      TNM分期
        Ⅰ+Ⅱ
        Ⅲ+Ⅳ
      72
      25
      30(41.67)
      19(76.00)
      42(58.33)
      6(24.00)
      8.75 < 0.01
      血管侵犯
        是
        否
      16
      81
      12(75.00)
      37(45.68)
      4(25.00)
      44(54.32)
      4.60 < 0.05
      甲胎蛋白/(ng/mL)
         < 400
        ≥400
      22
      75
      13(59.09)
      36(48.00)
      9(40.91)
      39(52.00)
      0.84 >0.05
      乙肝表面抗原
        阳性
        阴性
      89
      8
      45(50.56)
      4(50.00)
      44(49.44)
      4(50.00)
      0.01 >0.05

      表 1  LINC00319的表达与肝癌临床病理特征关系[n;构成比(%)]

    • 随访发现,LINC00319高表达病人的5年生存率(20.41%)明显低于LINC00319低表达组病人(52.08%)(χ2=11.59,P < 0.01)(见图 1)。

      图  1  不同LINC00319表达水平肝癌病人总体生存率情况

    • LINC00319在肝癌细胞系中的表达均高于L02正常肝细胞系(P < 0.05~P < 0.01),且在MHCC-97H和HCCLM3细胞系中表达最高(P < 0.01)(见表 2)。基于以上结果,选择MHCC-97H和HCCLM3细胞系为后续敲低实验研究对象,研究LINC00319对肝癌细胞系生物学功能的影响。

      细胞系 n LINC00319表达水平 F P MS组内
      L02 3 1.00±0.02 22.34 < 0.01 0.001
      Hep3B 3 1.89±0.12*
      SMMC-7721
      Huh7
      3
      3
      1.96±0.11*
      2.56 ±0.15**△#
      MHCC-97H 3 3.23±0.12**△△##▲
      HCCLM3 3 3.65±0.13**△△##▲▲
      q检验:与L02比较*P < 0.05,**P < 0.01;与Hep3B比较△P < 0.05,△△P < 0.01;与SMMC-7721比较#P < 0.05,##P < 0.01;与Huh7比较▲P < 0.05,▲▲P < 0.01

      表 2  LINC00319在不同肝癌细胞系中的表达水平(x±s)

    • 将si-Control、siRNA#1、siRNA#2分别转染MHCC-97H和HCCLM3细胞系干扰LINC00319的表达48 h后,用qRT-PCR检测干扰效率。结果显示,与si-Control对照组相比,siRNA#1、siRNA#2均能抑制MHCC-97H和HCCLM3细胞中LINC00319的相对表达量(P < 0.01)(见表 3)。提示该两条siRNA可用于后续实验对LINC00319的敲低。

      分组 n LINC00319/MHCC-97H LINC00319/HCCLM3
      si-Control 3 1.00±0.05 1.00±0.03
      siRNA#1 3 0.32±0.05** 0.30±0.05**
      siRNA#2 3 0.23±0.04** 0.28±0.04**
      F 52.26 35.67
      P < 0.01 < 0.01
      MS组内 0.003 0.001
      q检验:与si-Control组比较**P < 0.01

      表 3  各组细胞中LINC00319表达水平(x±s)

    • 利用未铺胶的Transwell实验证实,敲低LINC00319能抑制MHCC-97H和HCCLM3细胞的迁移能力和侵袭能力(P < 0.01)(见表 4)。

      分组 n MHCC-97H HCCLM3
      迁移细胞数 侵袭细胞 迁移细胞数 侵袭细胞数
      si-Control 3 155.23±14.35 95.63±9.56 172.39±14.83 89.64±8.37
      siRNA#1 3 65.43±8.25** 42.38±5.26** 58.43±8.75** 41.35±5.59**
      siRNA#2 3 43.23±7.14** 38.65±4.15** 45.28±7.24** 35.62±4.25**
      F 54.08 59.64 93.45 55.04
      P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
      MS组内 0.002 0.001 0.001 0.001
      q检验:与si-Control组比较** P < 0.01

      表 4  siRNA干扰LINC00319表达水平后细胞迁移及侵袭能力(x±s)

    • 敲低LINC00319能够促进上皮表型标志物E-cadherin的表达(P < 0.01),而抑制间质表型标志物N-cadherin和Vimentin的表达(P < 0.01)(见表 5)。说明LINC00319能够调控肝癌细胞EMT的发生。

      分组 n MHCC-97H HCCLM3
      E-cadherin N-cadherin Vimentin E-cadherin N-cadherin Vimentin
      si-Control 3 1.00±0.02 1.00±0.03 1.00±0.02 1.00±0.02 1.00±0.04 1.00±0.02
      siRNA#1 3 2.53±0.12** 0.37±0.05** 0.29±0.05** 2.60±0.12** 0.42±0.05** 0.31±0.05**
      siRNA#2 3 2.10±0.11** 0.26±0.04** 0.23±0.04** 2.21±0.11** 0.31±0.04** 0.38±0.04**
      F 54.08 65.34 89.36 67.38 46.35 56.89
      P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
      MS组内 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001
      q检验:与si-Control组比较**P < 0.01

      表 5  siRNA干扰LINC00319表达水平后EMT相关蛋白的表达量(x±s)

    • 肝癌细胞侵袭和远处转移能力强是HCC病人预后差的重要因素。因此研究HCC细胞侵袭转移的分子网络机制对寻找新的治疗靶点降低HCC转移有重要意义。LncRNA因本身缺乏开放阅读框架无明显蛋白质编码功能[12]。近年来,越来越多研究证实lncRNA能够在肿瘤发生、发展中起重要角色[13]。LINC00319作为新的lncRNA,在鼻咽癌、膀胱癌、胶质瘤等中均异常高表达[14-19]。本研究证实LINC00319在肝癌组织中异常高表达,且高表达LINC00319与肿瘤TNM分期、血管侵犯的不良临床病理特征相关。通过随访,发现LINC00319高表达病人的5年生存率明显低于低表达者,提示LINC00319的高表达与HCC病人不良预后相关。说明LINC00319在HCC发生、发展过程中发挥重要作用。

      在细胞学水平上,本研究发现LINC003319在肝癌细胞系中的表达明显高于正常肝细胞系。在体外实验中我们选择LINC00319相对高表达细胞系MHCC-97H和HCCLM3细胞作为研究模型,利用siRNA特异性下调LINC00319的表达。发现LINC00319的下调能够显著抑制MHCC-97H和HCCLM3细胞的侵袭和迁移能力。另外,EMT是细胞形态学上从上皮表型转化为间质表型的过程,伴随着细胞极性消失,运动能力增强、黏附能力减弱等现象,是肿瘤转移的关键步骤[20]。本研究发现,LINC00319下调后HCC细胞上皮分子标志物E-cadherin表达上调,而间质表型标志物N-cadherin和Vimentin表达下调。这说明LINC00319能够调控HCC细胞EMT的发生,这与YANG等[11]在宫颈癌中研究一致。以上结果表明,在HCC中LINC00319可能通过调控EMT发生促进肝癌侵袭转移。

      综上,本研究证实LINC00319在HCC中异常高表达,并且与HCC的不良临床病理特征及预后密切相关。可能通过调控EMT发生促进肝癌侵袭转移发挥致癌基因的作用。这表明,LINC00319可能成为肝癌诊断的生物标志物和防治靶点。

参考文献 (20)

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