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多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是临床中较常见的一种内分泌疾病，影响育龄期妇女的身体和心理健康。PCOS在临床表现方面异质性明显，主要以月经失调、不孕、高雄激素血症、卵巢多囊样改变为特征，常伴有糖脂代谢的异常，如肥胖和胰岛素抵抗等[1]。PCOS病人不孕的原因主要是排卵障碍、卵子质量差等[2]，应用促排卵药物后，排卵率可高达90%[3]。然而，PCOS病人接受胚胎移植后流产率较高[4]，这可能与PCOS病人子宫内膜容受性降低有关。有学者[5]通过蛋白组学研究发现，PCOS病人子宫内膜基因的差异性表达与其子宫内膜容受性差密切相关，进而可能直接影响PCOS病人的生育能力。子宫内膜容受性是影响胚胎种植成功与否的重要因素之一，因此，探讨PCOS病人于胚胎种植窗口期的子宫内膜容受性是否改变具有重要临床意义。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及组织金属蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)在不同时期的子宫内膜中的表达具有差异性，这可能与子宫内膜功能相关。本研究通过检测MMP-9、MMP-2及TIMP-1在PCOS病人促排卵后种植窗口期的表达情况，探讨PCOS病人子宫内膜容受性的变化。现作报道。
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选择2019年1-12月潍坊医学院附属医院生殖医学中心收治的符合PCOS诊断标准的原发不孕病人12例(经促排卵有排卵)作为PCOS组，年龄20~32岁。选择同期就诊的月经正常因男方因素不孕病人15例作为对照组，年龄20~32岁。2组均不伴有其他基础疾病，年龄具有可比性。本研究通过医院伦理委员会批准，所有参与者均签署知情同意书。
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PCOS组病人在月经自然来潮第5天，月经稀少或闭经的病人在用孕酮撤退性出血后第5天，每晚口服氯米芬50 mg，连续口服5 d。2组病人均从月经周期第10天开始，通过阴道彩色超声监测卵泡生长情况。取2组病人分泌中期(即胚胎种植窗口期)的子宫内膜，于排卵后第7天，由固定医师采用小号刮匙刮取子宫前后壁少量内膜。将新鲜子宫内膜组织立即用10%甲醛固定，常规石蜡包埋切片后，行HE和免疫组织化学染色，依据Noyes标准判定组织学分期。子宫内膜MMP-2、MMP-9及TIMP-1测定采用免疫组织化学Envision超敏二步法，阴性对照采取PBS代替一抗，用已知标本作阳性对照。其中兔抗人MMP-2多克隆抗体及兔抗人MMP-9多克隆抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司；兔抗人TIMP-1多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
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根据细胞质内是否有棕色颗粒将结果分为4个等级：阴性(-)，细胞质内无棕色或棕黄色颗粒分布，且同背景颜色无差别；弱阳性(+)，细胞质内可见较浅的黄色或棕黄色颗粒分布；阳性(2+)，细胞质内见中等强度的棕黄色颗粒分布，且清晰；强阳性(3+)，细胞质内见明显棕黄色颗粒，且量多。采用图像软件Image pro-Plus对每张切片的光密度值进行分析测量。在显微镜400倍视野下，每张切片选5个阳性组织视野，测量每个视野的光密度值，选空白区定标，计算平均光密度(AOD)，AOD值越大说明染色越强。每张切片均由相同的2位病理医师采用单盲法评估，取结果的平均值。
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采用t检验。
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MMP-2、MMP-9、TIMP-1在对照组及PCOS组的内膜组织中均呈阳性表达，在间质细胞和腺上皮细胞的细胞质内均有棕黄色颗粒沉着，以腺上皮的表达为主(见图 1)。PCOS组子宫内膜腺上皮MMP-2、MMP-9及TIMP-1表达均明显低于对照组(P < 0.01)，子宫内膜间质MMP-9表达亦低于对照组(P < 0.05)(见表 1)。
图 1 不同时期子宫内膜及MMP-2、MMP-9、TIMP-1在对照组和PCOS组内膜组织中表达
分组 n MMP-2 MMP-9 TIMP-1 腺上皮 PCOS组 12 0.221±0.012 0.237±0.012 0.247±0.018 对照组 15 0.251±0.033 0.278±0.015 0.301±0.023 t — 2.99 7.69 6.66 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 间质 PCOS组 12 0.102±0.015 0.092±0.015 0.099±0.021 对照组 15 0.095±0.032 0.107±0.017 0.105±0.012 t — 0.70 2.40 0.93 P — >0.05 < 0.05 >0.05 表 1 2组病人子宫内膜MMP-2、MMP-9及TIMP-1表达比较(x±s)
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不孕症的发病率逐年上升，其病因复杂，具体发病机制不清，PCOS占不孕症病因的18%~25%[6]。无排卵或排卵障碍是PCOS的临床表现之一，应用促排卵治疗后，PCOS病人的排卵率可以得到较好改善，然而其妊娠结局并不容乐观。有研究[4]发现，与其他因素导致的不孕症相比，PCOS病人接受胚胎移植后临床妊娠率无显著差异，而流产率较高。YANG等[7]报道PCOS病人早期妊娠丢失率高达41%。有推测这可能是由于胚胎种植水平存在问题，不管是在自然受孕还是辅助生殖技术中，胚胎植入都是精细且复杂的环节，是影响妊娠成败的关键因素[8]。
子宫内膜容受性和胚胎质量是临床对病人进行胚胎移植前必须要评估的因素，是决定胚胎植入能否成功的两大关键因素[9]。子宫内膜随月经周期呈动态变化，子宫内膜容受性是指子宫内膜接受胚胎的能力，是胚胎植入过程的重要组成部分[10]。子宫内膜接受胚胎的时间(即子宫内膜“种植窗口期”)，在分泌中期即排卵后的第7~9天，这一时期，子宫内膜在分子和细胞水平上发生一系列精细而迅速的变化，子宫内膜具有最大的容受性，可接受胚胎并介导胚胎植入过程[11]。
细胞外基质降解在细胞的迁移、侵袭等生物学过程中起着非常重要的作用，此过程是胚胎植入的基本过程。基质金属蛋白酶(MMPs)存在于母-胎界面滋养层细胞，是细胞外基质降解的重要促进因素。TIMPs为MMPs的特异性抑制物，正常状态下二者保持动态平衡。MMPs的活性受TIMPs的严格控制[12]，母-胎界面滋养层细胞中的各种MMPs和TIMPs分子表达具有特异的空间和时间变化[13]。TIMP-1是哺乳动物子宫组织中表达最强的TIMPs，可以调节MMP-9的合成和活性。MMPs各成员在胚胎植入各个阶段的参与水平尚不清楚，以MMP-9和MMP-2在胚胎着床中研究最多[14]。小鼠模型研究[15]发现，MMP-9可以在胚胎植入前调节滋养细胞，从而对胚胎着床产生重要影响。YU等[16]研究发现，双调蛋白在妊娠早期对滋养细胞侵袭力的影响，是通过上调MMP-9表达水平来发挥作用的，这一过程增强了滋养细胞的侵袭能力，从而促进胚胎着床过程。本课题组前期研究[17]发现，在子宫内膜腺上皮中，分泌中期MMP-9、MMP-2及TIMP-1的表达明显高于增殖期。MMP-9、MMP-2和TIMP-1比例失衡可以导致细胞的侵袭力发生异常，从而有可能会导致早期自然流产、子痫前期等疾病的发生[18]。罗希等[19]发现体外受精-胚胎移植成功妊娠者的MMP-9表达远远高于未妊娠者。HE等[20]研究结果表明，胚胎着床失败组MMP-2、MMP-9水平低于正常妊娠组，MMP-2、MMP-9在子宫内膜中低表达可以影响子宫内膜蜕膜化及子宫内膜和胎盘血管的形成，致母体和胚胎之间循环建立受阻，导致妊娠失败。本研究结果显示，PCOS病人在接受促排卵治疗以后，于胚胎种植窗口期时子宫内膜腺上皮及间质中都有MMP-9、MMP-2和TIMP-1的表达，以腺上皮中的表达为主，但表达水平明显比对照组低。
综上，MMP-9、MMP-2和TIMP-1在PCOS病人子宫内膜中低表达，其可能参与了子宫内膜容受性下降的发生、发展过程，阻碍了胚胎植入过程，可能是引起PCOS病人低妊娠率与高流产率的原因之一。但其具体机制还不清楚，有待在今后的研究中，进一步探讨细胞外MMPs诱导因子表达情况，探讨其如何调节MMP-2、MMP-9与TIMP-1之间的平衡关系，可能将会对改善PCOS病人的妊娠结局有重要临床意义。
MMP-2、MMP-9及TIMP-1在多囊卵巢综合征病人种植窗口期内膜的表达及其临床意义
Expression of MMP-2、MMP-9 and TIMP-1 in endometrium of PCOS patients during the implantation window phase and its clinical significance
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摘要:
目的 检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及组织金属蛋白酶抑制物-1(TIMP-1)在多囊卵巢综合征(PCOS)病人种植窗口期子宫内膜组织中的表达情况，并探讨其临床意义。 方法 选择接受促排卵后治疗的PCOS病人(PCOS组)12例和因男方因素不孕且月经正常前来就诊病人(对照组)15例，检测2组排卵后第7天子宫内膜组织中MMP-9、MMP-2和TIMP-1蛋白表达情况，利用病理图像分析技术，对实验结果进行半定量分析。 结果 MMP-9、MMP-2和TIMP-1在2组子宫内膜组织中均呈阳性表达，在间质细胞和腺上皮细胞的细胞质内均有棕黄色颗粒物沉着，以腺上皮表达为主。PCOS组子宫内膜腺上皮MMP-2、MMP-9及TIMP-1表达均明显低于对照组(P < 0.01)，子宫内膜间质MMP-9表达亦低于对照组(P < 0.05)。 结论 MMP-9、MMP-2和TIMP-1在PCOS组病人的种植窗口期子宫内膜中的表达水平较低，这可能是导致PCOS病人采用促排卵治疗后妊娠率低、流产率高的原因之一。 -
关键词:
- 多囊卵巢综合征 /
- 子宫内膜 /
- 基质金属蛋白酶-2 /
- 基质金属蛋白酶-9 /
- 组织金属蛋白酶抑制物-1
Abstract:Objective To investigate the expression of matrix metalloproteinase(MMP)-9, MMP-2 and matrix metalloproteinase inhibitor-1(TIMP-1) in endometrium of polycystic ovary syndrome(PCOS) patients during the implantation window phase, and to explore its significance. Methods A total of 12 patients with PCOS who received post ovulation induction treatment(PCOS group) and 15 patients with infertility due to male factors and normal menstruation(control group) were selected.The expressions of MMP-9, MMP-2 and TIMP-1 proteins in endometrial tissue of the two groups on the seventh day after ovulation were detected.The pathology image analysis technology was employed to conduct the semi-quantitative analysis. Results The expressions of MMP-9, MMP-2 and TIMP-1 in the two groups in endometrium were positive, and the brown granule cell pigmentation was found in the glandular epithelial cells and stromal cells cytoplasm, especially in the former ones.The expressions of MMP-2, MMP-9 and TIMP-1 in endometrial glandular epithelium in PCOS group were significantly lower than those in control group(P < 0.01), and the expression of MMP-9 in endometrial stroma was also lower than that in control group(P < 0.05). Conclusions The low expression of MMP-9, MMP-2 and TIMP-1 in the implantation window phase of endometrium may be one of the causes of low pregnancy and high abortion rate in PCOS patients undergoing ovulation induction treatment. -
表 1 2组病人子宫内膜MMP-2、MMP-9及TIMP-1表达比较(x±s)
分组 n MMP-2 MMP-9 TIMP-1 腺上皮 PCOS组 12 0.221±0.012 0.237±0.012 0.247±0.018 对照组 15 0.251±0.033 0.278±0.015 0.301±0.023 t — 2.99 7.69 6.66 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 间质 PCOS组 12 0.102±0.015 0.092±0.015 0.099±0.021 对照组 15 0.095±0.032 0.107±0.017 0.105±0.012 t — 0.70 2.40 0.93 P — >0.05 < 0.05 >0.05 
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