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目前,CRISPR/Cas9技术是最强大的基因组编辑工具,由CRISPR RNA(crRNA)和Cas9核酸酶组成,DNA由Cas9引导并切割,导致靶位点双链断裂。在细胞DNA修复过程中,靶位点处发生目的基因片段插入、替换或删除[1]。CRISPR/Cas9有效地应用于基因敲除、内源性基因表达调控、活细胞标记染色体位点、编辑单链RNA和高通量基因筛选。CRISPR/Cas9技术的应用扩大了研究基因功能研究的样本种类,可以应用于发育机制、基因表达调控和动物行为等方面。同时,CRISPR/Cas9技术的应用有助于研究人员阐明靶基因功能,使研究特定基因功能成为可能[2-3]。因此,本研究应用CRISPR/Cas9技术高效构建Trib3基因敲除大鼠模型。
Trib3基因位于人类染色体20p13-p12.2,包括4个外显子和3个内含子,TRIB3含有358个氨基酸残基[4]。Trib3基因是哺乳动物Tribbles家族的成员,Tribbles家族由Trib1、Trib2和Trib3三种基因组成[5]。目前有研究[6-8]表明Trib3在肝脏中被诱导表达,TRIB3通过直接与Akt结合,从而促进了Ⅱ型糖尿病易感性个体的胰岛素抵抗。另一项研究[9]表明TRIB3与细胞周期调节因子CtIP(Ctbp-interactions protein)相互作用,不仅破坏正常的细胞周期导致细胞癌变,还在癌细胞中过表达。TRIB3在结肠细胞中与β-catenin和TCF4相互作用,增加肿瘤干细胞相关基因的表达,敲除Trib3基因后可有效减少小鼠结肠肿瘤细胞数量[10]。TRIB3在肺癌组织中的表达显著增加,并与肺癌病人的生存时间呈反比。同时,TRIB3亦在其他类型的肿瘤中诱导表达[11]。有研究[12]显示TRIB3的表达与HIF-1α的表达相关,HIF-1α作为一种重要的转录因子,参与调控血管生成、携氧蛋白和葡萄糖代谢酶等多种相关基因的表达,是肾细胞癌发生发展的关键因素。TRIB3通过抑制AKT信号通路从而抑制细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导子宫内膜癌细胞凋亡[13]。Trib3基因除了与癌症有关,该基因也可以促进成骨发育[14]。但是,Trib3基因在精子发生中的作用鲜有报道,刘陶迪[15]通过高通量基因芯片技术检测,结果发现Trib3基因在精子发生过程中的表达差异性有20.3倍之多。因此,建立Trib3基因敲除大鼠模型来研究该基因在精子发生中功能具有重要意义。本研究中对基因敲除大鼠的基因型鉴定是Trib3基因功能研究的前期工作和重要环节,可为后续研究提供实验依据。
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基因敲除大鼠由北京维通达生物技术有限公司提供,品系为Wistar大鼠[许可证号: SCXK(京)2019-0002]。通过CRISPR/Cas9技术敲除大鼠Trib3基因。Trib3基因敲除大鼠饲养在内蒙古医科大学实验动物中心SPF级鼠房饲养和繁殖。
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血液组织DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit, 天根生化有限公司);PGK1.1 linear vector(南京大学南京生物医药研究院提供);2×San Taq PCRMix(Dye)(上海生工生物工程股份有限公司);invitrogen琼脂糖(美国Thermo Fisher Scientific);6×Loading buffer(武汉Biosharp生物技术有限公司);GoldView Ⅰ型核酸染色剂(北京Solarbio科技有限公司);D2000 DNA Marker[天根生化(北京)有限公司];超微量紫外分光光度仪(Thermo ND 2000L);PCR扩增仪(威泰克公司);水平电泳仪(北京柏奥易杰科技有限公司);凝胶成像系统(美国美国UVP公司)。
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Trib3基因位于大鼠第3号染色体,Trib3基因编码蛋白的主要有1种剪接体:Trib3-201,编码349个氨基酸残基的蛋白,Trib3基因的3号外显子长度293 bp,非3的整数倍,删除后将造成后续编码区移码突变,导致Trib3基因功能丧失。因此本实验将Trib3基因的3号外显子删除。用大鼠Trib3基因特异sgRNA(single-guide RNA)介导Cas9核酸酶切割DNA出现特定的DSBs(Double-Stranded Breaks),在剪接体Trib3-201的3号外显子的上游及下游切口,通过NHEJ(Non-homologous end Joining)修复途径,将2个切口直接连接,同时删除两个切口之间的序列(即3号外显子)。用CRISPR Design设计筛选得到2个gRNA,分别是Trib3-gRNA1为5′-TGA GTC TAG TCA GCG GAG CAG GG-3′;Trib3-gRNA3为5′-ACT AAA GGA ATA GCT GCG GGT GG-3′。将纯化好的sgRNA、Cas9-mRNA共同注射到Wistar大鼠胚胎中,注射后将胚胎移植到代孕受体大鼠的输卵管内,胚胎移植后3~4周大鼠出生,出生2周左右完成基因型鉴定。
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对出生后8~10 d的大鼠进行剪脚趾标记编号。剪取8~10日龄大鼠脚趾,装入0.2 mL PCR管。加入200 μL缓冲液GA,用眼科剪剪碎,注射器抽打10次。加入20 μL Proteinase K溶液,混匀。56 ℃水浴过夜,直至组织溶解后。动物组织DNA提取参考总DNA试剂盒(TIANGEN, DP304)说明书进行操作,以ddH2O作为阴性对照品,使用超微量紫外分光光度仪(Thermo ND 2000L)测定DNA浓度(Conc)及DNA纯度,A260/A280比值在1.8左右为DNA纯度合格,浓度结果在100~300 ng/μL。
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引物由北京维通达生物技术有限公司设计、合成,引物序列见表 1。PCR反应条件为94 ℃ 4 min,94 ℃ 20 s,62 ℃ 25 s,72 ℃ 40 s,38个循环,72 ℃ 2 min结束。
引物 序列(5′~3′) Trib3-seq-F1 GCT CCC TTC TAA AAT AAC AAC CCA C Trib3-seq-F2 GTA TAC CTG TGC TTA GCA TGT GGA AG Trib3-seq-R TTT GTC AGA TAC CTT GGA CTT GGA G 表 1 寡核苷酸引物列表
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电泳条件:PCR扩增产物15 μL,6×Loading buffer 1.0 μL,1.3%琼脂糖凝胶,100 V恒压50 min,使用凝胶成像系统(美国美国UVP公司)拍照。
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应用CRISPR/Cas9敲除大鼠Trib3基因,Trib3基因的3号外显子长度293 bp,非3的整数倍,删除后将造成后续编码区移码突变,从而导致Trib3基因功能丧失(见图 1)。获得F0代大鼠(见表 2),对F0代founder大鼠敲除及鉴定见图 1~3。大鼠编号分别为8734♀、8735♀、8737♂、9041♂,4只F0代founder大鼠为基因敲除大鼠,其中9041♂founder大鼠死亡,最终获得1雄2雌共3只F0代founder大鼠,分别为8734♀、8735♀、8737♂。
编号 性别 出生日期 Trib3敲除情况 是否淘汰 8733 ♀ 2019/4/12 未敲除 是 8734 ♀ 2019/4/12 已敲除 否 8735 ♀ 2019/4/12 已敲除 否 8736 ♂ 2019/4/12 未敲除 是 8737 ♂ 2019/4/12 已敲除 否 8738 ♀ 2019/4/12 未敲除 是 8739 ♂ 2019/4/12 未敲除 是 8740 ♀ 2019/4/12 未敲除 是 8741 ♂ 2019/4/12 未敲除 是 8742 ♀ 2019/4/12 未敲除 是 8446 ♀ 2019/4/16 未敲除 是 9041 ♂ 2019/4/26 已敲除 否 表 2 F0代基因敲除大鼠出生情况
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大鼠的性成熟期约为8周,母鼠妊娠期约为21 d,采用8734♀×8737♂、8735♀×wistar♂进行繁殖,获得F1代大鼠(见表 3),对出生的F1代大鼠进行鉴定(见图 4~6)。F1代大鼠10156~10166是8734♀×8737♂所生;F1代大鼠10167~10181是8734♀×8737♂所生,对F1代样品进行测序,将删除序列相同的大鼠归为一组(line),分为3个line,lineA:10156、10157、10159、10160、10164、10166来源于8734♀×8737♂,经测序,删除序列与founder鼠8734完全相同;lineB:10167、10169、10170、10179、10180来源于8735♀×wistar♂,经测序,删除序列与founder鼠8735完全相同;lineC:10168、10171、10177、10178来源于8735♀×wistar♂,经测序,删除序列与founder鼠不同。
编号 性别 出生日期 基因型 亲代 是否淘汰 10156 ♀ 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂ 否 10157 ♀ 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂ 否 10158 ♀ 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂ 是 10159 ♀ 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂ 否 10160 ♀ 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂ 否 10161 ♂ 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂ 是 10162 ♂ 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂ 是 10163 ♂ 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂ 是 10164 ♂ 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂ 否 10165 ♂ 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂ 是 10166 ♂ 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂ 否 10167 ♀ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10168 ♀ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10169 ♀ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10170 ♀ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10171 ♀ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10172 ♂ 2019/6/19 野生 8735♀×wistar♂ 是 10173 ♂ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10174 ♂ 2019/6/19 野生 8735♀×wistar♂ 是 10175 ♂ 2019/6/19 野生 8735♀×wistar♂ 是 10176 ♂ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10177 ♂ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10178 ♂ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10179 ♂ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10180 ♂ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10181 ♂ 2019/6/19 野生 8735♀×wistar♂ 是 1370 ♀ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1371 ♀ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1372 ♀ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1373 ♀ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1374 ♀ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1375 ♂ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1376 ♂ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1377 ♂ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1378 ♂ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1379 ♂ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1380 ♂ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 表 3 F1代基因敲除大鼠出生情况
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经CRISPR/Cas9敲除Trib3基因相应位点后导致其突变,基因型判断标准(见表 4):KO引物Trib3-seq-F1的PCR产物长度为333 bp,WT引物Trib3-seq-F2的PCR产物将消失的为纯合子大鼠(Trib3-/-);KO引物Trib3-seq-F1扩增产物长度为1 498 bp,WT引物Trib3-seq-F2的PCR产物长度为523为野生型大鼠(Trib3+/+);KO引物Trib3-seq-F1扩增产物长度为333 bp,并且WT引物Trib3-seq-F2的PCR产物长度为523为杂合型大鼠(Trib3-/+)。F2代大鼠1~6是10166♂× 10159♀所生;F2代大鼠7~13是10179♂×10167♀所生(见表 5)。鉴定结果结果:F2代中5号、9号、10号、11号、12号大鼠为纯合型大鼠(见图 7~9)。
Trib3-seq-F1+Trib3-seq-R Trib3-seq-F2+Trib3-seq-R Trib3+/+ 1 498 bp 523 bp Trib3-/+ 333 bp 523 bp Trib3-/- 333 bp no product 表 4 基因型判断标准
编号 性别 出生日期 基因型 是否淘汰 1 ♀ 2019/9/25 杂合 否 2 ♀ 2019/9/25 杂合 否 3 ♀ 2019/9/25 杂合 否 4 ♂ 2019/9/25 野生 是 5 ♀ 2019/9/25 纯合 否 6 ♀ 2019/9/25 杂合 否 7 ♂ 2019/10/13 野生 是 8 ♀ 2019/10/13 杂合 否 9 ♀ 2019/10/13 纯合 否 10 ♂ 2019/10/13 纯合 否 11 ♀ 2019/10/13 纯合 否 12 ♂ 2019/10/13 纯合 否 13 ♂ 2019/10/13 杂合 否 表 5 F2代基因敲除大鼠出生情况
应用CRISPR/Cas9技术敲除Trib3基因大鼠的基因型鉴定
Genotype identification of Trib3 knockout rats using CRISPR/Cas9 technology
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摘要:
目的构建Trib3基因敲除大鼠模型及基因型鉴定。 方法靶向敲除大鼠Trib3基因后,通过基因测序和PCR技术对大鼠Trib3基因的第3号外显子删除情况进行检测与基因型鉴定。 结果得到阳性F0代首建大鼠Trib3-/+,通过自交得到F1与F2代大鼠,筛选出F2代Trib3-/-大鼠。 结论成功制备Trib3基因敲除大鼠模型,依次鉴定出Trib3-/-、Trib3-/+和Trib3+/+大鼠,并可以稳定遗传,为后续的实验开展提供理论依据。 Abstract:ObjectiveTo construct a Trib3 knockout rat model and identify the related genotype. MethodsAfter targeted knockout of Trib3 gene in rat model, the deletion of exon 3 of Trib3 gene was detected, and the genotype was identified by gene sequencing and PCR methods. ResultsThe positive F0 generation of Trib3-/+ rats was obtained, the F1 and F2 generations were obtained by self-crossing, and the F2 generation of Trib3-/- rats was selected. ConclusionsTrib3 knockout rat models are successfully prepared, and Trib3-/-, Trib3-/+ and Trib3+/+ rats are successively identified and can be stably inherited, it provides a theoretical basis for subsequent experiments. -
Key words:
- gene knockout /
- Trib3 /
- breeding /
- genotype identification /
- rat
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表 1 寡核苷酸引物列表
引物 序列(5′~3′) Trib3-seq-F1 GCT CCC TTC TAA AAT AAC AAC CCA C Trib3-seq-F2 GTA TAC CTG TGC TTA GCA TGT GGA AG Trib3-seq-R TTT GTC AGA TAC CTT GGA CTT GGA G 表 2 F0代基因敲除大鼠出生情况
编号 性别 出生日期 Trib3敲除情况 是否淘汰 8733 ♀ 2019/4/12 未敲除 是 8734 ♀ 2019/4/12 已敲除 否 8735 ♀ 2019/4/12 已敲除 否 8736 ♂ 2019/4/12 未敲除 是 8737 ♂ 2019/4/12 已敲除 否 8738 ♀ 2019/4/12 未敲除 是 8739 ♂ 2019/4/12 未敲除 是 8740 ♀ 2019/4/12 未敲除 是 8741 ♂ 2019/4/12 未敲除 是 8742 ♀ 2019/4/12 未敲除 是 8446 ♀ 2019/4/16 未敲除 是 9041 ♂ 2019/4/26 已敲除 否 表 3 F1代基因敲除大鼠出生情况
编号 性别 出生日期 基因型 亲代 是否淘汰 10156 ♀ 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂ 否 10157 ♀ 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂ 否 10158 ♀ 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂ 是 10159 ♀ 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂ 否 10160 ♀ 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂ 否 10161 ♂ 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂ 是 10162 ♂ 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂ 是 10163 ♂ 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂ 是 10164 ♂ 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂ 否 10165 ♂ 2019/6/17 野生 8734♀×8737♂ 是 10166 ♂ 2019/6/17 杂合 8734♀×8737♂ 否 10167 ♀ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10168 ♀ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10169 ♀ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10170 ♀ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10171 ♀ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10172 ♂ 2019/6/19 野生 8735♀×wistar♂ 是 10173 ♂ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10174 ♂ 2019/6/19 野生 8735♀×wistar♂ 是 10175 ♂ 2019/6/19 野生 8735♀×wistar♂ 是 10176 ♂ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10177 ♂ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10178 ♂ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10179 ♂ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10180 ♂ 2019/6/19 杂合 8735♀×wistar♂ 否 10181 ♂ 2019/6/19 野生 8735♀×wistar♂ 是 1370 ♀ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1371 ♀ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1372 ♀ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1373 ♀ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1374 ♀ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1375 ♂ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1376 ♂ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1377 ♂ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1378 ♂ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1379 ♂ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 1380 ♂ 2019/8/3 纯合 8734♀×8737♂ 否 表 4 基因型判断标准
Trib3-seq-F1+Trib3-seq-R Trib3-seq-F2+Trib3-seq-R Trib3+/+ 1 498 bp 523 bp Trib3-/+ 333 bp 523 bp Trib3-/- 333 bp no product 表 5 F2代基因敲除大鼠出生情况
编号 性别 出生日期 基因型 是否淘汰 1 ♀ 2019/9/25 杂合 否 2 ♀ 2019/9/25 杂合 否 3 ♀ 2019/9/25 杂合 否 4 ♂ 2019/9/25 野生 是 5 ♀ 2019/9/25 纯合 否 6 ♀ 2019/9/25 杂合 否 7 ♂ 2019/10/13 野生 是 8 ♀ 2019/10/13 杂合 否 9 ♀ 2019/10/13 纯合 否 10 ♂ 2019/10/13 纯合 否 11 ♀ 2019/10/13 纯合 否 12 ♂ 2019/10/13 纯合 否 13 ♂ 2019/10/13 杂合 否 -
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