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荧光PCR法在围生期孕妇B族链球菌筛查中的应用及CAMP试验阴性B族链球菌分子特征分析

周杰 张莉 杨书才 张扬 康文荣 叶丽娴 王革非

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荧光PCR法在围生期孕妇B族链球菌筛查中的应用及CAMP试验阴性B族链球菌分子特征分析

    作者简介: 周杰(1985-),男,副主任技师
    通讯作者: 王革非, gefeiwang@stu.edu.cn
  • 基金项目:

    广东省深圳市坪山区卫生系统科研项目 201826

  • 中图分类号: R714.7

Application of fluorescent PCR in screening of group B streptococcus in perinatal pregnant women and analysis of molecular characteristics of group B streptococcus with negative CAMP test

    Corresponding author: WANG Ge-fei, gefeiwang@stu.edu.cn
  • CLC number: R714.7

  • 摘要: 目的探讨荧光聚合酶链反应(PCR)在围生期孕妇B族链球菌(GBS)筛查中的应用价值及CAMP试验阴性GBS的鉴定分析。方法收集产科门诊孕35~37周孕妇阴道/直肠拭子1 143例,将拭子放入GBS增菌肉汤管增菌,分别用GBS显色平板和荧光PCR法检测GBS。16SrDNA分子鉴定技术对CAMP试验阴性GBS进行种属鉴定,并采用PCR技术检测其cfb基因。结果显色平板检出146份阳性样本,阳性率为12.77%,荧光PCR法检出191份阳性样本,阳性率为16.71%,2种方法的阳性率差异有统计学意义(P<0.01);荧光PCR法与显色平板培养法相比,敏感性为93.15%、特异性为94.48%、符合率为94.31%。146株GBS中有10株为CAMP试验阴性,检出率为6.85%,均为cfb基因缺失株。结论荧光PCR法可有效提高围生期孕妇GBS筛查的阳性率;该地区CAMP试验阴性GBS检出率较高,CAMP试验不宜作为GBS的鉴别试验,因存在缺失cfb基因GBS,GBS分子检测试剂不应选择该段基因设计引物。
  • 图 1  显色平板培养法与荧光PCR法检测GBS

    图 2  CAMP试验阴性和阳性GBS(1~ 10示CAMP阴性GBS, “N"为阴性对照,“P”为阳性对照)

    图 3  CAMP试验阴性GBS的16SrDNA序列系统进化树

    图 4  编码CAMP因子的cfb基因扩增电泳及BLAST对比结果

    表 1  荧光PCR法与显色平板培养法检测结果比较(n)

    荧光PCR法 显色平板法 合计 χ2 P 敏感性/% 特异性/% 符合率/%
    阳性 阴性
    阳性 136 55 191
    阴性 10 942 952 7.05 < 0.01 93.15 94.48 94.31
    合计 146 997 1 143
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-03-14
  • 录用日期:  2022-09-01
  • 刊出日期:  2022-10-15

荧光PCR法在围生期孕妇B族链球菌筛查中的应用及CAMP试验阴性B族链球菌分子特征分析

    通讯作者: 王革非, gefeiwang@stu.edu.cn
    作者简介: 周杰(1985-),男,副主任技师
  • 1. 汕头大学医学院 病原与免疫学研究中心, 广东 汕头 515041
  • 2. 广东省深圳市坪山区人民医院(南方医科大学坪山总医院), 518118
基金项目:  广东省深圳市坪山区卫生系统科研项目 201826

摘要: 目的探讨荧光聚合酶链反应(PCR)在围生期孕妇B族链球菌(GBS)筛查中的应用价值及CAMP试验阴性GBS的鉴定分析。方法收集产科门诊孕35~37周孕妇阴道/直肠拭子1 143例,将拭子放入GBS增菌肉汤管增菌,分别用GBS显色平板和荧光PCR法检测GBS。16SrDNA分子鉴定技术对CAMP试验阴性GBS进行种属鉴定,并采用PCR技术检测其cfb基因。结果显色平板检出146份阳性样本,阳性率为12.77%,荧光PCR法检出191份阳性样本,阳性率为16.71%,2种方法的阳性率差异有统计学意义(P<0.01);荧光PCR法与显色平板培养法相比,敏感性为93.15%、特异性为94.48%、符合率为94.31%。146株GBS中有10株为CAMP试验阴性,检出率为6.85%,均为cfb基因缺失株。结论荧光PCR法可有效提高围生期孕妇GBS筛查的阳性率;该地区CAMP试验阴性GBS检出率较高,CAMP试验不宜作为GBS的鉴别试验,因存在缺失cfb基因GBS,GBS分子检测试剂不应选择该段基因设计引物。

English Abstract

  • B族链球菌(group B streptococcus, GBS)是革兰阳性兼性厌氧菌,常存在于胃肠道和泌尿生殖道内,为条件致病菌[1]。围生期孕妇阴道或直肠内GBS的定植率为10%~35%[2-3]。约有50%的GBS携带孕妇会把该菌传播给新生儿,在没有产前抗菌药物预防的情况下,1%~2%的新生儿会出现早发型GBS感染,表现为重症肺炎、败血症及化脓性脑膜炎,如不及时治疗会造成新生儿死亡或神经系统后遗症等严重不良后果[4-5]。美国自20世纪90年代开始对围生期孕妇进行GBS筛查,对携带GBS的孕妇产前应用抗菌药物预防,极大降低了新生儿GBS感染率[6]。细菌培养法是GBS筛查的金标准,目前围生期孕妇阴道/直肠拭子筛查GBS的方法主要为血平板培养法、显色平板培养法。但培养法存在耗时长、灵敏度低、影响因素多等缺点。本研究拟通过比较荧光聚合酶链反应(PCR)法与显色平板培养法筛查围生期孕妇阴道/直肠拭子的阳性率,分析荧光PCR法筛查GBS的可行性。现作报道。

    • 收集2020年4-12月产科门诊孕妇标本1 143份,年龄18~45岁,孕35~37周,由产科医生先用一次性棉拭子采集孕妇阴道下1/3处分泌物,再将同一拭子插入肛门内1~3 cm,旋转一圈后取出,1 h内送实验室。

    • VITEK-2型全自动细菌鉴定仪及鉴定卡(法国梅里埃),ABI7500荧光定量PCR仪(美国ABI);GBS增菌肉汤管(江门凯琳),GBS显色平板(郑州安图),GBS核酸检测试剂(深圳优康)。

    • 实验室接到样本后,将拭子放入GBS增菌肉汤管,于35 ℃培养箱增菌18~24 h。将增菌管内肉汤混匀,用一次性接种环取10 μL肉汤接种GBS显色平板,三区划线后将平板放入35 ℃、5% CO2培养箱。经24~48 h培养,从显色平板挑取红色或紫红色菌落转种血琼脂平板培养18~24 h,挑取菌落制备菌悬液后用细菌鉴定仪进行细菌鉴定。

    • 将接种后的增菌肉汤管放4 ℃冰箱冷藏,显色平板培养为阳性的增菌肉汤管用荧光PCR法单独检测。培养为阴性的增菌肉汤管,各吸取100 μL肉汤到无菌管中,每5个增菌肉汤管组成1组样本,用荧光PCR法检测,对检测为GBS阳性的混合样本,再单独对每个增菌肉汤管进行检测。荧光PCR法具体操作步骤如下:将含有增菌液的无菌管12 000 r/min离心5 min,取沉淀加入50 μL核酸提取液,震荡后3 000 r/min离心10 s,100 ℃孵育10 min,12 000 r/min离心5 min,上清液供PCR扩增用。阴性、阳性对照直接取50 μL,加入50 μL核酸提取液,其余操作步骤同样本。在准备好的PCR反应管中加入GBS反应液35.2 μL、Taq酶0.8 μL,然后分别加入4 μL待测样本和阴性、阳性对照处理液,盖上管盖3 000 r/min离心10 s。荧光PCR扩增程序为95 ℃ 3 min 1个循环,94 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s 40个循环。检测结果按照CT值≤38.0判为阳性,CT值>38.0~<40的样本重新上机,重做结果CT值< 40者为阳性,否则为阴性。

    • GBS通常产生CAMP因子,该因子能增强金黄色葡萄球菌的β溶血素溶解红细胞的能力,CAMP试验是指GBS和金黄色葡萄球菌的交界处溶血能力增加,出现箭矢型的透明溶血区。CAMP试验具体操作流程:用ATCC25923金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上划一条横线,GBS靠近金黄色葡萄球菌划一条竖线,然后将血琼脂平板放35 ℃温箱中培养18~24 h,观察其协同溶血现象。

    • CAMP试验阴性的GBS菌株送上海派诺森公司进行16SrDNA菌株测序,将测序数据提交到GenBank数据库进行比对分析,并利用MEGA7.0软件对同源相近的链球菌的16SrDNA序列构建进化树。为验证这些菌株是否为编码CAMP因子的cfb基因缺失所致,参照文献[7]中报道的cfb基因设计引物,引物序列为F: 5′-ATG ATG TAT CTA TCT GGA ACT CTA GTG-3′;R: 5′-CGC AAT GAA GTC TTT AAT TTT TC-3′。对分离的CAMP阴性GBS、2株临床分离CAMP阳性GBS、阴性对照、阳性对照进行cfb基因检测,预期目的基因片段大小为260 bp。基因扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳,将基因扩增产物送上海派诺森公司进行测序,将测序结果提交到GenBank数据库中进行BLAST比对。

    • 采用χ2检验。

    • GBS显色平板培养出146株GBS,阳性率为12.77%,荧光PCR法检出191例阳性标本,阳性率为16.71%,2种方法阳性率差异有统计学意义(P<0.01);荧光PCR法与显色平板培养法相比,敏感性为93.15%、特异性为94.48%、符合率为94.31%(见表 1)。显色平板培养法与荧光PCR法检测GBS阳性结果见图 1

      荧光PCR法 显色平板法 合计 χ2 P 敏感性/% 特异性/% 符合率/%
      阳性 阴性
      阳性 136 55 191
      阴性 10 942 952 7.05 < 0.01 93.15 94.48 94.31
      合计 146 997 1 143

      表 1  荧光PCR法与显色平板培养法检测结果比较(n)

      图  1  显色平板培养法与荧光PCR法检测GBS

    • 显色平板培养法检出146株GBS,其中10株荧光PCR法检测为阴性,将这10份GBS菌株的增菌肉汤管取出重新鉴定,均为GBS。对这10株GBS、阴性对照、阳性对照进行CAMP试验,10株GBS和阴性对照菌株为阴性,阳性对照菌株为阳性。阴性对照选用粪肠球菌ATCC29212,阳性对照选用B族链球菌ATCC13183(见图 2)。

      图  2  CAMP试验阴性和阳性GBS(1~ 10示CAMP阴性GBS, “N"为阴性对照,“P”为阳性对照)

    • 进化树分析结果显示,10株CAMP阴性菌株(GBS1-GBS10)与GBS(AB596948)聚为一类(见图 3)。电泳结果显示,2株CAMP阳性GBS和阳性对照有特异性条带,10株CAMP阴性GBS和阴性对照未出现特异性条带。阳性对照测序结果提交到GenBank数据库中进行BLAST比对,与cfb基因符合率为100%(见图 4)。2株CAMP阳性菌株含有cfb基因,10株CAMP阴性GBS未扩增出cfb基因,证实10株GBS表现为CAMP试验阴性是由cfb基因缺失导致。

      图  3  CAMP试验阴性GBS的16SrDNA序列系统进化树

      图  4  编码CAMP因子的cfb基因扩增电泳及BLAST对比结果

    • GBS可引起牛乳腺炎,最早为兽医界所关注。1938年首次报道3例病人死于GBS感染,证实该菌也可以感染人类。严重的围生期GBS感染最初被描述于20世纪60年代。20世纪70年代,GBS成为美国新生儿感染和死亡的主要病原菌[8]。围生期孕妇阴道/直肠携带的GBS,通过分娩时传播给新生儿,是新生儿感染GBS的主要途径。美国CDC于1996年发布了“预防围生期B族链球菌病指南”,该指南在2002年和2010年进行了更新,指南中明确指出对围生期孕妇进行阴道/直肠拭子GBS筛查,如为阳性,在产时进行抗菌药物预防,以降低新生儿感染率和死亡率[9]。20世纪90年代,美国通过基于围生期GBS筛查与产时抗菌药物使用来预防新生儿GBS感染,新生儿GBS早发型感染率从20世纪90年代初期的1.8/1 000下降到2010年的0.26/1 000[10]

      已有研究[11]显示,不同地区的孕妇GBS携带率有较大差异,非洲地区为18.1%~26.7%,美洲地区为16.7%~22.7%,欧洲地区为16.1%~22.0%,东南亚地区为6.8%~15.3%,这可能与GBS在不同人群携带率有差异和检测方法的不同有关。另一篇纳入多篇中国研究共44 716例孕妇的荟萃分析显示,中国孕妇GBS定植率为11.3%[12],本次的显色平板培养法12.77%的阳性率与之接近,但是低于荧光PCR法16.71%的阳性率。

      细菌培养法虽然是GBS筛查的金标准,但是存在耗时长、操作复杂等特点,分子生物学检测技术具有敏感度高、检测周期短等特点,目前已广泛应用于病原体检测。本次采用的荧光PCR法与显色平板培养法相比,敏感性、特异性及符合率均高于90%,是一种可以代替培养的方法。本次显色平板共分离出146株GBS,低于荧光PCR法检测出191份阳性标本,分析原因有以下两个方面,首先是显色平板培养法受方法学限制,只能取10 μL左右增菌肉汤进行培养,不然不利于单个菌落的分离,这远低于荧光PCR法用100 μL增菌肉汤进行基因扩增;其次是GBS增菌肉汤管只抑制革兰阴性杆菌,对革兰阳性球菌没有抑制作用,当标本中含有大量粪肠球菌和其他链球菌而只有少量GBS时,这些细菌通过竞争抑制GBS的增殖,从而在培养时造成漏检。

      CAMP反应是指GBS特异性地增加金黄色葡萄球菌对绵羊红细胞的溶解能力[13]。因CAMP反应具有很高的特异性,很久以来人们一直将是否出现CAMP现象作为实验室诊断GBS的一个重要依据[14]。以往文献[15-16]报道,绝大多数GBS含有编码CAMP因子的cfb基因,因此许多实验室和公司将cfb基因作为靶点设计引物,通过分子生物学技术检测围生期孕妇阴道/直肠拭子中GBS,本次荧光PCR法检测试剂也选用cfb基因设计引物。CAMP试验虽然是GBS的重要鉴别试验,但CAMP阴性的GBS偶尔也有报道,目前认为小于2%的GBS表现为CAMP阴性[17]。本次培养法分离的146株GBS中有10株为CAMP阴性,检出率为6.8%,并且这些菌株是编码CAMP因子的cfb基因缺失导致。GBS编码CAMP因子的cfb基因较高比例的缺失,说明本地区不宜采用cfb基因作为靶点设计引物检测围生期孕妇GBS,也不宜将CAMP试验作为鉴定GBS的特异性试验。

      CAMP是一种重要的致病因子,在活体动物试验中发现纯化的CAMP因子可导致兔及小鼠死亡[18]。但HENSLER等[19]通过对cfb基因进行等位基因替换后的体外及体内试验研究认为,CAMP因子在GBS的毒力系统中不是必须的。因此,CAMP因子在感染过程中的作用还存在争议。

      综上,荧光PCR法和显色平板培养法相比,可有效提高围生期孕妇GBS筛查的阳性率,有条件的实验室应推广普及。本地区CAMP试验阴性GBS占比较高,应避免将该试验作为GBS的鉴别试验。因存在缺失cfb基因GBS,GBS分子检测试剂不应选择该段基因设计引物。

参考文献 (19)

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