-
痛风性关节炎是由单钠尿酸盐(monosodium urate, MSU)晶体沉积引发的关节炎症性疾病,该过程由先天免疫系统吸引、激活巨噬细胞和中性粒细胞所介导。中性粒细胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)是指包含细胞外DNA骨架、组蛋白和中性粒细胞髓过氧化物酶、中性粒细胞弹性蛋白酶或钙颗粒蛋白等的细胞外网状纤维结构,其形成是中性粒细胞经感染或其他刺激后,刺激物作用于中性粒细胞使其细胞内DNA与细胞质、颗粒内容物等一起被挤压、排出细胞外,以捕获和消除细胞外病原体,对机体早期抗感染免疫具有重要作用,但过度的中性粒细胞激活与各种情况下的机体炎症反应及自身免疫性疾病有关,包括类风湿关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)和痛风[1-2]。尽管在体外和动物模型体内[3]均证实局部NETs形成在痛风发病中起关键作用,但NETs在痛风病人周围血中的表达水平及其与痛风疾病活动度的关系尚未得到深入研究。因此,本研究通过检测痛风急性期病人和健康人周围血血清中NETs的表达水平,来进一步研究痛风病人中性粒细胞激活的证据及中性粒细胞来源的生物标志物NETs在痛风病人疾病活动度方面的临床意义。
-
痛风组:收集我院2019年10月至2021年4月风湿科病房及门诊痛风急性发作病人40例,均为男性,其中使用秋水仙碱组19例,未使用秋水仙碱组21例。纳入标准:根据2015年ACR-EULAR痛风分类诊断标准[4],总分≥8分诊断为痛风。排除标准:入组病人需除外其他风湿免疫性疾病、骨关节病、血栓相关疾病及近期感染性疾病病史。健康对照组:收集我院上述同期健康体检者24名,均为男性,无风湿病及家族史,无肿瘤及其他基础疾病史,近期无感染病史。2组间血尿酸、肌酐、红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、白细胞(WBC)、中粒细胞百分比(N%)差异有统计学意义(P < 0.05),2组间年龄、24 h尿尿酸、尿pH等差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 1)。本研究通过安徽医科大学附属六安医院医学伦理委员会批准,所有受试者均签署知情同意书。
分组 n 年龄/岁 男 病程/月 血尿酸/ (μmol/L) 肌酐/ (μmol/L) 24 h尿尿酸/ (μmol/24 h) 尿pH值 ESR/(mm/h) 痛风组 40 50.58±13.61 40 97.70±108.12 465.23±178.66 95.21±39.69 2 059.30±1 726.22 5.81±0.58 30.62±28.82 对照组 24 48.08±8.73 24 — 236.26±62.79 72.29±10.79 2 161.08±813.00 5.83±0.55 11.29±4.73 t — 0.89 — — 7.38 3.45 0.32 0.14 4.15 P — >0.05 — — < 0.05 < 0.05 >0.05 >0.05 < 0.05 分组 n CRP/(mg/L) WBC/(×109/L) N/% PLT/(×109/L) TG/(mmol/L) TCH/(mmol/L) GLU/(mmol/L) 痛风组 40 52.93±52.71 10.21±3.89 72.65±12.39 257.85±66.66 1.89±3.65 4.65±1.21 5.81±1.11 对照组 24 4.33±1.70 7.72±1.69 60.68±8.20 250.42±63.53 1.14±0.56 4.45±0.74 5.55±0.74 t — 5.83 3.50 4.64 0.44 1.00 0.73 1.06 P — < 0.05 < 0.05 < 0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 表 1 入组研究对象的临床特征
-
使用人NETSELISA试剂盒(上海纪宁):(1)采集2组受试者静脉血5 mL于EDTA抗凝管中,离心后血浆放于-40 ℃冰箱保存待测,避免反复冻融;(2)确定测试所需样品所需的微孔条数,每个样品、标准和空白应一式两份;(3)添加样品:分别设置空白孔(不添加样品和ELISA试剂,其他步骤操作相同),将标准或样品的50 μL添加到抗体预涂微滴板的适当孔中,并轻轻混合,在37 ℃孵育45 min;(4)配置液:用蒸馏水稀释30倍的洗涤液备用;(5)洗涤:取出液体,用摆动干燥,在每个孔中加入洗涤缓冲液,静置30 s后取出,重复4次;(6)加入生物素化抗IgG:在所有孔中加入稀释的生物素化抗IgG 50 μL,在37 ℃孵育30 min;(7)洗涤:同(5)的操作;(8)添加链霉亲和素-HRP:在所有孔中加入链霉亲和素-HRP 50 μL,在37 ℃轻轻混合孵育15 min;(9)清洗:同(5)的操作;(10)染色:先加入显色液A 50 μL,然后在每口井中加入显色液B 50 μL,在37 ℃孵育15 min;(11)停止反应:在每口井中加入Solution 50 μL,停止反应(蓝色立即变为黄色);(12)测定:取空白和零,加入停止溶液后在450 nm处测量光学密度(OD),15 min内测量;(13)计算结果:平均每个标准、控制和样品的重复读数,并减去平均零标准光密度。通过绘制y轴上每个标准的平均吸光度与y轴上的浓度的关系,构建一条标准曲线,通过图上的点绘制一个最佳拟合曲线。这一程序将产生足够但不太精确的数据拟合。如果样品已被稀释,从标准曲线读取的浓度必须乘以稀释因子。
-
均由我院检验科相关仪器测得,血尿酸、肌酐、CRP、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、血糖(GLU),由贝克曼AU5800生化仪测得;24 h尿尿酸,由VITR4600生化仪测得;尿pH值由优利特US2000尿常规自动分析仪测得;ESR由Caretium-xc-A30魏氏法测得;WBC、N%、血小板(PLT)由希森美康XN9000自动血常规分析仪测得。
-
采用t检验和Pearson相关分析。
-
痛风组NETs的浓度(2 119.62±1 843.36)pg/mL高于健康对照组(1 894.66±113.52)pg/mL,差异有统计学意义(t=3.64,P < 0.01)。
-
痛风组血清NETs水平与ESR值呈正相关(P < 0.05),与CRP值呈正相关(P < 0.01), 与病程、血尿酸、肌酐、24 h尿尿酸、尿pH、WBC、N%、PLT、TG、TCH、GLU均无相关性(P>0.05)(见表 2)。
临床指标 NETs水平 r P 病程 0.059 >0.05 血尿酸 -0.298 >0.05 肌酐 -0.095 >0.05 24 h尿尿酸 0.124 >0.05 尿pH值 -0.068 >0.05 ESR 0.348 < 0.05 CRP 0.509 < 0.01 WBC 0.040 >0.05 N% -0.118 >0.05 PLT 0.025 >0.05 TG 0.055 >0.05 TCH -0.040 >0.05 GLU 0.151 >0.05 表 2 痛风急性期病人周围血NETs水平与临床指标的相关性分析
-
未服用秋水仙碱组血清NETs浓度(2 138.24±173.60)pg/mL, 高于服用秋水仙碱组(2 099.05±196.23)pg/mL,但差异无统计学意义(t=0.67,P>0.05)。
痛风病人周围血中性粒细胞外诱捕网的测定及其意义
Determination of peripheral blood neutrophil extracellular traps and its significance in patients with gout
-
摘要:
目的 比较中性粒细胞外诱捕网(NETs)在痛风病人与健康对照组血清中表达水平的差异,以探讨NETs在痛风中可能存在的作用。 方法 用MPO-DNA ELISA法进行间接定量检测40例痛风病人和24名健康对照者周围血血清中游离NETs水平并分析其差异,同时分析痛风病人周围血NETs水平与血清红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)、尿酸、病程等指标的相关性,及使用秋水仙碱组(19例)和未使用秋水仙碱组(21例)痛风病人血清中NETs水平的差异。 结果 痛风组NETs的浓度(2 119.62±1 843.36)pg/mL高于健康对照组(1 894.66±113.52)pg/mL,差异有统计学意义(P < 0.01)。痛风组血清NETs水平与ESR值呈正相关(P < 0.05),与CRP值呈正相关(P < 0.01),与血尿酸、病程等均无相关性(P>0.05)。未服用秋水仙碱组痛风病人血清NETs浓度(2 138.24±173.60)pg/mL高于服用秋水仙碱组(2 099.05±196.23)pg/mL,但差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 中性粒细胞可能通过一种新的死亡方式,即网捕死亡形成NETs,参与痛风性关节炎的发病,血清NETs水平可能与痛风疾病活动度有关。 Abstract:Objective To compare the expression levels of neutrophil extracellular traps(NETs) between gout patients and healthy controls, and explore the possible role of NETs in gout. Methods The serum levels of free NETs in 40 gout patients and 24 healthy controls were detected by MPO-DNA ELISA, and the association between serum NETs and ESR, CRP, uric acid, length of the course of the disease were analyzed. The difference of the serum level of NETs between the colchicine group(19 cases) and noncolchicine group(21 cases) was compared. Results The serum levels of NETs in gout group[(2 119.62±1 843.36)pg/mL] were significantly higher than that in healthy control group[(1 894.66±113.52)pg/mL](Ρ < 0.01). The serum level of NETs in gout group was positively correlated with ESR and CRP(P < 0.05 and P < 0.01), but not correlated with uric acid and length of the course of the disease(P>0.05). The serum level of NETs in gout group treated without colchicine[(2 138.24±173.60) pg/mL] was high compared with the gout group treated with colchicine[(2 099.05±196.23) pg/mL], but the difference of which was not statistically significant(P>0.05). Conclusions The neutrophils may be involved in the pathogenesis of gout arthritis by forming NETs in a new mode of death. The serum level of NETs may be related to the gout disease activity. -
Key words:
- arthritis /
- gout /
- neutrophil extracellular traps
-
表 1 入组研究对象的临床特征
分组 n 年龄/岁 男 病程/月 血尿酸/ (μmol/L) 肌酐/ (μmol/L) 24 h尿尿酸/ (μmol/24 h) 尿pH值 ESR/(mm/h) 痛风组 40 50.58±13.61 40 97.70±108.12 465.23±178.66 95.21±39.69 2 059.30±1 726.22 5.81±0.58 30.62±28.82 对照组 24 48.08±8.73 24 — 236.26±62.79 72.29±10.79 2 161.08±813.00 5.83±0.55 11.29±4.73 t — 0.89 — — 7.38 3.45 0.32 0.14 4.15 P — >0.05 — — < 0.05 < 0.05 >0.05 >0.05 < 0.05 分组 n CRP/(mg/L) WBC/(×109/L) N/% PLT/(×109/L) TG/(mmol/L) TCH/(mmol/L) GLU/(mmol/L) 痛风组 40 52.93±52.71 10.21±3.89 72.65±12.39 257.85±66.66 1.89±3.65 4.65±1.21 5.81±1.11 对照组 24 4.33±1.70 7.72±1.69 60.68±8.20 250.42±63.53 1.14±0.56 4.45±0.74 5.55±0.74 t — 5.83 3.50 4.64 0.44 1.00 0.73 1.06 P — < 0.05 < 0.05 < 0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 表 2 痛风急性期病人周围血NETs水平与临床指标的相关性分析
临床指标 NETs水平 r P 病程 0.059 >0.05 血尿酸 -0.298 >0.05 肌酐 -0.095 >0.05 24 h尿尿酸 0.124 >0.05 尿pH值 -0.068 >0.05 ESR 0.348 < 0.05 CRP 0.509 < 0.01 WBC 0.040 >0.05 N% -0.118 >0.05 PLT 0.025 >0.05 TG 0.055 >0.05 TCH -0.040 >0.05 GLU 0.151 >0.05 -
[1] HAHN J, KNOPF J, MAUERODER C, et al. Neutrophils and neutrophil extracellular traps orchestrate initiation and resolution of inflammation[J]. Clin Exp Rheumatol, 2016, 34(4 Suppl 98): 6. [2] LEE KH, KRONBICHLER A, PARK DD, et al. Neutrophil extracellular traps(NETs) in autoimmune diseases: a comprehensive review[J]. Autoimmun Rev, 2017, 16(11): 1160. doi: 10.1016/j.autrev.2017.09.012 [3] PIETERSE E, JEREMIC I, CZEGLEY C, et al. Blood-borne phagocytes internalize urate microaggregates and prevent intravascular NETosis by urate crystals[J]. Sci Rep, 2016, 6: 38229. doi: 10.1038/srep38229 [4] NEOGI T, JANSEN TL, DALBETH N, et al. 2015 Gout classification criteria: an American college of rheumatology/european league against rheumatism collaborative initiative[J]. Arthritis Rheumatol, 2015, 67(10): 2557. doi: 10.1002/art.39254 [5] MITROULIS I, KAMBAS K, RITIS K. Neutrophils, IL-1β, and gout: is there a link?[J]. Semin Immunopathol, 2013, 35(4): 501. doi: 10.1007/s00281-013-0361-0 [6] VEDDER D, GERRITSEN M, DUVVURI B, et al. Neutrophil activation identifies patients with active polyarticular gout[J]. Arthritis Res Ther, 2020, 22(1): 148. doi: 10.1186/s13075-020-02244-6 [7] DUVVURI B, LOOD C. Cell-free DNA as a biomarker in autoimmune rheumatic diseases[J]. Front Immunol, 2019, 10: 502. doi: 10.3389/fimmu.2019.00502 [8] BACH M, MOON J, MOORE R, et al. A neutrophil activation biomarker panel in prognosis and monitoring of patients with rheumatoid arthritis[J]. Arthritis Rheumatol, 2020, 72(1): 47. doi: 10.1002/art.41062 [9] 满达夫, 侯云霞, 李鸿斌. 尿酸对急性发作期痛风病人外周血中性粒细胞胞外诱捕网形成的影响及其临床意义[J]. 山西医科大学学报, 2021, 52(3): 356. [10] MOORE S, JUO HH, NIELSEN CT, et al. Neutrophil extracellular traps identify patients at risk of increased disease activity and cardiovascular comorbidity in systemic lupus erythematosus[J]. J Rheumatol, 2019, 190875. [11] LOOD C, BLANCO LP, PURMALEK MM, et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease[J]. Nat Med, 2016, 22(2): 146. doi: 10.1038/nm.4027 [12] LOOD C, HUGHES GC. Neutrophil extracellular traps as a potential source of autoantigen in cocaine-associated autoimmunity[J]. Rheumatology(Oxford), 2017, 56(4): 638. [13] SIL P, WICKLUM H, SURELL C, et al. Macrophage-derived IL-lβ enhances monosodium urate crystal-triggered NET formation[J]. Inflamm Res, 2017, 66(3): 227. doi: 10.1007/s00011-016-1008-0 [14] SAYARLIOGLU H, DOGAN E, ERKOC R, et al. The effect of colchicine on the peritoneal membrane[J]. Ren Fail, 2006, 28(1): 69. doi: 10.1080/08860220500461286 [15] DALBETH N, LAUTERIO TJ, WOLFE HR. Mechanism of action of colchicine in the treatment of gout[J]. Clin Ther, 2014, 36(10): 1465. doi: 10.1016/j.clinthera.2014.07.017