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鼻咽癌(NPC)在我国南方地区是非常常见的头颈部位的恶性肿瘤[1],发生于鼻咽部黏膜上皮,病理类型以低分化鳞状细胞癌多见,通常具有发病部位解剖结构较为复杂、易向周围组织转移的缺点。流行病学数据统计,我国每年新发病例约有84 400例,死亡51 600例[2]。虽然目前联合放化疗的方式治疗鼻咽癌已取得一定疗效,但仍有40%以上的病人治疗失败[3],并且有较为严重的不良反应,而与传统化疗药物相比,中草药不良反应小,价格也相对低廉。故利用传统医学探究有效的抗癌成分,参与治疗鼻咽癌,可提高临床效果。
积雪草又叫雷公根、酒杯菜等,是伞形科积雪草属植物Centella asiatica(L.)Urb.的干燥全草,是我国最早应用的中药之一,最早载于《神农本草经》[4],可清热利湿,解毒消肿,常用于治疗湿热黄疸、暑湿腹泻、痈肿疮疡、跌倒损伤等[5]。积雪草苷是积雪草中提取分离出的一种五环三萜皂苷类化合物,是中药积雪草产生药理作用的主要活性成分,可抑制皮肤瘢痕形成[6],防治肾间质纤维化[7],促进肿瘤细胞凋亡和抑制其迁移[8]等。但关于是否具有抗鼻咽癌的作用及作用机制报道较少。本研究将积雪草苷作用于鼻咽癌CNE-2细胞,观察其对CNE-2细胞的影响及机制。
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同时采用MTT和CCK-8两种方法检测积雪草苷对CNE-2细胞生长的影响,结果表明,两种方法检测结果一致,积雪草苷体外可浓度依赖性的抑制CNE-2细胞的生长,各组细胞生长抑制率与空白对照组相比差异均具有统计学意义(P < 0.05)(见表 1、2)。
分组 A值 抑制率/% F P MS组内 空白对照组 0.75±0.07 — 32.00 < 0.05 0.005 积雪草苷20 μmol/L组 0.60±0.06** 19.82 积雪草苷40 μmol/L组 0.48 ±0.08**# 36.07 积雪草苷60 μmol/L组 0.39±0.07**▲ 48.02 q检验:与空白对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与20 μmol/L组比较#P < 0.05;与40 μmol/L组比较▲P < 0.05 表 1 MTT法检测积雪草苷对CNE-2细胞增殖的抑制作用(ni=6;x±s)
分组 A值 抑制率/% F P MS组内 空白对照组 0.76±0.08 — 25.43 < 0.05 0.006 积雪草苷20 μmol/L组 0.61±0.06** 19.78 积雪草苷40 μmol/L组 0.49 ±0.09**# 35.15 积雪草苷60 μmol/L组 0.38±0.08**▲ 49.36 q检验:与空白对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与20 μmol/L组比较#P < 0.05;与40 μmol/L组比较▲P < 0.05 表 2 CCK-8法检测积雪草苷对CNE-2细胞增殖的抑制作用(ni=6;x±s)
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与空白对照组相比,三个浓度的积雪草苷作用于CNE-2细胞后,细胞凋亡率均明显升高(P < 0.01),且随着积雪草苷浓度的增加,细胞凋亡率也逐渐增加,并出现凋亡典型性特征峰(见表 3)。
分组 凋亡率/% F P MS组内 空白对照组 8.25±0.70 25.86 < 0.05 15.570 积雪草苷20 μmol/L组 21.42±3.09** 积雪草苷40 μmol/L组 33.32 ±5.05**## 积雪草苷60 μmol/L组 37.49±5.96**##▲▲ q检验:与空白对照组比较**P < 0.01;与20 μmol/L组比较##P < 0.01;与40 μmol/L组比较▲▲P < 0.01 表 3 积雪草苷对CNE-2细胞凋亡的影响(ni=3;x±s)
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积雪草苷三个剂量均可浓度依赖性的促进Caspase-3的表达,与空白对照组相比差异具有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01);而Vimentin、NLRP3和Bcl-2蛋白表达低于对照组(P < 0.05~P < 0.01)(见表 4)。
分组 蛋白表达水平 Vimentin NLRP-3 Caspase-3 Bcl-2 空白对照组 1.66±0.15 1.32±0.12 0.61±0.09 1.24±0.09 积雪草苷20 μmol/L组 1.38±0.08* 1.05±0.12* 0.84±0.11* 1.03±0.09* 积雪草苷40 μmol/L组 0.98±0.14**# 0.73±0.14**# 1.19±0.19** 0.62±0.10**## 积雪草苷60 μmol/L组 0.67±0.17** 0.59±0.19** 1.27±0.17** 0.56±0.11** F 45.53 12.26 20.85 13.44 P < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 MS组内 0.010 0.020 0.010 0.020 q检验:与空白对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01;与20 μmol/L组比较#P < 0.05,##P < 0.01 表 4 积雪草苷对CNE-2细胞凋亡相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)
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积雪草苷三个剂量均可浓度依赖性抑制NLRP3下游炎症因子TNF-α和IL-1β的表达,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01);不同剂量组相比差异均有统计学意义(P < 0.05)(见表 5)。
分组 蛋白表达水平 TNF-α IL-1β 空白对照组 114.69±9.07 122.40±11.91 积雪草苷20 μmol/L组 83.39±8.41* 88.92±11.82* 积雪草苷40 μmol/L组 68.39±9.22** 73.55±11.55** 积雪草苷60 μmol/L组 48.91±17.48** 63.92±13.56** F 62.32 17.24 P < 0.05 < 0.05 MS组内 37.870 114.840 q检验:与空白对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01 表 5 积雪草苷对CNE-2细胞TNF-α和IL-1β表达的影响(ni=3;x±s)
积雪草苷通过Vimentin/NLRP3通路诱导鼻咽癌细胞凋亡研究
Asiaticoside induces apoptosis in nasopharyngeal carcinoma cells through Vimentin/NLRP3 pathway
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摘要:
目的研究积雪草苷对人鼻咽癌CNE-2细胞生长、凋亡及凋亡通路的影响。 方法体外培养CNE-2细胞,将不同浓度的积雪草苷作用于CNE-2细胞,MTT和CCK-8法检测积雪草苷对细胞生长的影响;流式细胞术检测对细胞凋亡的影响;Western blotting检测Vimentin、NLRP3、Bcl-2和Caspase-3表达;ELISA法检测TNF-α和IL-1β含量。 结果MTT和CCK-8结果显示,积雪草苷可浓度依赖性地抑制CNE-2细胞的生长;流式细胞仪检测结果显示,积雪草苷可浓度依赖性地促进CNE-2细胞凋亡;Western blotting结果显示,积雪草苷促进Caspase-3蛋白的表达,抑制Vimentin、NLRP3和Bcl-2的表达;ELISA法结果显示,积雪草苷可浓度依赖性地降低TNF-α和IL-1β含量。 结论积雪草苷可显著促进人鼻咽癌细胞株CNE-2细胞凋亡,其机制可能与下调Vimentin,NLRP3蛋白的表达来实现的。 Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of asiaticoside on the growth, apoptosis, apoptosis pathway in human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2. MethodsThe CNE-2 cells were cultured in vitro, and treated with different concentrations of Asiaticoside.The proliferation of cells were detected using MTT and CCK-8 assay, and the apoptosis rate of cells was detected using flow cytometry.The expression levels of Vimentin, NLRP3, Bcl-2 and Caspase-3 protein were determined using Western blotting, and the serum levels of TNF-α and IL-1β were determined using ELISA. ResultsThe results of MTT and CCK-8 assay showed that asiaticoside could inhibit the proliferation of CNE-2 cells ina concentration-dependent manner, the results of flow cytometry showed that asiaticoside could promote the apoptosis of CNE-2 cells in a concentration-dependent manner, the results of Western blotting showed that asiaticoside promoted the expression of Caspase-3, and inhibited the expression levels of Vimentin, NLRP3 and Bcl-2, and the results of ELISA showed that the contents of TNF-α and IL-1β could be decreased in a concentration-dependent manner. ConclusionsAsiaticoside can significantly promote the apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-2, and the mechanism may be realized by down-regulating the expression of Vimentin/NLRP3 protein. -
Key words:
- nasopharyngeal neoplasms /
- asiaticoside /
- CNE-2 cells /
- Vimentin /
- NLRP3 /
- apoptosis
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表 1 MTT法检测积雪草苷对CNE-2细胞增殖的抑制作用(ni=6;x±s)
分组 A值 抑制率/% F P MS组内 空白对照组 0.75±0.07 — 32.00 < 0.05 0.005 积雪草苷20 μmol/L组 0.60±0.06** 19.82 积雪草苷40 μmol/L组 0.48 ±0.08**# 36.07 积雪草苷60 μmol/L组 0.39±0.07**▲ 48.02 q检验:与空白对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与20 μmol/L组比较#P < 0.05;与40 μmol/L组比较▲P < 0.05 表 2 CCK-8法检测积雪草苷对CNE-2细胞增殖的抑制作用(ni=6;x±s)
分组 A值 抑制率/% F P MS组内 空白对照组 0.76±0.08 — 25.43 < 0.05 0.006 积雪草苷20 μmol/L组 0.61±0.06** 19.78 积雪草苷40 μmol/L组 0.49 ±0.09**# 35.15 积雪草苷60 μmol/L组 0.38±0.08**▲ 49.36 q检验:与空白对照组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与20 μmol/L组比较#P < 0.05;与40 μmol/L组比较▲P < 0.05 表 3 积雪草苷对CNE-2细胞凋亡的影响(ni=3;x±s)
分组 凋亡率/% F P MS组内 空白对照组 8.25±0.70 25.86 < 0.05 15.570 积雪草苷20 μmol/L组 21.42±3.09** 积雪草苷40 μmol/L组 33.32 ±5.05**## 积雪草苷60 μmol/L组 37.49±5.96**##▲▲ q检验:与空白对照组比较**P < 0.01;与20 μmol/L组比较##P < 0.01;与40 μmol/L组比较▲▲P < 0.01 表 4 积雪草苷对CNE-2细胞凋亡相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)
分组 蛋白表达水平 Vimentin NLRP-3 Caspase-3 Bcl-2 空白对照组 1.66±0.15 1.32±0.12 0.61±0.09 1.24±0.09 积雪草苷20 μmol/L组 1.38±0.08* 1.05±0.12* 0.84±0.11* 1.03±0.09* 积雪草苷40 μmol/L组 0.98±0.14**# 0.73±0.14**# 1.19±0.19** 0.62±0.10**## 积雪草苷60 μmol/L组 0.67±0.17** 0.59±0.19** 1.27±0.17** 0.56±0.11** F 45.53 12.26 20.85 13.44 P < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 MS组内 0.010 0.020 0.010 0.020 q检验:与空白对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01;与20 μmol/L组比较#P < 0.05,##P < 0.01 表 5 积雪草苷对CNE-2细胞TNF-α和IL-1β表达的影响(ni=3;x±s)
分组 蛋白表达水平 TNF-α IL-1β 空白对照组 114.69±9.07 122.40±11.91 积雪草苷20 μmol/L组 83.39±8.41* 88.92±11.82* 积雪草苷40 μmol/L组 68.39±9.22** 73.55±11.55** 积雪草苷60 μmol/L组 48.91±17.48** 63.92±13.56** F 62.32 17.24 P < 0.05 < 0.05 MS组内 37.870 114.840 q检验:与空白对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01 -
[1] ZHANG LF, LI YH, XIE SH, et al. Incidence trend of nasopharyngeal carcinoma from 1987 to 2011 in Sihui County, Guangdong Province, South China: an age-period-cohort analysis[J]. Chin J Cancer, 2015, 34(8): 350. [2] CHEN W, ZHENG R, BAADE PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. Ca Cancer J Clin, 2016, 66(2): 115. doi: 10.3322/caac.21338 [3] PENG G, WANG T, YANG KY, et al. A prospective, randomized study comparing outcomes and toxicities of intensity-modulated radiotherapy vs. conventional two-dimensional radiotherapy for the treatment of nasopharyngeal carcinoma[J]. Radiother Oncol, 2012, 104(3): 286. doi: 10.1016/j.radonc.2012.08.013 [4] 贾广韬. 积雪草苷的提取、分离纯化与水解[D]. 杭州: 浙江大学, 2010. [5] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 一部[S]. 2015年版. 北京: 中国医药科技出版社, 2015: 283. [6] 王莎丽, 杨琳, 刘勇, 等. 积雪草苷对博莱霉素诱导小鼠皮肤瘢痕形成的抑制作用[J]. 医药导报, 2017, 36(12): 1363. [7] 王策. 积雪草苷对单侧输尿管梗阻大鼠肾纤维化影响的研究[J]. 中国临床研究, 2017, 9(20): 1. doi: 10.3969/j.issn.1674-7860.2017.20.001 [8] LI YC, WANG HH, ZHANG R, et al. Antitumor activity of asiaticoside against multiple myeloma drug-resistant cancer cells is mediated by autophagy induction, activation of effector caspases, and inhibition of cell migration, invasion, and STAT-3 signaling pathway[J]. Med Sci Monit, 2019, 25: 1355. doi: 10.12659/MSM.913397 [9] 刘晨旭, 秦思达, 徐涛, 等. 积雪草甙对乳腺癌MCF-7细胞凋亡及VEGF、bFGF蛋白表达水平的影响[J]. 现代生物医学进展, 2018, 18(7): 1314. [10] 潘金丽. 积雪草诱导人卵巢癌细胞A2780凋亡机制研究[J]. 中医学报, 2018, 33(4): 521. [11] 黄云虹, 张胜华, 甄瑞贤, 等. 积雪草甙诱导肿瘤细胞凋亡及增强长春新碱的抗肿瘤作用[J]. 癌症, 2004, 23(12): 1599. [12] DE VASCONCELOS N M, VAN OPDENBOSCH N, LAMKANFI M. Inflammasomes as polyvalent cell death platforms[J]. Cell Mol Life Sci, 2016, 73(11/12): 2335. [13] FRANCUZ T, CZAJKA-FRANCUZ P, CISON'-JUREK S, et al. The role of inflammation in colon cancer pathogenesis[J]. Postepy Hig Med Dosw(Online), 2016, 70: 360. doi: 10.5604/17322693.1200551 [14] 张奇瑜, 鄢骑兵. 辣椒碱通过激活结肠癌细胞NLRP3炎性小体进而促进结肠癌转移的分子机制研究[J]. 成都医学院学报, 2018, 13(5): 546. doi: 10.3969/j.issn.1674-2257.2018.05.005 [15] 付祎婷, 程爱兰. 波形蛋白诱导EMT在肿瘤侵袭转移中的研究进展[J]. 中南医学科学杂志, 2019, 47(1): 89. [16] 卓少元, 谢金玲. 健脾益气方含药血清下调Vimentin蛋白水平对人肝癌细胞SMMC-7721的影响[J]. 时珍国医国药, 2017, 28(1): 55. [17] 周雅青, 杨蓉, 马刚. 沉默YAP1可抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力[J]. 南方医科大学学报, 2019, 39(3): 286.