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乳腺癌是女性发病率最高的恶性疾病之一,近年来的发病率逐年上升,严重危害了女性的健康。长链非编码RNA(LncRNA)为长度>200个核苷酸的RNA分子,根据互补碱基配对的原理,具有多种二级结构,可与多种蛋白质和核酸特异性结合[1],MicroRNA(miRNA)是一类小的、非编码RNA分子,通过与靶基因mRNA 3′末端非译区(3′-UTR)结合降解该mRNA从而抑制蛋白翻译来调控基因表达[2]。TAVAZOIE等[3]通过干扰miRNA-126,沉默CXCR4,显著降低了乳腺癌细胞生长及增殖,该研究发现LncRNA和miRNA可通过调控CXCR4表达从而调控乳腺癌转移和耐药诱导。本项目组通过生物信息学软件分析发现长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因15(LncRNA SNHG15)与miRNA-451a、趋化因子受体4(CXCR4)具有相应的结合序列。猜测SNHG15与CXCR4、miRNA-451a之间具有某种调控作用。本研究旨在探究LncRNA SNHG15、miRNA-451a与CXCR4对乳腺癌细胞的调控作用,以及对其生物学活性的影响。
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人乳腺癌细胞株SKBR3购买于中国科学院细胞库,胎牛血清和DMEM高糖培养基购买于Hyclone公司;Trizol试剂、Lipofectamine2000购买于Invitrogen公司;荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂购买于Takara公司;LncRNA SNHG15干扰片段、miRNA-451a抑制剂/类似物购买于上海吉玛公司,引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成;一抗Vimentin、slug、CXCR4购买于Proteintech以及Affinity公司。
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用紫杉醇诱导SKBR3产生耐药性,于紫杉醇浓度10 μg/mL、10%胎牛血清的DMEM培养基,37 ℃、5%CO2环境中生长,当细胞生长于对数生长期时,消化细胞进行相关实验处理。
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SKBR3-PR细胞铺6孔板培养,细胞生长至50%~60%时,配置转染试剂A、B液,将B液加进A液充分混匀后静置20 min,将6孔板旧培养基吸出,用PBS清洗,更换新的10%胎牛血清的DMEM培养基。将配置好的转染试剂加入相应的孔中培养24或48 h。
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6孔板细胞生长24 h后,用胰酶消化,加入Trizol试剂提取RNA并逆转录,以GAPDH为内参,按照qRT-PCR试剂说明进行PCR反应,按95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s的反应条件进行循环。反应结果表示为2-△△CT。LncRNA SNHG15、CXCR4、GAPDH引物序列见表 1。
引物名称 上游序列 下游序列 LncRNA SNHG15 GCC TCC CAG TTT CAT GGA CA GCT GAG GTG ACG GTC TCA AA CXCR4 CGT GGA ACG TTT TTC CTG TT AGG TGC TGA AAT CAA CCC AC GAPDH TGT GGT CAT GAG TCC TTC CA CAG CCT CAA GCT CAT CAG CA 表 1 引物序列
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检测SNHG15、miRNA-451a的表达变化对乳腺癌细胞迁移能力的影响,SKBR3-PR细胞铺6孔板培养,当细胞生长至80%~90%时,用10 μL的无菌枪头分别在6孔板的中间以及两侧各1/3处用相同的力道划一道笔直的伤痕,然后吸取旧培养基,更换无血清的DMEM培养基,实验组再加入相应的转染试剂,培养24 h后,在显微镜下观察0 h与24 h的细胞迁移情况。
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检测SNHG15、miRNA-451a表达对乳腺癌细胞凋亡能力的影响,SKBR3-PR细胞铺6孔板培养,当细胞生长至50%~60%左右时,进行相应的实验组转染处理,培养48 h后,用预冷的PBS冲洗2遍,用不含EDTA的胰酶消化,流式样本处理好后静置15~20 min,上机检测。
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检测CXCR4以及上皮间质转化(EMT)相关蛋白的表达水平。SKBR3-PR细胞铺6孔板培养至50%~60%进行相应的实验处理,48 h后用胰酶消化离心,按照沉淀多少加入适量的蛋白裂解液(PMSF∶RIPA=1∶99),静止后离心保存。配置SDS-聚丙烯酰胺凝胶,按照每孔25 μg的蛋白上样量上样,70 V电压跑胶,当跑到浓缩胶与分离胶分界时,更换100 V电压,按照200 mA 1.5 h进行转膜,封闭液封闭2 h后,敷相应一抗过夜,第2天敷二抗,配置显影液显影检测蛋白的表达水平。
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采用方差分析和t检验。
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与亲本细胞株比较,在乳腺癌耐药细胞株中,LncRNA SNHG15表达水平上调,但差异无统计学意义(P>0.05);miRNA-451a表达水平下降,CXCR4表达水平上升, 差异均有统计学意义(P<0.05和P<0.01)(见表 2)。在乳腺癌耐药细胞中转染并敲低SNHG15后miRNA-451a表达水平上调,且差异有统计学意义(P<0.05)(见表 3)。在乳腺癌耐药细胞中转染并抑制miRNA-451a时CXCR4表达水平上调, 且差异有统计学意义(P<0.01)(见表 4)。而当SI-LncRNA与miRNA-451a-inhibitor联合使用时CXCR4的表达量位于两者之间(见表 5)。说明在耐药细胞中SNHG15的表达量与miRNA-451a成负相关,与CXCR4成正相关。
分组 n SNHG15 miRNA-451a CXCR4 SKBR3组 3 1 1 1 SKBR3-PR组 3 2.040±0.285 0.183±0.182 1.550±0.458 t — 6.32 7.78 2.08 P — >0.05 < 0.05 < 0.01 表 2 亲本与耐药细胞株中SNHG15、miRNA-451a、CXCR4表达水平(x±s)
分组 n miRNA-451a SKBR3-PR组 3 1 SI-LncRNA组 3 3.41±0.922 t — 4.53 P — < 0.05 表 3 LncRNA SNHG15对miRNA-451a表达水平的影响(x±s)
分组 n CXCR4 SKBR3-PR组 3 1 miRNA-451a-inhibitor组 3 3.233±0.440 t — 8.79 P — < 0.01 表 4 miRNA-451a对CXCR4表达水平的影响(x±s)
分组 n CXCR4 SKBR-3-PR组 3 1 SI-LncRNA组 3 0.097±0.086** miRNA-451a-inhibior组 3 3.26±0.441**## SI-LncRNA+miRNA-451a-inhibitor组 3 1.53±0.127**##△△ F — 94.97 P — < 0.01 MS组内 — 0.447 q检验:与SKBR-3-PR组比较**P<0.01与SI-LncRNA组比较##P<0.01;与miRNA-451a-inhibitor组比较△△P<0.01 表 5 不同分组处理对CXCR4表达水平的影响(x±s)
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在乳腺癌SKBR3-PR细胞中,转染SI-LncRNA 24 h后,与正常对照组相比较,乳腺癌细胞的伤口愈合能力明显下降,迁移率降低(P<0.01);而转染miRNA-451a-inhibitor后,乳腺癌细胞的伤口较正常对照组变小,迁移能力上升(P<0.01);当SI-LncRNA+miRNA-451a-inhibitor联合使用时,细胞的迁移能力在二者之间(P<0.01)(见图 1、表 6)。
分组 n 迁移率/% SKBR3-PR组 3 56.67±1.12 SI-LncRNA组 3 4.40±1.77** miRNA-451a-inhibitor组 3 57.23±6.09**## SI-LncRNA+miRNA-451a-inhibitor组 3 23.56±2.49**##△△ F — 170.33 P — < 0.01 MS组内 — 11.919 q检验:与SKBR3-PR组比较**P<0.01;与SI-LncRNA组比较##P<0.01, 与miRNA-451a-inhibitor组比较△△P<0.01 表 6 不同分组处理对乳腺癌耐药细胞迁移能力的影响(x±s)
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与SKBR3-PR对照组相比,转染SI-LncRNA组晚期细胞凋亡率上升(P<0.01)。而转染miRNA-451a-inhibitor组细晚期胞凋亡率下降(P<0.01),而当SI-LncRNA与miRNA-451a-inhibitor联合使用时,乳腺癌细胞的凋亡率则在二者之间,从而说明二者对SKBR3-PR的凋亡作用呈现相反的作用(P<0.01)(见图 2、表 7)。
分组 n 晚期凋亡率/% SKBR3-PR组 3 9.07±0.55 SI-LncRNA组 3 20.97±1.44** miRNA-451a-inhibitor组 3 5.36±0.58**## SI-LncRNA+miRNA-451a-inhibitor组 3 12.35±1.12**##△△ F — 134.35 P — < 0.01 MS组内 — 0.992 q检验:与SKBR3-PR组比较**P<0.01;与SI-LncRNA组比较##P<0.01, 与miRNA-451a-inhibitor组比较△△P<0.01 表 7 不同处理组别对乳腺癌耐药细胞凋亡的影响(x±s)
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与SKBR3-PR对照组相比,转染SI-LncRNA组,靶基因CXCR4表达量下降(P<0.01),而转染miRNA-451a-inhibitor组表达量上升(P<0.01),EMT相关蛋白组Snail在转染SI-LncRNA时表达量相较对照组有明显下降(P<0.01),转染miRNA-451a-inhibitor组时表达量相较对照组上调(P<0.01), Vimentin指标变化无统计学意义(P>0.05)。当SI-LncRNA与miRNA-451a-inhibitor联合使用时,Snail表达量位于两者之间(P<0.01)(见图 3、表 8)。
分组 n Vimentin Snail CXCR4 SKBR3-PR组 3 1.369±0.039 1.438±0.004 1.071±0.384 SI-LncRNA组 3 1.049±0.123 0.398±0.011** 0.241±0.003** miRNA-451a-inhibitor组 3 1.663±0.986 1.595±0.007**## 1.156±0.006**## SI-LncRNA+miRNA-451a-inhibitor组 3 1.551±0.004 0.387±0.006**##△△ 0.727±0.006**##△△ F — 0.87 22 986.68 14.04 P — >0.05 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.247 0.000 0.037 q检验:与SKBR3-PR组比较**P<0.01;与SI-LncRNA组比较##P<0.01;与miRNA-451a-inhibitor组比较△△P<0.01 表 8 不同分组处理对乳腺癌耐药细胞EMT相关蛋白及靶基因CXCR4表达影响(x±s)
LncRNA SNHG15通过调控miRNA-451a促进乳腺癌细胞的上皮间质转化研究
Study on the LncRNA SNHG15 promoting the epithelial mesenchymal transformation of breast cancer cells by regulating miRNA-451a
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摘要:
目的研究长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因15(LncRNA SNHG15)与miRNA-451a对乳腺癌细胞的生物学活性的影响。 方法qRT-PCR法检测SNHG15、miRNA-451a及趋化因子受体4(CXCR4)在乳腺癌耐药细胞SKBR3-PR中的表达情况;细胞划痕实验检测干扰SNHG15及miRNA-451a抑制剂对SKBR3-PR的细胞迁移能力的影响;流式细胞术检测对细胞凋亡情况的影响;Western blotting实验检测CXCR4、上皮间质转化(EMT)相关蛋白Vimentin、Snail水平表达。 结果相比于亲本细胞,乳腺癌耐药细胞株中SNHG15表达量上调,但差异无统计学意义(P>0.05), miRNA-451a表达量下降(P<0.05),CXCR4表达量上调(P<0.01);划痕实验结果显示SNHG15促进细胞的迁移(P<0.01), miRNA-451a可抑制细胞迁移(P<0.01);细胞凋亡实验结果表明SNHG15抑制细胞凋亡(P<0.01),miRNA-451a促进细胞凋亡(P<0.01);Western blotting表明干扰SNHG15后,EMT相关蛋白Snail和CXCR4表达水平下降,miRNA-451a抑制剂组Snail和CXCR4表达水平上升(P<0.01),Vimentin表达水平无统计学意义(P>0.05)。 结论LncRNA SNHG15可能通过调控miRNA-451a促进乳腺癌细胞的迁移、凋亡,并且潜在调控CXCR4诱导乳腺癌细胞的EMT。 -
关键词:
- 乳腺肿瘤 /
- 长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因15 /
- 趋化因子受体4 /
- 微小RNA-451a
Abstract:ObjectiveTo study the effects of leng noncoding RAN small nucleolar RNA host gene 15(LncRNA SNHG15) and microRNA-451a(miRNA-451a) on the biological activity of breast cancer cells. MethodsThe expression levels of SNHG15, miRNA-451a and chemokine receptor 4(CXCR4) in drug-resistant breast cancer SKBR3-PR cells were detected using qRT-PCR.The effects of the SNHG15 and miRNA-451a inhibitors on SKBR3-PR cells migration were determined by cell scratch assay.Flow cytometry was used to detect the apoptosis, and the protein expression levels of CXCR4, epithelial mesenchymal transformation(EMT)-related proteins Vimentin and Snail were detected by Western blotting. ResultsCompared with the parent cells, the expression level of miRNA-451a decreased(P<0.05), the expression level of CXCR4 was up-regulated in drug-resistant breast cancer cell lines(P<0.01).The results of cell scratch assay showed that the SNHG15 promoted cell migration(P<0.01), and the miRNA-451a inhibited cell migration(P<0.01).The results of apoptosis assay showed that the SNHG15 inhibited apoptosis(P<0.01) and the miRNA-451a promoted apoptosis(P<0.01).After interfering SNHG15, the results of Western blotting showed that the expression levels of EMT-related proteins Snail and CXCR4 decreased, the expression levels of Snail and CXCR4 increased in miRNA-451a inhibitor group(P<0.01), and the differences of the Vimentin expression level was not statistically significant(P>0.05). ConclusionsLncRNA SNHG15 may promote the migration and apoptosis of breast cancer cells by regulating miRNA-451a, and potentially regulate CXCR4 to induce EMT of breast cancer cells. -
表 1 引物序列
引物名称 上游序列 下游序列 LncRNA SNHG15 GCC TCC CAG TTT CAT GGA CA GCT GAG GTG ACG GTC TCA AA CXCR4 CGT GGA ACG TTT TTC CTG TT AGG TGC TGA AAT CAA CCC AC GAPDH TGT GGT CAT GAG TCC TTC CA CAG CCT CAA GCT CAT CAG CA 表 2 亲本与耐药细胞株中SNHG15、miRNA-451a、CXCR4表达水平(x±s)
分组 n SNHG15 miRNA-451a CXCR4 SKBR3组 3 1 1 1 SKBR3-PR组 3 2.040±0.285 0.183±0.182 1.550±0.458 t — 6.32 7.78 2.08 P — >0.05 < 0.05 < 0.01 表 3 LncRNA SNHG15对miRNA-451a表达水平的影响(x±s)
分组 n miRNA-451a SKBR3-PR组 3 1 SI-LncRNA组 3 3.41±0.922 t — 4.53 P — < 0.05 表 4 miRNA-451a对CXCR4表达水平的影响(x±s)
分组 n CXCR4 SKBR3-PR组 3 1 miRNA-451a-inhibitor组 3 3.233±0.440 t — 8.79 P — < 0.01 表 5 不同分组处理对CXCR4表达水平的影响(x±s)
分组 n CXCR4 SKBR-3-PR组 3 1 SI-LncRNA组 3 0.097±0.086** miRNA-451a-inhibior组 3 3.26±0.441**## SI-LncRNA+miRNA-451a-inhibitor组 3 1.53±0.127**##△△ F — 94.97 P — < 0.01 MS组内 — 0.447 q检验:与SKBR-3-PR组比较**P<0.01与SI-LncRNA组比较##P<0.01;与miRNA-451a-inhibitor组比较△△P<0.01 表 6 不同分组处理对乳腺癌耐药细胞迁移能力的影响(x±s)
分组 n 迁移率/% SKBR3-PR组 3 56.67±1.12 SI-LncRNA组 3 4.40±1.77** miRNA-451a-inhibitor组 3 57.23±6.09**## SI-LncRNA+miRNA-451a-inhibitor组 3 23.56±2.49**##△△ F — 170.33 P — < 0.01 MS组内 — 11.919 q检验:与SKBR3-PR组比较**P<0.01;与SI-LncRNA组比较##P<0.01, 与miRNA-451a-inhibitor组比较△△P<0.01 表 7 不同处理组别对乳腺癌耐药细胞凋亡的影响(x±s)
分组 n 晚期凋亡率/% SKBR3-PR组 3 9.07±0.55 SI-LncRNA组 3 20.97±1.44** miRNA-451a-inhibitor组 3 5.36±0.58**## SI-LncRNA+miRNA-451a-inhibitor组 3 12.35±1.12**##△△ F — 134.35 P — < 0.01 MS组内 — 0.992 q检验:与SKBR3-PR组比较**P<0.01;与SI-LncRNA组比较##P<0.01, 与miRNA-451a-inhibitor组比较△△P<0.01 表 8 不同分组处理对乳腺癌耐药细胞EMT相关蛋白及靶基因CXCR4表达影响(x±s)
分组 n Vimentin Snail CXCR4 SKBR3-PR组 3 1.369±0.039 1.438±0.004 1.071±0.384 SI-LncRNA组 3 1.049±0.123 0.398±0.011** 0.241±0.003** miRNA-451a-inhibitor组 3 1.663±0.986 1.595±0.007**## 1.156±0.006**## SI-LncRNA+miRNA-451a-inhibitor组 3 1.551±0.004 0.387±0.006**##△△ 0.727±0.006**##△△ F — 0.87 22 986.68 14.04 P — >0.05 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.247 0.000 0.037 q检验:与SKBR3-PR组比较**P<0.01;与SI-LncRNA组比较##P<0.01;与miRNA-451a-inhibitor组比较△△P<0.01 -
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