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皮肤鳞状细胞癌(鳞癌)约占所有非黑素瘤皮肤癌的20%，是继基底细胞癌之后第二大常见非黑素瘤皮肤癌[1]。非黑素瘤皮肤癌中不同类型肿瘤的相对比例正在发生变化，与基底细胞癌相比，皮肤鳞癌的发病率呈上升趋势，在老年人群中其增长趋势尤其显著[2]。虽然多数病人通过手术联合放疗可以有效治疗皮肤鳞癌，但是对于转移病人预后不佳[3]。对于皮肤鳞癌发病机制的深入研究尤为重要。微小RNA(microRNA，miR)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，通常在转录后发挥作用，通过抑制翻译过程或降解靶mRNA来调节蛋白质表达。miR与几乎所有正常细胞功能相关，广泛参与包括增殖、分化和凋亡在内的各种细胞活动。miR-127位于母系印迹基因Dlk1/Gt12区域内[4]，主要受到小异二聚体配体和雌激素相关受体γ等核受体信号的调控[5]，其在结直肠癌、急性髓性白血病以及骨肉瘤等肿瘤中表达明显升高[6-8]。但目前对于miR-127在皮肤鳞癌中的研究较少，本研究通过检测miR-127在皮肤鳞癌、癌旁组织中的表达水平差异，同时调控miR-127在皮肤鳞癌细胞系中的表达，探讨miR-127对皮肤鳞癌细胞的生物学行为调控作用，为临床诊疗提供参考。现作报道。
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收集2017年8月至2021年6月间于蚌埠医学院第一附属医院皮肤科确诊的21例皮肤鳞癌病人的鳞癌标本及周边正常皮肤组织，所有收集标本均经病理检查明确诊断及肿瘤细胞恶性程度判定。本研究经过我院伦理委员会批准，所有标本提供者均签署知情同意书。HaCaT细胞、A431细胞以及HSC-5细胞均购自美国模式培养物集存库。
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Trizol总RNA抽提试剂盒购自美国Invitrogen公司；Takara逆转录试剂盒购自宝生物工程(大连) 有限公司；SYBR GreenⅠ荧光染料试剂盒购于美国Thermofisher公司；miR-127引物购自于上海吉玛生物有限公司。
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使用Trizol法提取标本总RNA，并用Nano-Drop2000紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度(A260：A280)，后进行凝胶电泳，将琼脂糖胶置于BioRad GELDOC XR+凝胶成像扫描仪内扫描检测PCR产物。按照Takara逆转录试剂盒说明书要求将miR逆转录成cDNA，合成的cDNA产物直接用于PCR或保存于-20 ℃保存待用。采用SYBR GreenⅠ法进行miR-127的实时荧光定量检测。反应体系如下：miR-127逆转录产物2 μL，SYBR Green Mix 9 μL，上下游引物各1 μL，加入DEPC水将反应总体系配至20 μL。PCR反应程序如下，预变性：94 ℃ 5 min，变性：94 ℃ 30 s，退火：58 ℃ 30 s，延伸：72 ℃ 30 s，设置30个反应循环。同时将U6作为内参基因。miR-127逆转录引物为5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG GTA TTC GCA CTG GAT ACG AAG CCA A-3′；miR-127上游引物为5′-GCG GCT CGG ATC CGT CTG AGC T-30；miR-127下游引物为5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；U6上游引物为5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；U6下游引物为5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。每个实验重复进行3次，目的基因的相对表达量采用2-ΔΔCt法进行分析。
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采用细胞裂解液获得细胞总蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，将分离出的蛋白电转至硝酸纤维素膜，采用一抗封闭过夜，次日采用二抗孵育，后于ECL显影液中浸润，暗室中显影，采用Image J对蛋白条带测量灰度值。
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分别将miR-127模拟物(miR-127 agomir)，miR-127抑制物(miR-127 antagomir)以及各自对照试剂(NC agomir和NC antagomir)(上海吉玛生物技术公司)以及lipofectamine 3000(Thermo Fisher公司)充分混合后加入A431细胞中，37 ℃ 5% CO2恒温培养箱培育48 h后以供后续实验。
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采用CCK8法检测A431细胞的增殖能力，将105个细胞加入96孔板中，每孔加入10 μL CCK-8溶液，置入37 ℃ 5% CO2恒温培养箱培育，分别检测24、48以及72 h的吸光度值。
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将105个细胞加入铺有matrigel胶的transwell小室上层，小室下层加入10%FBS的细胞培养基，入37℃ 5% CO2恒温培养箱培育48 h后取出采用结晶紫染色，观察显微镜视野下的细胞数。
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根据预测结果克隆靶基因中含有的miR-127结合位点序列以及靶基因3′UTR中含有的miR-127结合位点序列，将以上序列分别插入到psiCHECK2载体中，构建荧光素酶报告基因载体。将miR-127 agomir或NC agomir分别与上述重组载体共转染HEK-293 T细胞，采用荧光素酶报告基因实验检测荧光强度。
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采用t检验、方差分析及q检验。
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采用qRT-PCR检测皮肤鳞癌组织以及癌旁组织中miR-127的表达水平，结果显示，miR-127在皮肤鳞癌组织中表达2.94±0.25，明显高于癌旁组织的1.17±0.17(t=10.14，P < 0.01)，在皮肤鳞癌组织中含量为癌旁组织的2.9倍。
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分别收集HaCaT细胞、A431细胞以及HSC-5细胞中的RNA，采用qRT-PCR检测3种细胞中miR-127的表达水平。相较于HaCaT细胞，miR-127表达水平在A431细胞以及HSC-5细胞中显著升高，差异有统计学意义(P < 0.05)(见表 1)。
分组 n miR-127相对平均表达水平 HaCaT 3 0.99±0.18 A431 3 2.11±0.70* HSC-5 3 2.15±0.32* F — 6.25 P — < 0.05 MS组内 — 0.208 q检验：与HaCaT细胞比较* P < 0.05 表 1 miR-127在HaCaT细胞、A431细胞以及HSC-5细胞中的相对表达水平
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分别将miR-127 agomir.miR-127 antagomir以及NC agomir和NC antagomir转染A431细胞，结果显示，上调miR-127表达后，A431细胞的增殖及侵袭能力显著增强；下调miR-127的表达后，A431细胞的增殖及侵袭能力受到抑制(P < 0.05)(见图 1、表 2)。
图 1 调控miR-127的表达水平对A431细胞增殖的影响
分组 n 视野内细胞数 上调表达 miR127 agomir 3 18.3±3.5 NC agomir 3 11.3±2.1 t — 2.97 P — < 0.05 下调表达 miR127 antagomir 3 7.3±2.5 NC antagomir 3 13.3±1.5 t — 3.53 P — < 0.05 表 2 调控miR-127后细胞侵袭能力比较(x ± s)
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通过生物信息学预测网站我们发现miR-127与抑癌基因PTEN存在结合位点，进一步通过双荧光素酶报告基因实验我们发现miR-127可以与PTEN直接结合(见图 2)。调控miR-127后PTEN在蛋白水平的表达发生改变，其中miR-127+PTEN组荧光素酶相对强度高于Control+PTEN组，Control+PTENmut组荧光素酶相对强度均高于miR-127+PTENmut组(P < 0.05)；miR-127 agomir组PTEN蛋白表达水平低于NC agomir组和NC antagomir组，miR-127 antagomir组PTEN蛋白表达水平高于NC agomir组和NC antagomir组(P < 0.05)(见表 3~4)。
图 2 miR-127与PTEN的预测结合位点
分组 n 荧光素酶相对强度 Control+PTEN 3 1.04±0.30 miR-127+PTEN 3 0.50±0.15* Control+PTENmut 3 1.11±0.18 miR-127+PTENmut 3 1.07±0.29# F — 4.35 P — < 0.05 MS组内 — 0.057 q检验：与Control+PTEN组比较* P < 0.05;与Control+PTENmut组比较# P < 0.05 表 3 调控miR-127后不同组荧光素酶相对强度比较(x ± s)
分组 n PTEN蛋白表达水平 miR-127 agomir 3 0.61±0.15*# NC agomir 3 1.10±0.14 miR-127 antagomir 3 2.09±0.29*# NC antagomir 3 1.07±0.15 F — 31.36 P — < 0.01 MS组内 — 0.037 q检验：与NC agomir组比较* P < 0.05；与NC antagomir组比较# P < 0.01 表 4 不同调控组PTEN蛋白表达水平(x ± s)
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miR是由双链RNA经过剪切、修饰后做得到的短链小分子RNA，一般长度在20~24个核苷酸。其自身通常不参与编码合成mRNA，而是在转录后水平参与靶基因调控过程。miR是近年来表观遗传学方面研究的热点，主要通过抑制它的靶基因来起调控作用，其作用遍及生命体的发生、生长、发育、分化和死亡的各个过程。许多研究已经证实多种miR在皮肤鳞癌中的表达量存在异常，如WANG等[9]研究发现皮肤鳞癌中miR-31表达异常增高，且miR-31可以调控皮肤鳞癌细胞的迁移及集落形成能力；MiR-216b可通过结合TPX2从而激活p53信号通路，抑制皮肤鳞癌的迁移、侵袭及成血管能力[10]。此外，还有研究[11]列举了miR-21、miR-205、miR-365、miR-31等miR，这些异常表达的miR可能与细胞增殖分化、凋亡、血管形成、肿瘤浸润及转移等多种功能相关。
对于miR-127在皮肤鳞癌作用的相关研究较少。miR-127与miR-431，miR-433、miR-127、miR-432和miR-136等属于同一簇，miR-127和miR-433存在重叠的基因区域，但拥有彼此独立的启动子，并且这2种miRNA的表达均受到雌激素相关受体γ诱导并且被小异源二聚体配体的抑制。有研究[12]表明miR-127在胎儿肺发育晚期期间表达水平最高，因此可能在此过程中发挥重要作用。此外，miR-127调节BCL6介导的CDKN1A的表达，在大鼠肝细胞中，miR-127的下调促进细胞增殖，而miR-127的上调抑制增殖[13]。在多种肿瘤细胞中，miR-127也参与其生物学功能调控。GUO等[14]发现miR-127在胃癌细胞中的表达水平受到抑制，而上调其表达可抑制肿瘤的生长。除了胃癌等实体肿瘤，miR-127可能在皮肤肿瘤中发挥作用，而在本研究中，我们对比了皮肤鳞癌组织与正常组织中miR-127的表达水平差异，结果发现在皮肤鳞癌组织中，miR-127的表达水平升高，提示miR-127可能参与了鳞癌细胞的发生发展过程，这个结果与CAI等[15]发现相一致。此外，我们通过体外调控miR-127的表达，结果发现皮肤鳞癌细胞的增殖和侵袭能力受到调控；同一miR可作用于多个靶基因，如miR-127可作用于DLK1从而影响黑素瘤的进展[16]，miR-127也可抑制Wnt7a的转录后翻译过程从而调控胃癌的生长[17]；而本研究进一步检测miR-127的作用靶基因，验证了miR-127可作用于PTEN的表达。
综上所述，本研究发现miR-127在皮肤鳞癌组织中表达显著上升，同时其表达水平与鳞癌细胞的生物学行为存在联系，且这种调控与作用于PTEN有关。因此我们认为miR-127可能作为一个潜在的分子生物学标志物，可能成为临床诊治的一个重要靶点。
miR-127对皮肤鳞状细胞癌细胞生物学行为调控作用研究
Study on the regulatory effects of miR-127 on biological behavior of cutaneous quamous cell carcinoma cells
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摘要:
目的探讨miR-127对皮肤鳞状细胞癌(鳞癌)细胞的生物学行为调控作用。 方法收集皮肤鳞癌组织、癌旁正常组织标本，采用实时定量PCR检测miR-127在2组标本中的表达水平。调控鳞癌细胞株A431中miR-127表达水平，检测鳞癌细胞增殖、侵袭能力的变化。通过生物信息学预测网站及分子生物学方法验证miR-127的作用靶点。 结果miR-127在皮肤鳞癌组织中表达明显高于癌旁组织(P < 0.01)。相较于HaCaT细胞，miR-127表达水平在A431细胞以及HSC-5细胞中显著升高，差异有统计学意义(P < 0.05)。上调miR-127表达后，A431细胞的增殖及侵袭能力显著增强；下调miR-127的表达后，A431细胞的增殖及侵袭能力受到抑制(P < 0.05)。通过双荧光素酶报告基因实验发现miR-127可以与PTEN直接结合，调控miR-127后PTEN在蛋白水平的表达发生改变(P < 0.05)。 结论miR-127参与调控鳞癌细胞的生物学行为，miR-127可能作为治疗皮肤鳞癌的一个潜在的靶点。 Abstract:ObjectiveTo investigate the regulatory effects of miR-127 on biological behavior of skin squamous cell carcinoma cells. MethodsThe samples of skin squamous cell carcinoma tissues and adjacent normal tissues were collected, and the expression levels of miR-127 in two groups were detected by real-time quantitative PCR.The expression level of miR-127 in squamous cell carcinoma cell line A431 was regulated to detect the changes of proliferation and invasion ability of squamous cell carcinoma cells.The targets of miR-127 were verified by bioinformatics prediction websites and molecular biological methods. ResultsThe expression level of miR-127 in skin squamous cell carcinoma tissues was significantly higher than that in adjacent tissues(P < 0.01).Compared with HaCaT cells, the expression levels of miR-127 in A431 cells and HSC-5 cells significantly increased, and the difference of which was statistically significant(P < 0.05).After up-regulating the expression of miR-127, the proliferation and invasion ability of A431 cells were significantly enhanced(P < 0.05).The proliferation and invasion ability of A431 cells were inhibited after down-regulating the expression of miR-127(P < 0.05).The results of dual luciferase reporter gene assay showed that the miR-127 could directly bind to PTEN, and the expression level of PTEN proetin was changed after regulating miR-127(P < 0.05). ConclusionsThe miR-127 is involved in the regulation of biological behavior of squamous cell carcinoma cells.miR-127 may be used as a potential molecular target in the treatment of skin squamous cell carcinoma. -
Key words:
- skin squamous cell carcinoma /
- miR-127 /
- proliferation /
- invasion
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表 1 miR-127在HaCaT细胞、A431细胞以及HSC-5细胞中的相对表达水平
分组 n miR-127相对平均表达水平 HaCaT 3 0.99±0.18 A431 3 2.11±0.70* HSC-5 3 2.15±0.32* F — 6.25 P — < 0.05 MS组内 — 0.208 q检验：与HaCaT细胞比较* P < 0.05 
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表 2 调控miR-127后细胞侵袭能力比较(x ± s)
分组 n 视野内细胞数 上调表达 miR127 agomir 3 18.3±3.5 NC agomir 3 11.3±2.1 t — 2.97 P — < 0.05 下调表达 miR127 antagomir 3 7.3±2.5 NC antagomir 3 13.3±1.5 t — 3.53 P — < 0.05
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表 3 调控miR-127后不同组荧光素酶相对强度比较(x ± s)
分组 n 荧光素酶相对强度 Control+PTEN 3 1.04±0.30 miR-127+PTEN 3 0.50±0.15* Control+PTENmut 3 1.11±0.18 miR-127+PTENmut 3 1.07±0.29# F — 4.35 P — < 0.05 MS组内 — 0.057 q检验：与Control+PTEN组比较* P < 0.05;与Control+PTENmut组比较# P < 0.05
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表 4 不同调控组PTEN蛋白表达水平(x ± s)
分组 n PTEN蛋白表达水平 miR-127 agomir 3 0.61±0.15*# NC agomir 3 1.10±0.14 miR-127 antagomir 3 2.09±0.29*# NC antagomir 3 1.07±0.15 F — 31.36 P — < 0.01 MS组内 — 0.037 q检验：与NC agomir组比较* P < 0.05；与NC antagomir组比较# P < 0.01
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