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肠道作为人体巨大的细菌库，其微生态系统复杂多变，通过肝肠轴，肠道与肝脏在解剖和功能上都存在密切的关系[1]。而目前从整合肝肠病学[2-3]的观点看，肠道微生态的失衡可以通过免疫、代谢及营养等多种途径影响肝脏病变的形成和发展，也可能是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)致癌的协同因素，即通过“肝肠轴”促进肝细胞癌变的局部微环境的形成，进而促进肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发展。对于病人而言，慢性肝病不仅会造成肠道黏膜的损伤，还会导致肠道内部菌群失调及其代谢异常[4-5]。肝动脉化疗栓塞术(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)被认为是不可切除肝癌的首选治疗方案[6-7]。但是TACE治疗肝癌后是否可以改善肠道菌群紊乱状态，肠道微生态与TACE疗效和病人生存获益之间是否存在关联尚不清楚，本研究观察TACE治疗肝癌后，病人血清中内毒素(lipopolysaccharides, LPS)、TOLL样受体4(toll-like receptor 4，TLR4)的变化情况，以及TACE术对肠道菌群的影响，现作报道。
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选取2017年3-6月中国科学技术大学附属第一医院初诊为HCC的11例病人相关资料，其中男9例，女2例; Child A级8例，B级3例; 肿瘤中位直径约7.2 cm。纳入标准：(1)HCC的诊断依据我国卫生部《原发性肝癌诊疗规范(2011年版)》的诊断标准[8]；(2)充分的肝功能储备；(3)无腹水或少量腹水；(4)病人体力状态ECOP评分≤2分；(5)胆红素≤3 mg/dL；(6)血清白蛋白≥2 mg/dL；(7)无其他脏器重要疾病。排除标准：(1)曾经接受过任何TACE或经导管动脉栓塞术(TAE)；(2)曾经接受过外科分流手术或经颈静脉肝内门-腔静脉分流术；(3)影像学显示肝脏弥漫性疾病或门脉主干癌栓；(4)病人抗生素治疗中或结束不满1周；(5)病程中服用微生态制剂相关治疗。
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采用改良Seldinger法穿刺股动脉，先对腹腔干及肠系膜上动脉进行造影，通过造影来明确病人病灶的数量、位置及供给肿瘤的动脉。用微导管超选择插入肝左、右动脉及其远段的肿瘤供血动脉，尽可能地避开正常肝组织供血支，先灌注洛铂50~100 mg，再用碘油2~30 mL+吡柔比星20 mg混合乳剂栓塞肿瘤血管，碘油量视肿瘤大小和碘油沉积情况而定，但是不超过30 mL，最后用适量PVA颗粒栓塞[至血流停止，复查数字减影血管造影(DSA)肿瘤染色基本消失]。术后常规给予保肝、抑酸等治疗3~5 d。
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观察病人TACE术前、术后DSA情况及术后1个月影像表现，采用增强CT或MR检测瘤体大小，近期疗效鉴定采用改良的实体瘤治疗疗效评价标准(mRECIST标准)[9]，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、病情稳定(SD)和进展(PD)，客观有效率(ORR)=(CR+PR)/总例数×100%，疾病控制率(DCR)=(CR+PR+SD)/总例数×100%。于术前1 d、术后1周和术后1个月，空腹采血及采取病人粪便，血液标本置离心机中离心留取血清(3 000 r/min，离心10 min)且分装，与粪便标本同放置-80 ℃环境保存待测。之后成批检测LPS、TLR4。LPS测定采用鳖试剂三肽显色基质偶氮法，试剂盒由中国科学技术大学附属第一医院医院检验科提供。TLR4检测采用ELISA方法，试剂盒为上海时代新光生物技术有限公司生产。肠道菌谱由微基生物科技(上海)有限公司通过二代高通量测序检测，粪便样本中微生物DNA的提取采用QIAamp DNA Stool Mini Kit试剂盒(QIAGEN, Hilden, Germany)。选取16S rDNA的V4-V5区序列进行高通量测序分析。经过相应的处理从而得到优化序列，之后进行OTU(operational taxonomic unit) 聚类(UPARSE software)，基于分类学信息，在门、纲、目、科、属、种分类水平上进行群落结构的统计分析。在上述分析的基础上，进行一系列群落结构和系统发育等的统计学和可视化分析。利用mothur(Version 1.33.3)进行Alpha多样性分析(Chao、Ace等物种丰富度统计，Shannon、Simpson等物种多样性统计)、VENN图，Beta多样性分析[(un)Weighted UniFrac分析]，利用R语言(Version 3.2.3)进行Heatmap分析、PCA分析，CCA/RDA分析则采用CANOCO(Version 4.54)。
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采用重复测量方差分析和Bonferroni两两比较。使用实时PCR将肠道菌群进行量化处理，细菌群落的多样性指数分析使用MIXED过程与R编程工具(3.3.0版)。
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术前增强CT或MR提示肝内单发或多发强化灶，DSA示肿瘤染色明显，富血供(8例)和中等血供(3例)，化疗栓塞术后再次DSA，肿瘤染色基本消失(见图 1)。TACE术后1个月复查增强CT，肿瘤CR 2例，PR 6例，SD 3例，PD 0例，ORR为72.7%，DCR为100.0%。
图 1 原发性肝癌TACE治疗术前、后病灶情况
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病人术前1 d、术后1周、术后1个月时血清内LPS、TLR4含量差异均有统计学意义(P < 0.01)，Bonferroni两两比较分析发现，LPS含量术前1 d低于术后1周及术后1个月，TLR4含量术后1个月低于术前1 d及术后1周，差异均有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01)(见表 1)。
分组 n LPS/(Eu/mL) TLR4/(ng/mL) 术前1 d 11 15.28±8.83 10.56±1.32 术后1周 11 17.89±9.98* 16.65±2.51** 术后1个月 11 74.55±7.15**△△ 9.09±1.18*△△ F — 21.23 51.208 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 12.057 13.235 Bonferroni两两比较：与术前1 d组比较*P < 0.05, **P < 0.01；与术后1周组比较△△P < 0.01 表 1 不同时间段病人血清LPS、TLR4含量比较(x±s)
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分别检测11位病人3个不同时间点粪便样本，比较不同时间点病人大便样品中群落的丰富度。结果发现病人TACE术后1周肠道菌群丰度稍上升，但术后1个月时其丰度下降，并低于术前1 d肠道菌群水平。而基于分类学信息，在门、纲、目、科、属、(或种)各个分类水平上进行群落结构的统计分析, 发现病人术后1周内拟杆菌等益生菌丰度比例下降，肠杆菌等变形菌门类潜在致病菌明显增加，随后1个月益生菌丰度增加，高于术后1周及术前1 d，同时致病菌丰度下降，低于术后1周及1个月。随后进一步通过单因素方差分析，显示拟杆菌、毛螺菌等益生菌丰度高于术前1 d及术后1周，且链球菌、乳杆菌属低于术前1 d及术后1周，且3组比较差异有统计学意义。同样进行LDA EffectSize组间群落差异分析显示拟杆菌、毛螺菌属、梭形芽孢杆菌等益生菌与术前1 d、术后1周在诸水平中有明显差异，从LDA条形图中可以看出益生菌在该组病人肠道菌群中占主要影响因素(见表 2、图 2)。
分组 n Ace Chao Shannon Simpson PD-whole sobs 术前1 d 11 173.42±102.79 174.16±11.31 2.74±0.24 0.17±0.04 14.38±0.75 146.18±10.79 术后1周 11 154.23±154.91 142.78±4.01 2.71±0.15 0.13±0.03 12.49±0.92 116.50±8.39 术后1个月 11 183.75±138.19 174.46±14.78 2.68±0.17 0.16±0.09 14.74±0.94 143.08±10.77 F — 2.12 2.51 0.02 0.29 1.91 2.41 P — >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 MS组内 — 115.365 123.371 1.862 0.093 10.542 102.113 表 2 组间的Alpha多样性ACE指数差异分析的检验(x±s)
图 2 LDA EffectSize组间群落差异分析
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正常人体生理状态下，菌群、宿主与环境之间保持动态平衡状态。但当长期慢性肝病状态下，由于肠道菌群过度生长，肠黏膜屏障通透性改变，肠道菌群易位淤积的大量内毒素作为病原体相关分子模式(PAMPs)经门静脉系统进入肝脏，通过TLR4激活固有免疫系统，更进一步加重肝脏的炎症病态。80%~90%的HCC来源于肝脏慢性炎症、肝硬化[10]，但在肝肠循环中肠道微生态如何对HCC产生影响尚不清楚。近年来，大量的研究也致力于信号传导通路连接着肠道菌群与HCC。2010年YU等[10]通过动物实验证实肠道内毒素促进HCC的发生，他们发现骨髓来源的肝脏Kuffer细胞是LPS的作用靶点，Kuffer细胞产生促炎调节因子肿瘤坏死因子α与IL-6通过LPS-TLR4信号通路产生了高分泌活化的促肿瘤细胞因子，激活了癌前肝细胞增殖。同样DAPITO等[12]运用二乙基亚硝胺(DEN) /四氯化碳(CCl4)的小鼠模型进一步阐释了肠道菌群和TLR4在HCC发生中的特有作用，同时也证实了应用抗生素清除肠道菌群可使高达90%HCC的发生进展受到抑制。上述实验结果又与WANG等[13]关于LPS诱导TLR4在原发性肝癌中转导癌细胞存活和增殖的研究结果相符。
在肝肠循环中，HCC治疗后是否会由于肿瘤得到有效控制，进而对肠道菌群的变化有影响呢？本研究发现HCC病人行TACE术后1个月，肠道菌群的丰度有所下降，与术前、术后1周比较均有统计学意义，而在门、纲、目、科、属、种各分类水平上进行群落结构统计分析及单因素方差分析显示拟杆菌、毛螺菌属等益生菌在TACE术后1周时丰度稍有下降，1个月后又明显增加，而肠杆菌、链球菌等潜在致病菌丰度明显下降，与病人术前、术后1周相比，诸类菌种丰度均有统计学意义，同时LEFSE分析指出TACE术后1个月拟杆菌科、毛螺菌属、梭形状的芽孢杆菌科等益生菌起重要影响作用。由此可见肝癌病人行TACE术后，其肠道菌群失调短暂加重后，继有效改善，益生菌丰度及其影响作用有所提高。那么肝癌行TACE术是如何影响肠道微生态，具体作用机制可能如下：(1)肝癌病人常伴有肝硬化-门脉高压[14]，TACE术能控制肿瘤恶化，进而有效改善肝功能，降低门脉高压，减缓因门脉高压所致的肠壁淤血、水肿，加快小肠蠕动，改善肠道运动障碍，避免细菌过度繁殖。(2)当癌细胞在肝内有效被TACE术抑制后，肝细胞的胆汁排泄增加，肝脏分泌的结合型胆汁酸对肠道内的细菌有抑制作用，而游离型胆汁酸在肠道内可通过调节pH值而起到调节肠道的细菌群平衡的作用，从而间接影响到肠道菌群平衡[15]。(3)肝癌TACE术后，肝脏正常组织代偿能力增加，肝脏清除内毒素能力得以有效提高，减轻因为内毒素血症所导致的肠黏膜的炎性反应，进一步改善肠内部的微循环，能够有效促进已经损伤的肠黏膜的修复，减少肠壁细菌的移位[16-17]。
目前关于肠道菌群对肝癌的研究主要集中在LPS-TLR4，更多是PAMPs或DAMPs以及其他TLRs在肝肠轴中的作用。研究[10-19]发现，肠道细菌移位至肝脏部位后，其代谢产物LPS通过激活原位肝细胞中的TLR4，介导炎症反应发生，进而促进了肝癌的发展。而伴随着肝癌TACE术后肠道菌群的改变，肝肠轴间的信号传导是否发生了相应的变化，本研究进一步对11例病人血清中LPS、TLR4进行检测，发现LPS及TLR4在术后1周有所升高，但在术后1个月明显下降且低于术前，差异有统计学意义。由此可见，血清LPS及TLR4含量随着肠道菌群变化而随之波动。当肠道菌群失调状况改善时，内环境中LPS及TLR4含量减少，意味着肠道微生态平衡的改善可以调节体内肿瘤发展的信号通路，降低TLR4表达，减少细胞因子及炎症介质的释放导致的肝细胞慢性炎症损伤，抑制癌基因的激活，发挥与原有治疗手段协同的抗肿瘤效果。
综上所述，肝癌TACE治疗不仅能够阻断肿瘤血管，促使肿瘤细胞凋亡，同时改善肝功能后还可以调整肠道菌群，减少内毒素水平，有利于病人的预后。目前已有肠道微生态疗法对肝癌介入治疗后作用的研究，但其临床疗效不够明确及稳定，本研究通过高质高效的高通量测序宏基因技术，为微生态制剂的筛选提供了细致的菌群分析结果。进一步加强了临床对于微生态制剂菌种的筛选。
肝细胞性肝癌TACE后血清内毒素、TOLL样受体4和肠道微生态改变的实验观察
Experimental observation on the changes of serum lipopolysaccharides, Toll-like receptor 4 and intestinal microecology in hepatocellular carcinoma after TACE
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摘要:
目的观察肝细胞性肝癌病人经动脉化疗栓塞术（TACE）后血清内毒素（lipopolysaccharides，LPS）、TOLL样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）及肠道微生态的改变。 方法收集初诊为原发性肝癌病人11例，均采取常规TACE治疗，治疗前后不加服任何影响肠道微生态变化的药物制剂，观察此组病人术前1 d、术后1周及术后1个月病人LPS、TLR4含量以及肠道菌群变化情况。 结果病人术前1 d、术后1周、术后1个月时血清内LPS、TLR4含量差异均有统计学意义（P < 0.01），Bonferroni两两比较分析发现，LPS含量术前1 d低于术后1周及术后1个月，TLR4含量术后1个月低于术前1 d及术后1周，差异均有统计学意义（P < 0.05~P < 0.01）。病人术后1周时肠道菌群丰度稍升高，而随后1个月其丰度下降，且低于术前1 d的水平，通过单因素方差分析显示拟杆菌、毛螺菌等益生菌丰度高于术前1 d及术后1周，且链球菌、乳杆菌等潜在致病菌属低于术前1 d及术后1周，且3组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论原发性肝癌行TACE治疗后，通过肝肠轴能显著促进肠道微生态平衡，同时肠道微生物稳态不仅能作为肝癌TACE术后评价的指标，还能促进肝癌预后。 Abstract:ObjectiveTo observe the changes of serum lipopolysaccharides(LPS), Toll-like receptor 4(TLR4) and intestinal microecology in patients with hepatocellular carcinoma(HCC) after transcatheter arterial chemoembolization(TACE). MethodsEleven patients with HCC were treated with TACE, and no drug was added to affect the intestinal microecological changes before and after treatment.The serum levels of LPS and TLR4 and intestinal microecological changes were obserevd before 1 day of operation and after 1 week and 1 month of operation. ResultsThe differences of the serum levels of LPS and TLR4 in patients among before 1 day of operation and after 1 week and 1 month of operation were statistically significant(P < 0.01).The results of Bonferroni's pairwise comparative analysis showed that the level of LPS before 1 day of operation was lower than that after 1 week and 1 month of operation, and the level of TLR4 after 1 month of operation was lower than that before 1 day of operation and after 1 week of operation(P < 0.05 to P < 0.01).The results of ACE index difference analysis showed that the abundance of intestinal flora increased slightly at 1 week after operation, and then decreased in the following 1 month, which was lower than that before 1 day of operation.The results of One-way ANOVA analysis showed that the abundance of probiotic bacteria such as Bacteroides and Lachnospira were higher than that before 1 day of operation and after 1 week of operation, the abundance of Streptococcus and Lactobacillus were lower than that before 1 day of operation and after 1 week of operation, and the differences of which among three groups were statistically significant(P < 0.05). ConclusionsAfter the treatment of primary liver cancer with TACE, the intestinal microecological balance can be significantly promoted through the hepato-intestinal axis.Meanwhile, the intestinal microbial homeostasis can not only be used as an indicator for the evaluation of liver cancer after TACE, but also promote the prognosis of liver cancer. -
表 1 不同时间段病人血清LPS、TLR4含量比较(x±s)
分组 n LPS/(Eu/mL) TLR4/(ng/mL) 术前1 d 11 15.28±8.83 10.56±1.32 术后1周 11 17.89±9.98* 16.65±2.51** 术后1个月 11 74.55±7.15**△△ 9.09±1.18*△△ F — 21.23 51.208 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 12.057 13.235 Bonferroni两两比较：与术前1 d组比较*P < 0.05, **P < 0.01；与术后1周组比较△△P < 0.01 
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表 2 组间的Alpha多样性ACE指数差异分析的检验(x±s)
分组 n Ace Chao Shannon Simpson PD-whole sobs 术前1 d 11 173.42±102.79 174.16±11.31 2.74±0.24 0.17±0.04 14.38±0.75 146.18±10.79 术后1周 11 154.23±154.91 142.78±4.01 2.71±0.15 0.13±0.03 12.49±0.92 116.50±8.39 术后1个月 11 183.75±138.19 174.46±14.78 2.68±0.17 0.16±0.09 14.74±0.94 143.08±10.77 F — 2.12 2.51 0.02 0.29 1.91 2.41 P — >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 MS组内 — 115.365 123.371 1.862 0.093 10.542 102.113
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