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非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)传统治疗方式主要包括放疗、化疗、手术等,据统计病人的5年生存率仅约15%[1]。已知NSCLC细胞的迁移和侵袭能力与病人的预后密切相关,因此,有必要深入研究调控NSCLC细胞迁移和侵袭的关键因子,为NSCLC的治疗提供新思路[2-4]。目前已发现许多具有迁移能力的癌细胞都存在Wiskott-Aldrich综合征蛋白家族成员3(WASF3)高表达的情况,WASF3的功能与细胞运动有关,可参与神经元迁移、创伤修复以及细胞应激等过程[5],在正常细胞中处于沉默状态,WASF3基因的异常表达通过调节肌动蛋白细胞骨架重组,诱导了恶性肿瘤的发生、发展[6-7],因此推测该基因或成为降低癌细胞迁移能力的重要靶向目标,目前该基因在NSCLC中的表达及其作用机制目前尚不明确。有研究[8-11]证实,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路是促进肺癌细胞间充质转化进程的主要调节途径,可使肿瘤细胞运动及迁移能力增强。本研究选择NSCLC病人A549细胞和正常肺细胞MRC-5为研究对象,比较2种细胞中WASF3表达水平;设计针对WASF3的反义寡核苷酸(WASF3-AS),通过质粒转染A549细胞,观察其对A549细胞增殖和迁移能力的影响,并探讨其作用机制。现作报道。
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RT-qPCR实验结果显示,与人正常肺细胞MRC-5比较,A549细胞各组中WASF3的mRNA相对表达量均增加(P < 0.05~P < 0.01);空白对照组和WASF3-NC组的WASF3的mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05),但均高于WASF3-AS组(P < 0.05和P < 0.01)(见表 1)。
分组 n WASF3 MRC-5 3 0.12±0.02 空白对照组 3 1.36±0.13* WASF3-NC组 3 1.43±0.20* WASF3-AS组 3 0.50±0.11*#△△ F — 274.38 P — < 0.01 MS组内 — 0.919 q检验:与MRC-5比较*P < 0.05;与空白对照组比较#P < 0.05;与WASF3-NC组比较△△P < 0.01 表 1 各组细胞中WASF3表达水平比较(x±s)
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转染后24 h,3组A549细胞增殖水平之间差异无统计学意义(P>0.05);与WASF3-NC组比较,转染后48、72、96 h WASF3-AS组细胞增殖水平明显降低(P < 0.05)(见表 2)。
分组 n 转染后细胞培养时间 24 h 48 h 72 h 96 h 空白对照组 3 0.899±0.091 1.238±0.074 1.493±0.347 1.841±0.283 WASF3-NC组 3 0.866±0.073 1.549±0.194 1.805±0.164 1.956±0.204 WASF3-AS组 3 0.832±0.066 0.636±0.050*# 0.711±0.055*# 0.825±0.071*# F — 3.05 193.10 277.54 203.44 P — >0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.002 4.837 0.663 1.737 q检验:与空白对照组比较*P < 0.05;与WASF3-NC组比较#P < 0.05 表 2 A549各组细胞增殖能力(吸光度值)比较(x±s)
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细胞转染14 d后,观察培养皿中克隆形成结果显示,与空白对照组和WASF3-NC组比较,WASF3-AS组细胞克隆形成率和细胞迁移数目均明显降低(P < 0.05)(见表 3及图 1、2)。
分组 n 细胞克隆形成率/% 细胞迁移数目 空白对照组 3 0.80±0.07 325.86±56.48 WASF3-NC组 3 0.71±0.06 308.42±40.67 WASF3-AS组 3 0.22±0.03*# 35.97±5.08*# F — 101.52 846.33 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 2.107 0.875 q检验:与空白对照组比较*P < 0.05;与WASF3-NC组比较#P < 0.05 表 3 A549各组细胞克隆形成率和细胞迁移数目比较(x±s)
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与空白对照组比较,WASF3-NC组PTEN、PI3K、p-Akt mRNA和蛋白相对表达量差异均无统计学意义(P>0.05);与WASF3-NC组比较,WASF3-AS组细胞的PTEN mRNA和蛋白相对表达量明显增加,PI3K、p-Akt mRNA和蛋白相对表达量明显减少,差异均有统计学意义(P < 0.05)(见表 4、图 3)。
分组 n PTEN PI3K p-Akt mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 空白对照组 3 1.14±0.34 0.98±0.39 1.64±0.25 1.87±0.31 1.46±0.33 1.40±0.62 WASF3-NC组 3 1.56±0.27 1.14±0.25 1.05±0.22 1.98±0.38 1.58±0.26 1.32±0.54 WASF3-AS组 3 2.75±0.08*# 3.77±0.81*# 0.59±0.06*# 0.66±0.12*# 0.88±0.17*# 0.53±0.20*# F — 96.51 182.84 194.50 203.86 135.71 79.30 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 1.964 0.283 0.854 1.033 3.946 0.620 q检验:与空白对照组比较*P < 0.05;与WASF3-NC组比较#P < 0.05 表 4 各组A549细胞中PTEN、PI3K、p-Akt mRNA和蛋白相对表达量比较(x±s)
WASF3反义寡核苷酸对非小细胞肺癌细胞增殖和迁移的影响及其机制
Study on the effects of WASF3 antisense oligonucleotides on the proliferation and migration of non-small cell lung cancer and its mechanism
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摘要:
目的探讨Wiskott-Aldrich综合征蛋白家族成员3的反义寡核苷酸(WASF3-AS)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖和迁移的影响及其作用机制。 方法RT-qPCR法检测人NSCLC细胞株A549细胞和人正常肺细胞MRC-5中WASF3的表达水平。将A549细胞分为空白对照组、WASF3-NC组(阴性对照组)、WASF3-AS组(反义寡核苷酸WASF3组),应用RT-qPCR法检测WASF3-AS对A549细胞中WASF3表达的影响;应用CCK-8法检测细胞增殖能力,克隆实验检测细胞克隆能力,Transwell法检测细胞迁移能力;RT-qPCR和Western blotting法分别检测WASF3-AS对A549细胞中磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(p-Akt)mRNA和蛋白表达水平。 结果与人正常肺细胞MRC-5比较,A549细胞各组中WASF3的mRNA相对表达量均增加(P < 0.05~P < 0.01);空白对照组和WASF3-NC组的WASF3的mRNA相对表达量差异无统计学意义(P>0.05),但均高于WASF3-AS组(P < 0.05和P < 0.01)。与WASF3-NC组比较,转染后48、72、96 h WASF3-AS组细胞增殖水平明显降低(P < 0.05)。细胞转染14 d后,与空白对照组和WASF3-NC组比较,WASF3-AS组细胞克隆形成率和细胞迁移数目均明显降低(P < 0.05)。与WASF3-NC组比较,WASF3-AS组细胞的PTEN mRNA和蛋白相对表达量明显增加,PI3K、p-Akt mRNA和蛋白相对表达量明显减少(P < 0.05)。 结论人NSCLC细胞的WASF3表达水平明显高于正常肺细胞;WASF3-AS可能通过调控PTEN-PI3K/Akt信号通路,抑制NSCLC的增殖、克隆和迁移。 -
关键词:
- 非小细胞肺癌 /
- Wiskott-Aldrich综合征蛋白 /
- 反义寡核苷酸
Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of antisense oligonucleotides of Wiskott-Aldrich syndrome protein family member 3(WASF3-AS) on the proliferation and migration of non-small cell lung cancer(NSCLC) cells and its mechanism. MethodsThe expression levels of WASF3 in human NSCLC cell lung cancer cell line A549 and human normal lung cell MRC-5 were detected using RT-qPCR. The A549 cells were divide into the blank control group, WASF3-NC group(negative control group) and WASF3-AS group(antisense oligonucleotide WASF3 group). The effects of WASF3-AS on the WASF3 expression in A549 cells were detected using RT-qPCR. The CCK-8 method was used to detect the cell proliferation ability, the cloning experiment was used to detect the cell cloning ability, and the Transwell method was used to detect the cell migration ability. The mRNA and protein levels of the phosphatase and tensin homolog(PTEN), phosphatidylinositol-3-kinase(PI3K) and protein kinase B(p-Akt) in A549 cells of three groups were detected using RT-qPCR and Western blotting, respectively. ResultsCompared with the human normal lung cells MRC-5, the mRNA expression levels of WASF3 in three group increased(P < 0.05 to P < 0.01). There was no statistical significance in the mRNA expression level of WASF3 between the blank control group and WASF3-NC group(P>0.05), but it was higher than that of WASF3-AS group(P < 0.05 and P < 0.01). Compared with the WASF3-NC group, the proliferation levels of cells in WASF3-AS group significantly decreased after 48, 72 and 96 h of transfection(P < 0.05). After 14 days of cell transfection, the clone formation rate and number of cell migration in WASF3-AS group significantly decreased compared with the blank control group and WASF3-NC group(P < 0.05). Compared with the WASF3-NC group, the expression levels of PTEN mRNA and protein in WASF3-AS group significantly increased, while the expression levels of PI3K and p-Akt mRNA and protein significantly decreased(P < 0.05). ConclusionsThe expression level of WASF3 in human NSCLC cells is significantly higher than that in normal lung cells. The WASF3-AS may inhibit the proliferation, cloning and migration of NSCLC by regulating the PTEN-PI3K/Akt signaling pathway. -
表 1 各组细胞中WASF3表达水平比较(x±s)
分组 n WASF3 MRC-5 3 0.12±0.02 空白对照组 3 1.36±0.13* WASF3-NC组 3 1.43±0.20* WASF3-AS组 3 0.50±0.11*#△△ F — 274.38 P — < 0.01 MS组内 — 0.919 q检验:与MRC-5比较*P < 0.05;与空白对照组比较#P < 0.05;与WASF3-NC组比较△△P < 0.01 表 2 A549各组细胞增殖能力(吸光度值)比较(x±s)
分组 n 转染后细胞培养时间 24 h 48 h 72 h 96 h 空白对照组 3 0.899±0.091 1.238±0.074 1.493±0.347 1.841±0.283 WASF3-NC组 3 0.866±0.073 1.549±0.194 1.805±0.164 1.956±0.204 WASF3-AS组 3 0.832±0.066 0.636±0.050*# 0.711±0.055*# 0.825±0.071*# F — 3.05 193.10 277.54 203.44 P — >0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.002 4.837 0.663 1.737 q检验:与空白对照组比较*P < 0.05;与WASF3-NC组比较#P < 0.05 表 3 A549各组细胞克隆形成率和细胞迁移数目比较(x±s)
分组 n 细胞克隆形成率/% 细胞迁移数目 空白对照组 3 0.80±0.07 325.86±56.48 WASF3-NC组 3 0.71±0.06 308.42±40.67 WASF3-AS组 3 0.22±0.03*# 35.97±5.08*# F — 101.52 846.33 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 2.107 0.875 q检验:与空白对照组比较*P < 0.05;与WASF3-NC组比较#P < 0.05 表 4 各组A549细胞中PTEN、PI3K、p-Akt mRNA和蛋白相对表达量比较(x±s)
分组 n PTEN PI3K p-Akt mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 空白对照组 3 1.14±0.34 0.98±0.39 1.64±0.25 1.87±0.31 1.46±0.33 1.40±0.62 WASF3-NC组 3 1.56±0.27 1.14±0.25 1.05±0.22 1.98±0.38 1.58±0.26 1.32±0.54 WASF3-AS组 3 2.75±0.08*# 3.77±0.81*# 0.59±0.06*# 0.66±0.12*# 0.88±0.17*# 0.53±0.20*# F — 96.51 182.84 194.50 203.86 135.71 79.30 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 1.964 0.283 0.854 1.033 3.946 0.620 q检验:与空白对照组比较*P < 0.05;与WASF3-NC组比较#P < 0.05 -
[1] ZHU J, ZENG Y, LI W, et al. CD73/NT5E is a target of miR-30a-5p and plays an important role in the pathogenesis of non-small cell lung cancer[J]. Mol Cancer, 2017, 16(1): 34. doi: 10.1186/s12943-017-0591-1 [2] 任丽坤, 王瑜, 庞世杰, 等. miRNA-34a反义寡核苷酸对非小细胞肺癌细胞HCC827的影响[J]. 中国医师杂志, 2020, 22(2): 211. [3] 桂坤, 黄昱, 王美锦, 等. miR-100-5p靶向mTOR信号通路调控人非小细胞肺癌A549细胞自噬[J]. 中国老年学杂志, 2021, 41(23): 5301. [4] 李娟. NOX4通过调控PI3K/Akt信号促进NSCLC细胞增殖[D]. 广州: 广东药科大学, 2016. [5] SHIBUYA N, KAKEJI Y, SHIMONO Y. MicroRNA-93 targets WASF3 and functions as a metastasis suppressor in breast cancer[J]. Cancer Science, 2020, 111(6): 2093. doi: 10.1111/cas.14423 [6] NIE YL, LIANG XJ, LIU SH, et al. MicroRNA-93 targets WASF3 and functions as a metastasis suppressor in breast cance WASF3 Knockdown Sensitizes Gastric Cancer Cells to Oxaliplatin by Inhibiting ATG12-Mediated Autophagy[J]. Am J Med Sci, 2020, 359(5): 287. doi: 10.1016/j.amjms.2020.02.007 [7] 李殿明, 柳兆飞, 宁国兰. let-7a1和let-7c在非小细胞肺癌中的表达及临床意义[J]. 蚌埠医学院学报, 2021, 46(3): 285. [8] WANG FF, MENG F, WONG SC, et al. Combination therapy of gefitinib and miR-30a-5p may overcome acquired drug resistance through regulating the PI3K/AKT pathway in non-small cell lung cancer[J]. Ther Adv Respirat Dis, 2020, 14: 217. [9] ZHANG SC, XU ZL, YUAN J, et al. Ubiquitin-specific peptidase 17 promotes cisplatin resistance via PI3K/AKT activation in non-small cell lung cancer[J]. Oncol Letters, 2020, 20(1): 67. doi: 10.3892/ol.2020.11568 [10] 李玲霞, 张英民. 蜂毒素靶向PTEN/PI3K/Akt信号通路调控非小细胞肺癌细胞的增殖、凋亡[J]. 吉林中医药, 2020, 40(4): 514. [11] 姜军. MKRN2通过PI3K/Akt信号通路抑制非小细胞肺癌迁移和侵袭的研究[D]. 沈阳: 中国医科大学, 2019. [12] 汤建华, 冯平, 张志华, 等. 下调miR-92a对非小细胞肺癌细胞增殖及血管生成因子表达的影响[J]. 临床与实验病理学杂志, 2019, 35(1): 38. [13] 王博谦, 何龙, 毕晓军, 等. 膀胱癌miRNA-21对PTEN调控作用研究[J]. 临床军医杂志, 2017, 45(4): 343. [14] WANG GJ, FU Y, LIU GH, et al. miR-218 Inhibits Proliferation, Migration, and EMT of Gastric Cancer Cells by Targeting WASF3[J]. Oncol Res, 2017, 25(3): 355. doi: 10.3727/096504016X14738114257367 [15] 张生义, 张己为, 张旭峰, 等. 华蟾素对非小细胞肺癌细胞株A549细胞增殖及PTEN/AKT/mTOR信号通路表达的影响[J]. 蚌埠医学院学报, 2020, 45(9): 1159. [16] 陶星宇. SHIP1调控PI3K/AKT通路抑制非小细胞肺癌的增殖与迁移[D]. 广州: 南方医科大学, 2018. [17] 朱茜文, 安海燕, 张亚平. miR-363-3p靶向PIK3CA调节非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭和迁移[J]. 中国免疫学杂志, 2020, 36(12): 1473.