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垂体腺瘤起源于垂体前叶激素分泌细胞,是常见的颅内肿瘤。过去10~15年的流行病学研究[1-3]结果显示,垂体腺瘤的发病率有增多的趋势。垂体腺瘤多为偶发瘤,病理组织学形态表现为良性,但部分垂体腺瘤仍有瘤体增大、侵袭生长的表现,并且手术切除存在全切率低、术后并发症多、肿瘤易复发等问题。此外,垂体腺瘤的发病机制尚不清楚,这进一步限制了探索垂体腺瘤临床治疗的研究步伐。
目前,关于垂体腺瘤发生机制存在多种假设和争论,但肿瘤相关细胞信号转导通路和肿瘤基因表观遗传学的异常是不争的事实。人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)是肿瘤中最常失活的抑癌基因之一[4-6]。研究[7-8]显示,PTEN参与调控垂体腺瘤的增殖和侵袭,而且这种调控作用很可能是通过下游的PI3K/AKT信号通路实现的。MicroRNA(miRNA)通过结合靶mRNA调控基因表达,参与调控细胞增殖、分化和/或凋亡的过程。
前人的研究提示了miR-20a在垂体腺瘤中的表达以及与PTEN的关系,但鲜有研究证明二者的确切调控关系以及影响肿瘤发生与发展的分子机制。本文通过细胞试验,深入探讨了miR-20a对PTEN以及下游信号通路和垂体腺瘤发生与发展的影响,我们的结果证明了miR-20a在调节细胞的增殖和侵袭的过程中扮演重要作用,它可能通过靶向PTEN,影响PI3K/AKT信号通路,调控垂体腺瘤细胞的增殖和侵袭,从而参与到垂体腺瘤的疾病进程中。现作报道。
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CCK8细胞增殖检测试验结果显示,大鼠和人垂体瘤细胞系各组OD值,Day0时差异均无统计学意义(P>0.05),Day1、Day2、Day3和Day4时,与类似物对照组相比,miR-20a类似物组OD值均增高,与抑制物对照组相比,miR-20a抑制物组的OD值均降低,差异均有统计学意义(P < 0.01)(见表 1、2)。
分组 n Day0 Day1 Day2 Day3 Day4 抑制物对照组 3 0.204±0.013 0.241±0.011 0.356±0.049 0.579±0.051 0.763±0.076 抑制物组 3 0.196±0.014 0.226±0.009** 0.293±0.011** 0.393±0.011** 0.548±0.006** 类似物对照组 3 0.207±0.009 0.241±0.010 0.380±0.017 0.611±0.021 0.809±0.019 类似物组 3 0.210±0.016 0.394±0.021△△ 0.676±0.017△△ 1.008±0.047△△ 1.375±0.063△△ F — 0.65 98.18 112.00 148.38 147.91 P — >0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.000 0.019 0.087 0.201 0.374 q检验: 与抑制物对照组比较**P < 0.01;与类似物对照组比较△△P < 0.01 表 1 miR-20a对大鼠垂体瘤细胞系增殖的影响(x±s)
分组 n Day0 Day1 Day2 Day3 Day4 抑制物对照组 3 0.214±0.013 0.31±0.012 0.449±0.055 0.666±0.059 0.901±0.09 抑制物组 3 0.205±0.015 0.244±0.010** 0.328±0.012** 0.453±0.012** 0.647±0.007** 类似物对照组 3 0.217±0.010 0.311±0.010 0.475±0.020 0.703±0.024 0.954±0.022 类似物组 3 0.220±0.016 0.425±0.023△△ 0.757±0.019△△ 1.159±0.054△△ 1.623±0.074△△ F — 0.68 76.48 101.55 148.83 149.05 P — >0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.000 0.017 0.099 0.265 0.521 q检验: 与抑制物对照组比较**P < 0.01;与类似物对照组比较△△P < 0.01 表 2 miR-20a对人垂体瘤细胞系增殖的影响(x±s)
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Transwell试验结果显示,miR-20a类似物组GH3细胞和HP75细胞迁移细胞数量均高于类似物对照组,差异有统计学意义(P < 0.01和P < 0.05);相反的,miR-20a抑制物组GH3细胞和HP75细胞迁移细胞数量均低于抑制物对照组,差异有统计学意义(P < 0.01)(见表 3)。
分组 n GH3细胞系 HP75细胞系 抑制物对照组 3 65.36±6.54 71.81±17.18 抑制物组 3 40.58±9.56* 49.51±10.92** 类似物对照组 3 68.37±6.84 69.66±16.97 类似物组 3 111.37±11.14△△ 123.41±12.34△△ F — 34.00 13.95 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 2 593.132 2 979.998 q检验:与抑制物对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01;与类似物对照组比较△△P < 0.01 表 3 miR-20a对垂体腺瘤细胞侵袭的影响(x±s)
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我们进一步检测了PTEN下游与肿瘤增殖和侵袭密切相关的PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达情况。结果表明,与类似物对照组相比,miR-20a类似物组在垂体腺瘤细胞系GH3和HP75中细胞增殖相关蛋白PI3K、AKT、MAPK和侵袭相关蛋白E-cadherin、MMP2和MMP9的表达量均增高,差异均有统计学意义(P < 0.01)(见图 1A和表 4、5);与抑制物对照组相比,miR-20a抑制物组在垂体腺瘤细胞系GH3和HP75中各蛋白表达量均下降,差异均有统计学意义(P < 0.01)(见图 1B和表 6、7)。
分组 n PI3K AKT MAPK 抑制物对照组 3 2.721±0.373 3.670±0.631 2.261±0.269 抑制物组 3 1.091±0.249** 1.017±0.220** 0.990±0.27** 类似物对照组 3 2.725±0.287 3.679±0.515 2.316±0.214 类似物组 3 5.111±0.481△△ 8.119±0.969△△ 4.868±0.750△△ F — 63.85 63.02 42.08 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 8.223 26.021 7.931 q检验:与抑制物对照组比较**P < 0.01;与类似物对照组比较△△P < 0.01 表 4 miR-20a对垂体腺瘤GH3细胞系与增殖相关蛋白表达的影响(x±s)
分组 n PI3K AKT MAPK 抑制物对照组 3 4.328±0.565 3.670±0.333 2.543±0.363 抑制物对照组 3 4.328±0.565 3.670±0.333 2.543±0.363 抑制物组 3 1.016±0.350** 1.017±0.248** 1.009±0.315** 类似物对照组 3 4.331±0.709 3.679±0.515 2.587±0.536 类似物组 3 8.144±0.912△△ 8.119±0.969△△ 4.575±0.961△△ F — 57.34 75.60 17.79 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 25.465 26.021 6.412 q检验:与抑制物对照组比较**P < 0.01;与类似物对照组比较△△P < 0.01 表 5 miR-20a对垂体腺瘤HP75细胞系与增殖相关蛋白表达的影响(x±s)
分组 n E-Cad MMP2 MMP9 抑制物对照组 3 3.567±0.502 2.339±0.524 4.417±0.989 抑制物组 3 1.000±0.294** 0.993±0.246** 0.993±0.364** 类似物对照组 3 3.607±0.487 2.372±0.414 4.480±0.478 类似物组 3 7.13±0.763△△ 5.283±0.334△△ 9.976±1.377△△ F — 65.73 63.50 51.19 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 19.018 9.814 41.421 q检验:与抑制物对照组比较**P < 0.01;与类似物对照组比较△△P < 0.01 表 6 miR-20a对垂体腺瘤GH3细胞系与迁移相关蛋白表达的影响(x±s)
分组 n E-Cad MMP2 MMP9 抑制物对照组 3 4.693±0.785 2.058±0.462 3.909±0.876 抑制物组 3 0.992±0.283** 1.011±0.264** 0.993±0.246** 类似物对照组 3 4.697±0.614 2.088±0.352 3.964±0.788 类似物组 3 9.362±1.409△△ 4.649±0.676△△ 8.828±1.332△△ F — 46.09 33.33 39.26 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 35.256 7.192 31.645 q检验:与抑制物对照组比较**P < 0.01;与类似物对照组比较△△P < 0.01 表 7 miR-20a对垂体腺瘤HP75细胞系与迁移相关蛋白表达的影响(x±s)
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miR-20a是一种纤维化相关的小RNA,其序列中含有PTEN结合位点,因此我们认为miR-20a负调控PTEN通过PI3K/AKT信号通路进而促进垂体腺瘤的生长。通过双荧光素酶报告基因分析,发现与miR-20a类似物对照组比较,类似物组PTEN-WT的活性降低(P < 0.01)(见表 8)。
分组 n PTEN-WT PTEN-MUT 类似物对照组 3 0.976±0.117 0.945±0.079 类似物组 3 0.482±0.061 1.027±0.070 t — 6.48 1.35 P — < 0.01 >0.05 表 8 双荧光素酶报告基因分析证实miR-20a对PTEN的负调控(x ±s)
miR-20a靶向PTEN调控垂体腺瘤细胞的增殖与侵袭
Study on the miR-20a regulating the proliferation and invasion of pituitary adenoma cells by targeting PTEN
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摘要:
目的探讨miR-20a对垂体腺瘤细胞增殖和侵袭的影响及其作用机制。 方法培养垂体腺瘤细胞系GH3、HP75,采用RT-qPCR、Western blotting、双荧光素酶报告基因检测等方法,分析垂体腺瘤细胞系中miR-20a和人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)的表达相关性以及相互作用情况;采用CCK8和Transwell等方法检测miR-20a对垂体腺瘤细胞增殖和侵袭能力的影响,进一步考察对PTEN下游PI3K/AKT信号通路的影响。 结果 miR-20a负调控PTEN的表达。体外细胞实验显示,与miR-20a类似物对照组相比,类似物组在垂体腺瘤细胞系GH3和HP75中细胞迁移细胞数量、细胞增殖相关蛋白PI3K、AKT、MAPK和侵袭相关蛋白E-cadherin、MMP2和MMP9的表达量均增高,差异均有统计学意义(P < 0.01);与抑制物对照组相比,miR-20a抑制物组在GH3和HP75中细胞迁移细胞数量和各蛋白表达量均下降,差异均有统计学意义(P < 0.01);双荧光素酶报告基因分析发现与miR-20a类似物对照组比较,类似物组PTEN-WT的活性降低(P < 0.01)。 结论miR-20a在调节细胞的增殖和侵袭的过程中扮演非常重要的作用,因而影响了垂体腺瘤细胞的增殖和侵袭。它可能通过靶向PTEN,影响PI3K/AKT信号通路,参与垂体腺瘤的进程中。 -
关键词:
- 垂体瘤 /
- miR-20a /
- 人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因 /
- 细胞增殖和侵袭
Abstract:ObjectiveTo explore the effects of miR-20a on the proliferation and invasion of pituitary adenoma cells and its mechanism. MethodsThe pituitary adenoma cell lines GH3 and HP75 were cultured, and the expression correlation and interaction of miR-20a and gene of phosphate and tensin homolog deletedon chromosome ten(PTEN) in cell lines were analyzed by RT-QPCR, Western blotting and double luciferase reporter gene detection.The CCK8 and Transwell methods were used to detect the effects of miR-20a on the proliferation and invasion ability of pituitary adenoma cells, and the effects of miR-20a on the downstream PI3K/AKT signaling pathway of PTEN were further investigated. ResultsmiR-20a can target PTEN and negatively regulate the expression of PTEN.The results of in vitro cell experiments showed that, compared with miR-20a analogue control group, the number of migrating cells, the expression levels of proliferation-related proteins PI3K, AKT, MAPK and invasion-related proteins E-cadherin, MMP2 and MMP9 in the pituitary adenoma cell lines GH3 and HP75 in the analogue group were increased(P < 0.01).Compared with the inhibitor control group, the number of migrating cells and the expression levels of each protein in miR-20a inhibitor group were decreased in GH3 and HP75, and the differences were statistically significant(P < 0.01).Double luciferase reporter gene analysis showed that compared with miR-20a analogue control group, the activity of PTEN-WT in the analogue group was decreased(P < 0.01). ConclusionsThe miR-20a plays an important role in the regulation of cell proliferation and invasion, and affects the growth and invasion of pituitary adenoma cells.It may regulate the PI3K/AKT signaling pathway and participate in the disease progression of pituitary adenoma by regulating the expression of PTEN. -
表 1 miR-20a对大鼠垂体瘤细胞系增殖的影响(x±s)
分组 n Day0 Day1 Day2 Day3 Day4 抑制物对照组 3 0.204±0.013 0.241±0.011 0.356±0.049 0.579±0.051 0.763±0.076 抑制物组 3 0.196±0.014 0.226±0.009** 0.293±0.011** 0.393±0.011** 0.548±0.006** 类似物对照组 3 0.207±0.009 0.241±0.010 0.380±0.017 0.611±0.021 0.809±0.019 类似物组 3 0.210±0.016 0.394±0.021△△ 0.676±0.017△△ 1.008±0.047△△ 1.375±0.063△△ F — 0.65 98.18 112.00 148.38 147.91 P — >0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.000 0.019 0.087 0.201 0.374 q检验: 与抑制物对照组比较**P < 0.01;与类似物对照组比较△△P < 0.01 表 2 miR-20a对人垂体瘤细胞系增殖的影响(x±s)
分组 n Day0 Day1 Day2 Day3 Day4 抑制物对照组 3 0.214±0.013 0.31±0.012 0.449±0.055 0.666±0.059 0.901±0.09 抑制物组 3 0.205±0.015 0.244±0.010** 0.328±0.012** 0.453±0.012** 0.647±0.007** 类似物对照组 3 0.217±0.010 0.311±0.010 0.475±0.020 0.703±0.024 0.954±0.022 类似物组 3 0.220±0.016 0.425±0.023△△ 0.757±0.019△△ 1.159±0.054△△ 1.623±0.074△△ F — 0.68 76.48 101.55 148.83 149.05 P — >0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.000 0.017 0.099 0.265 0.521 q检验: 与抑制物对照组比较**P < 0.01;与类似物对照组比较△△P < 0.01 表 3 miR-20a对垂体腺瘤细胞侵袭的影响(x±s)
分组 n GH3细胞系 HP75细胞系 抑制物对照组 3 65.36±6.54 71.81±17.18 抑制物组 3 40.58±9.56* 49.51±10.92** 类似物对照组 3 68.37±6.84 69.66±16.97 类似物组 3 111.37±11.14△△ 123.41±12.34△△ F — 34.00 13.95 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 2 593.132 2 979.998 q检验:与抑制物对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01;与类似物对照组比较△△P < 0.01 表 4 miR-20a对垂体腺瘤GH3细胞系与增殖相关蛋白表达的影响(x±s)
分组 n PI3K AKT MAPK 抑制物对照组 3 2.721±0.373 3.670±0.631 2.261±0.269 抑制物组 3 1.091±0.249** 1.017±0.220** 0.990±0.27** 类似物对照组 3 2.725±0.287 3.679±0.515 2.316±0.214 类似物组 3 5.111±0.481△△ 8.119±0.969△△ 4.868±0.750△△ F — 63.85 63.02 42.08 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 8.223 26.021 7.931 q检验:与抑制物对照组比较**P < 0.01;与类似物对照组比较△△P < 0.01 表 5 miR-20a对垂体腺瘤HP75细胞系与增殖相关蛋白表达的影响(x±s)
分组 n PI3K AKT MAPK 抑制物对照组 3 4.328±0.565 3.670±0.333 2.543±0.363 抑制物对照组 3 4.328±0.565 3.670±0.333 2.543±0.363 抑制物组 3 1.016±0.350** 1.017±0.248** 1.009±0.315** 类似物对照组 3 4.331±0.709 3.679±0.515 2.587±0.536 类似物组 3 8.144±0.912△△ 8.119±0.969△△ 4.575±0.961△△ F — 57.34 75.60 17.79 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 25.465 26.021 6.412 q检验:与抑制物对照组比较**P < 0.01;与类似物对照组比较△△P < 0.01 表 6 miR-20a对垂体腺瘤GH3细胞系与迁移相关蛋白表达的影响(x±s)
分组 n E-Cad MMP2 MMP9 抑制物对照组 3 3.567±0.502 2.339±0.524 4.417±0.989 抑制物组 3 1.000±0.294** 0.993±0.246** 0.993±0.364** 类似物对照组 3 3.607±0.487 2.372±0.414 4.480±0.478 类似物组 3 7.13±0.763△△ 5.283±0.334△△ 9.976±1.377△△ F — 65.73 63.50 51.19 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 19.018 9.814 41.421 q检验:与抑制物对照组比较**P < 0.01;与类似物对照组比较△△P < 0.01 表 7 miR-20a对垂体腺瘤HP75细胞系与迁移相关蛋白表达的影响(x±s)
分组 n E-Cad MMP2 MMP9 抑制物对照组 3 4.693±0.785 2.058±0.462 3.909±0.876 抑制物组 3 0.992±0.283** 1.011±0.264** 0.993±0.246** 类似物对照组 3 4.697±0.614 2.088±0.352 3.964±0.788 类似物组 3 9.362±1.409△△ 4.649±0.676△△ 8.828±1.332△△ F — 46.09 33.33 39.26 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 35.256 7.192 31.645 q检验:与抑制物对照组比较**P < 0.01;与类似物对照组比较△△P < 0.01 表 8 双荧光素酶报告基因分析证实miR-20a对PTEN的负调控(x ±s)
分组 n PTEN-WT PTEN-MUT 类似物对照组 3 0.976±0.117 0.945±0.079 类似物组 3 0.482±0.061 1.027±0.070 t — 6.48 1.35 P — < 0.01 >0.05 -
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