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全球约有3 300万例患有不同类别心房颤动的病人[1]，每年新发心房颤动的病人人数仍然在不断增长，疾病负担越来越重[2]。心房颤动反复发作，会导致心房内血栓的形成，增加脑卒中等疾病的发生风险，对病人生活质量以及生存率产生严重的影响[3]。心房颤动的发生机制仍不十分清楚[4]。活化T细胞信号转导的钙调神经磷酸酶(CaN/NFAT)通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联通路是细胞信号通路中的重要成员[5]，与心房重构及心肌纤维化有着密切的联系，而结缔组织生长因子(CTGF)是促进心肌纤维化的重要成员，其促纤维化过程与MAPK通路存在一定联系[6]。研究[7]发现，通过钙调神经磷酸酶抑制剂和活化T细胞因子阻滞剂能够有效抑制心肌肥大大鼠模型的心房重构，但是其在心房颤动病人中如何表达至今仍不清楚。研究[8-9]发现，MAPK通路的激活可导致心肌肥大、纤维化和细胞凋亡，而抑制其信号通路的传递可能通过减少CTGF的表达减轻心肌纤维化的程度。本研究观察心房颤动病人血清中活化T细胞核因子c1(NFATc1)、MAPK水平及外周血中CTGF的表达，探讨心房颤动发生的相关机制，为心房颤动病人的治疗提供理论依据。
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选取2019年12月至2020年12月在蚌埠医学院第一附属医院住院治疗的心房颤动病人139例作为房颤组，选取同期窦性心律的健康体检者105名作为对照组。房颤组入选及分组依据参照2020年ESC/EACTS心房颤动诊断管理指南[10]。排除以下疾病：肥厚型心肌病、重症感染、起搏器植入病人、心电复律病人；其他类型心律失常病人；各类恶性肿瘤、慢性肾病、结缔组织病及近1个月的手术史等病人。2组受试者年龄、性别、脑梗病史、高血压史、糖尿病史等一般资料差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 1)，具有可比性。
分组 n 年龄/岁 男 女 脑梗死 高血压 糖尿病 房颤组 139 63.17±12.05 76 63 29 69 35 对照组 105 63.54±11.64 48 57 32 47 21 χ2 — 0.24△ 1.92 2.95 0.57 0.91 P — >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 △示t值 表 1 2组一般资料比较(n)
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采用酶联免疫吸附试验测定受试者血清NFATc1、MAPK水平[11]，入院次日抽取病人静脉血5 mL，送至中心实验室，室温下3 000 r/min离心15 min，提取上层血清后密封放入-80 ℃冰箱保存检测，下层血液用于提取单个核细胞。设空白孔、标准孔和样品孔，加入10 μL血清样本，然后放入37 ℃烘干箱中反应70 min，弃液、甩干、洗涤，反复5次，再加入显色剂放入37 ℃烘干箱中反应15 min，最后用酶标测量仪测定血清NFATc1和血清MAPK水平。
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采用留取的外周血液标本，用PBS稀释2倍，加入淋巴细胞分离液，2 000 r/min离心20 min，吸出中层单个核细胞，用PBS重悬细胞，再次4 ℃、1 500 r/min离心10 min，弃去上清，重复2次，将提取出的单个核细胞加入配置好的冻存液，-80 ℃冰箱保存。
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使用提取的单个核细胞，加入RIPA裂解液提取总蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，脱脂牛奶封闭，一抗孵育置入4 ℃冰箱过夜，二抗室温孵育，最后将膜曝光、显影。利用Image J软件分析条带灰度值，计算样品与内参灰度值的比值。
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于我院检验科收集2组受试者的白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血小板计数(PLT)、低密度脂蛋白(LDL)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、血肌酐(SCr)等血生化指标。于我院心脏彩超室收集2组受试者心脏彩超的左心室射血分数(LVEF)和左心房内径(LAD)。
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采用t检验、χ2检验、Pearson相关分析和logistic回归分析。
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2组WBC、RBC、PLT、SCr差异均无统计学意义(P>0.05)；房颤组ALT、AST水平均明显高于对照组(P < 0.01)(见表 2)。
分组 n WBC/(×109/L) RBC/(×1012/L) PLT/(×109/L) ALT/(IU/L) AST/(IU/L) SCr/(μmol/L) 房颤组 139 5.78±1.78 4.42±0.43 193.60±42.62 26.14±17.53 30.22±18.65 66.22±24.70 对照组 105 5.72±1.23 4.48±0.62 184.80±42.53 22.06±4.26 24.34±4.48 62.10±8.51 t — 0.27 0.89 1.60 2.34 3.16 1.63 P — >0.05 >0.05 >0.05 < 0.01 < 0.01 >0.05 表 2 2组生化指标比较(x±s)
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房颤组血清NFATc1、MAPK水平均明显高于对照组(P < 0.01)；房颤组LAD明显高于对照组(P < 0.01)，LVEF明显低于对照组(P < 0.01)(见表 3)。
分组 n NFATc1/ (pg/mL) MAPK/ (pg/mL) LVEF/mm LAD/mm 房颤组 139 215.06±59.52 51.72±16.27 54.76±9.13 37.82±7.92 对照组 105 138.03±33.53 34.77±12.40 57.56±6.34 32.68±6.04 t — 11.91 8.90 2.69 5.54 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 表 3 2组血清NFATc1、MAPK水平及心脏彩超检查指标比较(x±s)
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房颤组CTGF表达水平(CTGF/β-actin为2.86±0.07)高于正常组(CTGF/β-actin为2.55±0.08)(t=32.20, P < 0.05)。
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Pearson相关分析显示，血清NFATc1、MAPK水平与LVEF均呈明显负相关关系(r=-0.195、-0.189，P < 0.01)，与LAD均呈明显正相关关系(r=0.288、0.244，P < 0.01)。
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以有无心房颤动为因变量，单因素分析差异有统计学意义的指标NFATc1、MAPK、LAD、LVEF为自变量，二元logistics回归分析结果显示，NFATc1、MAPK水平升高及LAD增大均为心房颤动发病的危险因素(P < 0.01)(见表 4)。
因素 B SE Waldχ2 P OR 95%CI NFATc1 0.029 0.005 35.489 < 0.01 1.03 1.02~1.04 MAPK 0.045 0.014 10.018 < 0.01 1.05 1.02~1.08 LAD 0.100 0.031 10.546 < 0.01 1.11 1.04~1.17 LVEF 0.027 0.027 1.302 >0.05 1.03 0.98~1.08 表 4 二元logistics回归分析结果
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心房颤动作为一种常见的临床心律失常，存在血栓形成、脑卒中、进行性心力衰竭、心脏骤停等严重并发症风险，严重影响国民生命健康[12]。既往研究[13]表明，其发生的危险因素主要包括左心房增大、左心房功能下降、心力衰竭和左心室收缩功能障碍等。GUPTA等[14]运用超声心动图对971例心房颤动病人进行左心房结构和功能评估，结果表明，大部分心房颤动病人(55%)的左心房增大，LVEF降低，左心房大小与LVEF呈反比。此外，尽管左心房大小和窦性节律正常，但仍会存在左房功能障碍，提示对左心房功能的评估可能为心房颤动病人的评估提供了重要信息。本研究和既往研究结果一致，心房颤动组病人LAD较对照组明显增加，且LVEF降低，提示心房颤动病人的心脏结构及功能已经发生一定损害。此外，本研究中，2组ALT和AST水平差异有统计学意义。有研究者[15-16]通过队列研究发现，ALT和AST与心房颤动发生风险显著相关，但目前相关机制尚未进一步明确。心房颤动的发生也与炎症同样存在密切关系，心脏成纤维细胞可被炎症介质和与全身炎症相关的生长因子激活[17]，促进心房颤动的发生和维持。
活化T细胞核因子(NFAT)广泛分布于人体的各个组织细胞中，主要通过CaN-NFAT通路调节组织与细胞的各项功能，包括NFAT1(NFATp/NFATc2)、NFAT2(NFATc、NFATc1)、NFAT3(NFATc4)、NFAT4(NFATx、NFATc3)、NFAT5[18]。有学者[19]通过心房颤动动物模型第一次证明CaN/NFAT通路在心房颤动中被激活。进而有研究[20]发现心房颤动病人心房组织中的calpain2、CaN和CaN受体以及NFATc3的表达均明显升高，进一步证实NFAT在心房颤动中的重要作用。XIAO等[21]通过建立心肌纤维化小鼠模型，发现通过抑制CaN/NFATc1通路可以对心肌肥厚和纤维化产生保护作用。本研究通过检测心房颤动病人血清中NFATc1的含量同样也证实了心房颤动病人的血清NFATc1的含量高于窦性心律组，说明心房颤动病人体内与NFATc1相关的通路是被明显激活的。本研究中相关分析显示，血清中NFATc1的含量与LAD呈正相关关系，提示心房颤动的发生与心脏重构与心肌纤维化存在一定的关联，但具体的相关机制仍需进一步研究。
WU等[8]发现MAPK信号通路的激活可导致心肌肥大、纤维化和细胞凋亡，抑制信号通路的传递可减轻心肌纤维化的程度。CTGF作为参与心肌纤维化的重要成员主要诱导成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，造成细胞外基质的沉积[22]，因而成为近年来的研究热点。HONG等[23]研究发现，敲除CTGF基因可使MAPK通路失活，减轻大鼠的心肌纤维化。LI等[24]研究同样表明，CTGF在心房颤动病人的心房纤维化的结构重塑中发挥重要作用。但其在心房颤动病人血清中如何表达仍不清楚。本研究通过检测2组受试者MAPK和CTGF的表达变化，发现心房颤动病人MAPK和CTGF水平明显高于对照组，进一步相关分析结果显示，血清MAPK的水平与LAD呈正相关关系，提示MAPK和CTGF水平可能与心肌纤维化有关。
综上所述，血清中NFATc1、MAPK水平升高与心房颤动相关，其水平升高可在一定程度上提示心房颤动的发生，MAPK通路下游的CTGF在心房颤动病人外周单个核细胞中的表达同样升高，血清NFATc1、MAPK水平与LAD、LVEF存在相关性，提示心房颤动的发生与心肌纤维化及心脏重构有着一定的关联，血清中NFATc1、MAPK水平升高及左房内径的增大可能是心房颤动发病的危险因素。
NFATc1、MAPK及CTGF在心房颤动病人外周血中的表达及临床意义
Expression and clinical significance of NFATc1, MAPK and CTGF in peripheral blood of patients with atrial fibrillation
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摘要:
目的探讨活化T细胞核因子c1(NFATc1)、丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)及结缔组织生长因子(CTGF)在心房颤动病人外周血中的表达及其临床意义。 方法选取心房颤动病人139例作为心房颤动组(房颤组)，选取同期窦性心律的健康体检者105名作为对照组。采用酶联免疫吸附试验检测2组血清中NFATc1、MAPK水平，Western blotting检测外周血单个核细胞中CTGF的表达。比较2组受试者血生化指标及心脏彩超检查指标。分析NFATc1、MAPK与左心室射血分数(LVEF)、左心房内径(LAD)的相关性，探讨心房颤动发病的危险因素。 结果房颤组丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、NFATc1、MAPK、CTGF水平及LAD均高于对照组(P < 0.05~P < 0.01)，LVEF明显低于对照组(P < 0.01)。Pearson相关分析显示，血清NFATc1、MAPK水平与LVEF均呈明显负相关关系(r=-0.195、-0.189，P < 0.01)，与LAD呈明显正相关关系(r=0.288、0.244，P < 0.01)。二元logistics回归分析结果显示，NFATc1、MAPK水平升高及LAD增大均为心房颤动发病的危险因素(P < 0.01)。 结论心房颤动病人血清中NFATc1、MAPK、CTGF水平的升高可能与心肌纤维化有关。 -
关键词:
- 心房颤动 /
- 活化T细胞核因子c1 /
- 丝裂原激活蛋白激酶 /
- 结缔组织生长因子
Abstract:ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of nuclear factor of activated T cells c1(NFATc1), mitogen-activated protein kinase(MAPK), and connective tissue growth factor(CTGF) in peripheral blood of patients with atrial fibrillation. MethodsA total of 139 patients with atrial fibrillation were selected as the atrial fibrillation group, and 105 healthy examinees with sinus rhythm were selected as the control group.The levels of NFATc1 and MAPK in serum were detected by enzyme-linked immunosorbent assay, and the expression of CTGF in peripheral blood mononuclear cells was determined by Western blotting.The blood biochemical indexes and cardiac color Doppler ultrasound indexes in the two groups were compared.The correlation between NFATc1, MAPK and left ventricular ejection fraction(LVEF), left atrial diameter(LAD) was analyzed, and the risk factors of atrial fibrillation were explored. ResultsThe levels of alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, NFATc1, MAPK, CTGF and LAD in the atrial fibrillation group were higher than those in the control group(P < 0.05 to P < 0.01), and the level of LVEF was significantly lower than that in the control group(P < 0.01).Pearson correlation analysis showed that the levels of serum NFATc1 and MAPK were significantly negatively correlated with LVEF(r=-0.195, -0.189, P < 0.01), and positively correlated with LAD(r=0.288, 0.244, P < 0.01).The binary logistic regression analysis showed that the increased levels of NFATc1, MAPK and LAD were the risk factors of atrial fibrillation(P < 0.01). ConclusionsThe increase of serum NFATc1, MAPK and CTGF levels in patients with atrial fibrillation may be related to myocardial fibrosis. -
表 1 2组一般资料比较(n)
分组 n 年龄/岁 男 女 脑梗死 高血压 糖尿病 房颤组 139 63.17±12.05 76 63 29 69 35 对照组 105 63.54±11.64 48 57 32 47 21 χ2 — 0.24△ 1.92 2.95 0.57 0.91 P — >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 △示t值 
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表 2 2组生化指标比较(x±s)
分组 n WBC/(×109/L) RBC/(×1012/L) PLT/(×109/L) ALT/(IU/L) AST/(IU/L) SCr/(μmol/L) 房颤组 139 5.78±1.78 4.42±0.43 193.60±42.62 26.14±17.53 30.22±18.65 66.22±24.70 对照组 105 5.72±1.23 4.48±0.62 184.80±42.53 22.06±4.26 24.34±4.48 62.10±8.51 t — 0.27 0.89 1.60 2.34 3.16 1.63 P — >0.05 >0.05 >0.05 < 0.01 < 0.01 >0.05
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表 3 2组血清NFATc1、MAPK水平及心脏彩超检查指标比较(x±s)
分组 n NFATc1/ (pg/mL) MAPK/ (pg/mL) LVEF/mm LAD/mm 房颤组 139 215.06±59.52 51.72±16.27 54.76±9.13 37.82±7.92 对照组 105 138.03±33.53 34.77±12.40 57.56±6.34 32.68±6.04 t — 11.91 8.90 2.69 5.54 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
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表 4 二元logistics回归分析结果
因素 B SE Waldχ2 P OR 95%CI NFATc1 0.029 0.005 35.489 < 0.01 1.03 1.02~1.04 MAPK 0.045 0.014 10.018 < 0.01 1.05 1.02~1.08 LAD 0.100 0.031 10.546 < 0.01 1.11 1.04~1.17 LVEF 0.027 0.027 1.302 >0.05 1.03 0.98~1.08
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