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积雪草苷通过Vimentin/NLRP3通路诱导鼻咽癌细胞凋亡研究

李林 付盈盈 司应明

引用本文:
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积雪草苷通过Vimentin/NLRP3通路诱导鼻咽癌细胞凋亡研究

    作者简介: 李林(1974-),女,副主任药师
  • 中图分类号: R739.63

Asiaticoside induces apoptosis in nasopharyngeal carcinoma cells through Vimentin/NLRP3 pathway

  • CLC number: R739.63

  • 摘要: 目的研究积雪草苷对人鼻咽癌CNE-2细胞生长、凋亡及凋亡通路的影响。方法体外培养CNE-2细胞,将不同浓度的积雪草苷作用于CNE-2细胞,MTT和CCK-8法检测积雪草苷对细胞生长的影响;流式细胞术检测对细胞凋亡的影响;Western blotting检测Vimentin、NLRP3、Bcl-2和Caspase-3表达;ELISA法检测TNF-α和IL-1β含量。结果MTT和CCK-8结果显示,积雪草苷可浓度依赖性地抑制CNE-2细胞的生长;流式细胞仪检测结果显示,积雪草苷可浓度依赖性地促进CNE-2细胞凋亡;Western blotting结果显示,积雪草苷促进Caspase-3蛋白的表达,抑制Vimentin、NLRP3和Bcl-2的表达;ELISA法结果显示,积雪草苷可浓度依赖性地降低TNF-α和IL-1β含量。结论积雪草苷可显著促进人鼻咽癌细胞株CNE-2细胞凋亡,其机制可能与下调Vimentin,NLRP3蛋白的表达来实现的。
  • 表 1  MTT法检测积雪草苷对CNE-2细胞增殖的抑制作用(ni=6;x±s)

    分组 A值 抑制率/% F P MS组内
    空白对照组 0.75±0.07 32.00 < 0.05 0.005
    积雪草苷20 μmol/L组 0.60±0.06** 19.82
    积雪草苷40 μmol/L组 0.48 ±0.08**# 36.07
    积雪草苷60 μmol/L组 0.39±0.07**▲ 48.02
    q检验:与空白对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与20 μmol/L组比较#P < 0.05;与40 μmol/L组比较▲P < 0.05
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    表 2  CCK-8法检测积雪草苷对CNE-2细胞增殖的抑制作用(ni=6;x±s)

    分组 A值 抑制率/% F P MS组内
    空白对照组 0.76±0.08 25.43 < 0.05 0.006
    积雪草苷20 μmol/L组 0.61±0.06** 19.78
    积雪草苷40 μmol/L组 0.49 ±0.09**# 35.15
    积雪草苷60 μmol/L组 0.38±0.08**▲ 49.36
    q检验:与空白对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与20 μmol/L组比较#P < 0.05;与40 μmol/L组比较▲P < 0.05
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    表 3  积雪草苷对CNE-2细胞凋亡的影响(ni=3;x±s)

    分组 凋亡率/% F P MS组内
    空白对照组 8.25±0.70 25.86 < 0.05 15.570
    积雪草苷20 μmol/L组 21.42±3.09**
    积雪草苷40 μmol/L组 33.32 ±5.05**##
    积雪草苷60 μmol/L组 37.49±5.96**##▲▲
    q检验:与空白对照组比较**P < 0.01;与20 μmol/L组比较##P < 0.01;与40 μmol/L组比较▲▲P < 0.01
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    表 4  积雪草苷对CNE-2细胞凋亡相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)

    分组 蛋白表达水平
    Vimentin NLRP-3 Caspase-3 Bcl-2
    空白对照组 1.66±0.15 1.32±0.12 0.61±0.09 1.24±0.09
    积雪草苷20 μmol/L组 1.38±0.08* 1.05±0.12* 0.84±0.11* 1.03±0.09*
    积雪草苷40 μmol/L组 0.98±0.14**# 0.73±0.14**# 1.19±0.19** 0.62±0.10**##
    积雪草苷60 μmol/L组 0.67±0.17** 0.59±0.19** 1.27±0.17** 0.56±0.11**
          F 45.53 12.26 20.85 13.44
          P < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05
          MS组内 0.010 0.020 0.010 0.020
    q检验:与空白对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01;与20 μmol/L组比较#P < 0.05,##P < 0.01
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    表 5  积雪草苷对CNE-2细胞TNF-α和IL-1β表达的影响(ni=3;x±s)

    分组 蛋白表达水平
    TNF-α IL-1β
    空白对照组 114.69±9.07 122.40±11.91
    积雪草苷20 μmol/L组 83.39±8.41* 88.92±11.82*
    积雪草苷40 μmol/L组 68.39±9.22** 73.55±11.55**
    积雪草苷60 μmol/L组 48.91±17.48** 63.92±13.56**
          F 62.32 17.24
          P < 0.05 < 0.05
          MS组内 37.870 114.840
    q检验:与空白对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-08-30
  • 录用日期:  2020-12-30
  • 刊出日期:  2022-03-15

积雪草苷通过Vimentin/NLRP3通路诱导鼻咽癌细胞凋亡研究

    作者简介: 李林(1974-),女,副主任药师
  • 湖北省襄阳市中医医院 药学部,441000

摘要: 目的研究积雪草苷对人鼻咽癌CNE-2细胞生长、凋亡及凋亡通路的影响。方法体外培养CNE-2细胞,将不同浓度的积雪草苷作用于CNE-2细胞,MTT和CCK-8法检测积雪草苷对细胞生长的影响;流式细胞术检测对细胞凋亡的影响;Western blotting检测Vimentin、NLRP3、Bcl-2和Caspase-3表达;ELISA法检测TNF-α和IL-1β含量。结果MTT和CCK-8结果显示,积雪草苷可浓度依赖性地抑制CNE-2细胞的生长;流式细胞仪检测结果显示,积雪草苷可浓度依赖性地促进CNE-2细胞凋亡;Western blotting结果显示,积雪草苷促进Caspase-3蛋白的表达,抑制Vimentin、NLRP3和Bcl-2的表达;ELISA法结果显示,积雪草苷可浓度依赖性地降低TNF-α和IL-1β含量。结论积雪草苷可显著促进人鼻咽癌细胞株CNE-2细胞凋亡,其机制可能与下调Vimentin,NLRP3蛋白的表达来实现的。

English Abstract

  • 鼻咽癌(NPC)在我国南方地区是非常常见的头颈部位的恶性肿瘤[1],发生于鼻咽部黏膜上皮,病理类型以低分化鳞状细胞癌多见,通常具有发病部位解剖结构较为复杂、易向周围组织转移的缺点。流行病学数据统计,我国每年新发病例约有84 400例,死亡51 600例[2]。虽然目前联合放化疗的方式治疗鼻咽癌已取得一定疗效,但仍有40%以上的病人治疗失败[3],并且有较为严重的不良反应,而与传统化疗药物相比,中草药不良反应小,价格也相对低廉。故利用传统医学探究有效的抗癌成分,参与治疗鼻咽癌,可提高临床效果。

    积雪草又叫雷公根、酒杯菜等,是伞形科积雪草属植物Centella asiatica(L.)Urb.的干燥全草,是我国最早应用的中药之一,最早载于《神农本草经》[4],可清热利湿,解毒消肿,常用于治疗湿热黄疸、暑湿腹泻、痈肿疮疡、跌倒损伤等[5]。积雪草苷是积雪草中提取分离出的一种五环三萜皂苷类化合物,是中药积雪草产生药理作用的主要活性成分,可抑制皮肤瘢痕形成[6],防治肾间质纤维化[7],促进肿瘤细胞凋亡和抑制其迁移[8]等。但关于是否具有抗鼻咽癌的作用及作用机制报道较少。本研究将积雪草苷作用于鼻咽癌CNE-2细胞,观察其对CNE-2细胞的影响及机制。

    • 胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司);RPMI 1640培养粉(Gibco公司);MTT、胰蛋白酶和磷酸盐缓冲液(PBS,Sigma公司);CCK-8试剂盒(美国BD Biosciences公司);DFC4255C型倒置荧光显微镜(Leica公司);兔抗人GAPDH、Vimentin、NLRP3、Caspase-3、Bcl-2和辣根过氧化物酶标记鼠抗兔(Santa Cruz公司);Multiskan MK3型酶联免疫检测仪(芬兰Lab-system公司);2406-2型CO2培养箱(美国SHEL-LAB公司);流式细胞仪FACS Calibur(Becton Dickinson公司);YJ-872医用超净工作台(吴江市空气净化设备厂);其他试剂均为国产分析纯。

    • 人鼻咽癌CNE-2细胞株(购自上海中科院细胞库)加入RPMI 1640培养液(含有体积分数为10%的胎牛血清以及100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素)中,放入37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养,每隔1 d用胰酶进行消化后更换培养液再进行培养,待细胞增殖至对数生长期时取出进行以下实验研究。

    • 取对数生长期的CNE-2细胞,用RPMI 1640培养液对细胞进行稀释,使终浓度为5×104个/mL,按照每孔100 μL接种于96孔培养板,放入37 ℃、5% CO2培养箱恒温培养24 h后取出,将板上各孔随机分为7组,给药组分别加入积雪草苷(20、40、60 μmol/L),空白对照组加入等量RPMI 1640培养液,每个浓度设置6个复孔,加好后放入培养箱中继续培养24 h,各孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL,再次培养4 h后弃掉各孔上清液,再加入100 μL DMSO,避光条件下震荡使颜色均匀,将酶标仪设置波长为490 nm,检测各孔的吸光度值(A值),并按公式计算细胞增殖抑制率:细胞增殖抑制率=[(空白对照组A值-药物组A值)/空白对照组A值]×100%。

    • 取出对数生长期的CNE-2细胞,用RPMI 1640培养液将细胞稀释成浓度为5×104个/mL,按照每孔100 μL接种于96孔板,培养箱中培养24 h后取出,将板上各孔随机分组,药物组分别加入积雪草苷(20、40、60 μmol/L),空白对照组加入等量RPMI 1640培养液,每个浓度设置6个复孔。培养60 h后各孔均加入CCK-8 10 μL混匀,继续培养2 h后,将酶标仪设置波长在450 nm处检测各孔A值,并按照2.2公式计算CNE-2细胞增殖抑制率。

    • 将处于对数期生长的CNE-2细胞,用RPMI 1640培养液稀释后调整浓度为3×105个/mL接种于6孔板,每孔2 mL,培养24 h后取出,将各孔随机分组。药物组分别加入终浓度为20、40和60 μmol/L的积雪草苷,空白对照组加入等量培养液,每个浓度设置3个复孔。于培养箱中孵育48 h后收集各组细胞,用预冷的PBS洗涤细胞3次后,置于柠檬酸缓冲液中1 h以上,调整细胞浓度至3×105个/mL左右,用流式细胞术检测细胞凋亡率。

    • 将对数生长期的CNE-2细胞,加入RPMI 1640培养液调整浓度为3×105个/mL,接种于6孔板,并设只加培养液的空白对照组,药物组分别加入积雪草苷(20、40、60 μmol/L)。将处理后的各组细胞裂解液分别收集,并进行BCA蛋白定量,采用SDS-PAGE凝胶电泳和转膜。用含有5%脱脂奶粉的TBST室温条件下封闭PVDF膜2 h,将封闭液弃去,用TBST洗涤3次,每次5 min,加入一抗Vimentin(1∶300)、NLRP3(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Caspase-3(1∶1 000)、GAPDH(1∶500),在4 ℃孵育过夜。次日TBST再次漂洗,加入辣根过氧化酶标记的二抗稀释液培养30 min(1∶1 000,常温),再次用TBST进行漂洗,并ECL化学发光、显影,最后采用ImageQuant软件扫描分析相应灰度值,计算各组蛋白表达水平。

    • 细胞培养、分组及给药同2.5,按照ELISA试剂盒说明书将已处理好的CNE-2细胞按每孔100 μL加入96孔板,盖上封纸后将板放入37 ℃培养箱中2 h,取出移弃上清液,各孔加稀释后的试剂A 100 μL,封口,继续培养1 h后移弃液体,并用洗脱液350 μL洗板3次,每次清洗时清洗液需在板中停留1~2 min,吸干液体,各孔再加入稀释后的试剂B 100 μL,盖上封纸后再次培养30 min,液体吸出,按上述方法用洗脱液350 μL将板清洗4次,吸干液体,各孔加入底物溶液90 μL,封口后培养20 min,再于每孔中加入终止液50 μL使反应终止,最后将酶标仪调整波长至450 nm处测各孔A值,并分别计算TNF-α和IL-1β表达水平。

    • 采用方差分析和q检验。

    • 同时采用MTT和CCK-8两种方法检测积雪草苷对CNE-2细胞生长的影响,结果表明,两种方法检测结果一致,积雪草苷体外可浓度依赖性的抑制CNE-2细胞的生长,各组细胞生长抑制率与空白对照组相比差异均具有统计学意义(P < 0.05)(见表 12)。

      分组 A值 抑制率/% F P MS组内
      空白对照组 0.75±0.07 32.00 < 0.05 0.005
      积雪草苷20 μmol/L组 0.60±0.06** 19.82
      积雪草苷40 μmol/L组 0.48 ±0.08**# 36.07
      积雪草苷60 μmol/L组 0.39±0.07**▲ 48.02
      q检验:与空白对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与20 μmol/L组比较#P < 0.05;与40 μmol/L组比较▲P < 0.05

      表 1  MTT法检测积雪草苷对CNE-2细胞增殖的抑制作用(ni=6;x±s)

      分组 A值 抑制率/% F P MS组内
      空白对照组 0.76±0.08 25.43 < 0.05 0.006
      积雪草苷20 μmol/L组 0.61±0.06** 19.78
      积雪草苷40 μmol/L组 0.49 ±0.09**# 35.15
      积雪草苷60 μmol/L组 0.38±0.08**▲ 49.36
      q检验:与空白对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与20 μmol/L组比较#P < 0.05;与40 μmol/L组比较▲P < 0.05

      表 2  CCK-8法检测积雪草苷对CNE-2细胞增殖的抑制作用(ni=6;x±s)

    • 与空白对照组相比,三个浓度的积雪草苷作用于CNE-2细胞后,细胞凋亡率均明显升高(P < 0.01),且随着积雪草苷浓度的增加,细胞凋亡率也逐渐增加,并出现凋亡典型性特征峰(见表 3)。

      分组 凋亡率/% F P MS组内
      空白对照组 8.25±0.70 25.86 < 0.05 15.570
      积雪草苷20 μmol/L组 21.42±3.09**
      积雪草苷40 μmol/L组 33.32 ±5.05**##
      积雪草苷60 μmol/L组 37.49±5.96**##▲▲
      q检验:与空白对照组比较**P < 0.01;与20 μmol/L组比较##P < 0.01;与40 μmol/L组比较▲▲P < 0.01

      表 3  积雪草苷对CNE-2细胞凋亡的影响(ni=3;x±s)

    • 积雪草苷三个剂量均可浓度依赖性的促进Caspase-3的表达,与空白对照组相比差异具有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01);而Vimentin、NLRP3和Bcl-2蛋白表达低于对照组(P < 0.05~P < 0.01)(见表 4)。

      分组 蛋白表达水平
      Vimentin NLRP-3 Caspase-3 Bcl-2
      空白对照组 1.66±0.15 1.32±0.12 0.61±0.09 1.24±0.09
      积雪草苷20 μmol/L组 1.38±0.08* 1.05±0.12* 0.84±0.11* 1.03±0.09*
      积雪草苷40 μmol/L组 0.98±0.14**# 0.73±0.14**# 1.19±0.19** 0.62±0.10**##
      积雪草苷60 μmol/L组 0.67±0.17** 0.59±0.19** 1.27±0.17** 0.56±0.11**
            F 45.53 12.26 20.85 13.44
            P < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05
            MS组内 0.010 0.020 0.010 0.020
      q检验:与空白对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01;与20 μmol/L组比较#P < 0.05,##P < 0.01

      表 4  积雪草苷对CNE-2细胞凋亡相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)

    • 积雪草苷三个剂量均可浓度依赖性抑制NLRP3下游炎症因子TNF-α和IL-1β的表达,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01);不同剂量组相比差异均有统计学意义(P < 0.05)(见表 5)。

      分组 蛋白表达水平
      TNF-α IL-1β
      空白对照组 114.69±9.07 122.40±11.91
      积雪草苷20 μmol/L组 83.39±8.41* 88.92±11.82*
      积雪草苷40 μmol/L组 68.39±9.22** 73.55±11.55**
      积雪草苷60 μmol/L组 48.91±17.48** 63.92±13.56**
            F 62.32 17.24
            P < 0.05 < 0.05
            MS组内 37.870 114.840
      q检验:与空白对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01

      表 5  积雪草苷对CNE-2细胞TNF-α和IL-1β表达的影响(ni=3;x±s)

    • 近年来鼻咽癌等呼吸系统疾病的发病率呈上升趋势,对人类健康造成严重威胁,所以迫切需要安全有效的治疗鼻咽癌的方法。而中药提取物因具有广谱和低毒的抗肿瘤作用一直广受关注。积雪草是比较常见的中药材,含有多种三萜类化合物,比如积雪草苷、羟基积雪苷、积雪草酸、羟基积雪草酸等,而最新的药理研究表明,积雪草苷是积雪草发挥药理活性的主要有效成分,能通过降低血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的表达而诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡[9];通过升高Bax和降低Bcl-2促进卵巢癌细胞A2780凋亡来抑制肿瘤生长[10];并通过与长春新碱发挥协同作用而达到有效的抗肿瘤效果[11]。本研究同时采用MTT和CCK-8法检测积雪草苷(20、40、60 μmol/L)对鼻咽癌CNE-2细胞生长的影响,结果显示,两种方法一致表明积雪草苷体外能浓度依赖性抑制CNE-2细胞的生长;而流式细胞仪检测发现,积雪草苷在20~60 μmol/L的浓度范围内随着剂量的增加,细胞凋亡率逐渐增加。

      炎症反应是机体受到各种外界刺激时所产生的一种自我保护性的免疫反应。已证实炎症参与并影响多种疾病包括肿瘤的发生和发展,是恶性肿瘤转移的主要驱动力[12],而炎症小体则在炎症驱使的肿瘤发展进程中始终扮演着重要角色[13]。炎症小体是一种调控IL-1β产生的参与机体免疫功能的多蛋白复合体,目前已发现有多种炎症小体,而研究的最多和了解最透彻的是NLRP3炎症小体,它是主要的炎症调控元件。炎症小体在识别PAMP、DAMP活化后,启动免疫反应,产生具有生物活性的促炎性细胞因子IL-1β、IL-18,并通过下游的信号转导通路,产生一系列的炎症和免疫反应,参与肿瘤的发生发展过程。张奇瑜等[14]研究报道,辣椒碱能促进ROS表达从而活化NLRP3来诱发炎症反应,进而诱导结肠癌细胞发生转移。

      最新研究发现,Vimentin也可能是调控NLRP3的关键因子,它是一种在间质中表达的Ⅲ型中间丝蛋白,是维持细胞骨架的重要结构,可调节细胞功能,在组织损伤和纤维化过程中发挥重要作用,在许多恶性肿瘤中均发现有高表达状态的Vimentin[15],并且其还是一种重要的信号分子和转录因子,能通过提高肿瘤细胞对基底膜组织的浸润能力,参与肿瘤的发生和转移。Caspase-3在细胞凋亡信号传导通路中发挥关键作用,内在和外在等多种凋亡通路均可导致该分子的活化并诱发细胞走向凋亡,进而阻碍肿瘤细胞增殖。Caspase-3还可通过降低细胞中Vimentin蛋白的含量,进而发挥抑制肝癌细胞生长的作用并阻碍其侵袭[16]。周雅青等[17]证实通过降低Vimentin蛋白的表达可有效抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。Bcl-2是细胞凋亡的抑凋亡因子,在肿瘤细胞中维持线粒体膜电位和抑制线粒体依赖性凋亡,并抑制Caspase的激活以阻止细胞凋亡。

      本研究采用不同浓度的积雪草苷作用于鼻咽癌CNE-2细胞,结果表明各组Vimentin、NLRP3和Bcl-2的含量均随着药物浓度的增加而逐渐下降,而Caspase-3的含量则逐渐增加。为了进一步验证Vimentin对NLRP3蛋白是否具有激活作用,我们又采用ELISA法检测了NLRP3下游炎症因子TNF-α和IL-1β的表达。TNF-α和IL-1β同属于致炎因子,均参与机体内炎症反应。TNF-α主要由单核细胞和巨噬细胞产生的单核因子,可以由肿瘤细胞、肿瘤微环境中浸润的免疫细胞和基质细胞产生。研究表明TNF-α在炎症反应、免疫机制、细胞稳态及肿瘤细胞的增殖、侵袭、和血管形成等过程中均发挥着重要作用,可促进肿瘤的分化和进展。IL-1β是一种多肽,参与人体组织的破坏、水肿以及肿瘤等多种病理过程,可以在NLRP3炎性小体激活下释放。本实验结果表明,TNF-α和IL-1β的表达均下调,提示积雪草苷能降低鼻咽癌CNE-2细胞的增殖能力,并诱导其凋亡,其作用机制与Vimentin激活NLRP3炎症通路有关。

      综上所述,积雪草苷体外可浓度依赖性地抑制鼻咽癌CNE-2细胞生长,并诱导其凋亡,其抗鼻咽癌的作用机制可能与调节Vimentin/ NLRP3信号通路有关。但是其在体内的作用尚不了解,尚需进一步研究动物实验,以明确积雪草苷治疗鼻咽癌的作用机制,为临床应用奠定基础。

参考文献 (17)

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