-
胃癌是具有高发病率和高死亡率的恶性肿瘤之一，随着对胃癌发病分子机制的深入研究，分子靶向治疗在胃癌治疗中显示出良好的效果[1-2]。环状RNA(circRNA)在胃癌的发病机制中起着至关重要的作用，可作为其新型潜在诊断生物标志物[3]。研究报道大肠癌病人血浆中circ_0001178上调，且与病人的临床病理结果相关[4]。高circ_0001178的大肠癌病人更容易出现转移性临床特征、晚期TNM分期和不良预后；敲低circ_0001178削弱了大肠癌细胞的体外迁移和侵袭能力[5]。circ_0001178在肝细胞癌组织和细胞中高表达，敲减circ_0001178通过调节miR-382/VEGFA轴抑制肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭[6]。然而circ_0001178对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及分子机制尚不清楚。研究[7]发现miR-1179在胃癌组织和细胞系中均显著下调，miR-1179表达的降低与胃癌病人的肿瘤大小增加、肿瘤分期和淋巴结转移明显相关；过表达miR-1179通过靶向HMGB1抑制胃癌细胞的增殖和侵袭[7]。此外，miR-1179的过表达显著抑制了乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭[8]。circFOXM1通过使miR-1179海绵化并调节HMGB1表达调控乳头状甲状腺癌的进展[9]。而circ_0001178是否通过靶向调控miR-1179影响胃癌细胞的增殖和凋亡目前还尚未可知。因此，本实验旨在研究circ_0001178对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及分子机制是否与miR-1179有关。
-
选取2017年6月至2020年6月我院病理科存档且已确诊胃癌的33例病人胃癌组织及癌旁组织标本，其中男12例，女21例，年龄34~76岁。所有病人术前未进行放化疗，均知情且同意。
-
胃癌细胞株AGS购自美国ATCC；RPMI-1640培养基购自杭州鹰旸生物科技有限公司；Trizol试剂、荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司；MTT试剂盒、凋亡检测试剂盒购自美国Sciencell公司；RIPA蛋白裂解液购自上海贝博-Bestbio生物公司；cleaved-caspase3和cleaved-caspase9抗体购自美国CST公司；GAPDH抗体和二抗(山羊抗兔IgG-HRP)购自美国Abbiotec公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国GeneCopoeia公司。
-
胃癌细胞株AGS常规培养于RPMI-1640培养基中，取对数生长期细胞，将si-NC、si-circ_0001178、miR-NC、miR-1179分别转染至AGS细胞，记为si-NC组、si-circ_0001178组、miR-NC组、miR-1179组；将si-circ_0001178分别与anti-miR-NC、anti-miR-1179共转染至AGS细胞，记为si-circ_0001178+anti-miR-NC组、si-circ_0001178+anti-miR-1179组。对照组常规培养，不予转染。
-
提取胃癌组织、癌旁组织和各组细胞的总RNA，合成cDNA后按试剂盒说明进行PCR，相对表达量用2-△△Ct法计算。以GAPDH和U6为内参，circ_0001178上游引物序列：5′-ACC CAG ATA CTA CAG CAA GCC-3′，下游引物序列：5′-TTG GCT TCC CAC ACT GAT GT-3′；GAPDH上游引物序列：5′-TGT TGC CAT CAA TCA CCC CTT-3′，下游引物序列：5′-CTC CAC GAC GTA CTC AGC G-3′；miR-1179上游引物序列：5′-GCG GAA GCA TTC TTT CAT-3′，下游引物序列：5′-CAA GGG CTC GAC TCC TGT-3′；U6上游引物序列：5′-CGC TTC GGC AGC ACA TAT ACT A-3′，下游引物序列：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC A-3′。
-
将si-NC组、si-circ_0001178组、miR-NC组、miR-1179组、si-circ_0001178+anti-miR-NC组、si-circ_0001178+anti-miR-1179组细胞消化后制成细胞悬液，然后以每孔100个接种于6孔板中，约培养2周，用PBS清洗，然后用甲醇固定，再用吉姆萨染色30 min，低倍光学显微镜下计数>50个细胞的集落。
-
各组细胞培养48 h，按试剂盒说明操作，先加入20 μL的MTT溶液，培养4 h，再加入二甲基亚砜溶液，振荡反应10 min，用酶标仪于波长450 nm处检测吸光度(OD)值。
-
各组细胞培养48 h，漂洗细胞后按试剂盒说明分别加入Annexin V-FITC和PI溶液，混匀，避光孵育10 min；上流式细胞仪检测。
-
提取各组细胞总蛋白，定量后进行SDS-PAGE，转膜，用5%脱脂牛奶封闭，分别加入cleaved-caspase3、cleaved-caspase9、GAPDH一抗，4 ℃孵育过夜，再加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗室温孵育2 h，显影，定影，分析蛋白条带的灰度值，计算蛋白相对表达水平。
-
生物学在线软件预测显示circ_0001178的序列中含有与miR-1179互补的核苷酸序列；构建circ_0001178野生型(WT)和突变型(MUT)荧光素酶载体。取对数生长期、生长状态良好的AGS细胞，随机分为miR-NC组、miR-1179组，分别与miR-NC和miR-1179共转染至AGS细胞中，按照说明书检测荧光素酶活性。将AGS细胞随机分为pcDNA组、pcDNA-circ_0001178组、si-NC组、si-circ_0001178组、分别转染pcDNA、pcDNA-circ_0001178、si-NC、si-circ_0001178至AGS细胞，按1.4中方法检验miR-1179表达水平。对照组常规培养，不予转染。
-
采用t检验、方差分析和q检验。
-
胃癌组织中circ_0001178表达水平明显高于癌旁组织(P < 0.01)，而miR-1179表达水平明显低于癌旁组织(P < 0.01)(见表 1)。
分组 circ_0001178 miR-1179 癌旁组织 1.00±0.11 1.00±0.07 胃癌组织 3.88±0.22 0.29±0.03 t 67.26 217.24 P < 0.01 < 0.01 表 1 circ_0001178和miR-1179在胃癌组织中的表达(ni=33；x±s)
-
与si-NC组比较，si-circ_0001178组circ_0001178表达水平降低(P < 0.01)，AGS细胞克隆形成数减少(P < 0.01)，细胞活性降低(P < 0.01)(见表 2)。
分组 circ_0001178 克隆形成数/个 OD值 si-NC组 1.00±0.00 89.62±7.77 0.71±0.05 si-circ_0001178组 0.32±0.04 34.94±3.78 0.36±0.03 t 51.00 18.98 18.01 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 表 2 抑制circ_0001178表达对胃癌AGS细胞增殖的影响(ni=9；x±s)
-
与si-NC组比较，si-circ_0001178组AGS细胞凋亡率升高(P < 0.01)，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表达水平升高(P < 0.01)(见表 3)。
分组 凋亡率/% cleaved-caspase3蛋白 cleaved-caspase9蛋白 si-NC组 6.81±0.61 0.23±0.03 0.13±0.02 si-circ_0001178组 22.53±2.09 0.64±0.05 0.53±0.04 t 21.66 21.09 26.83 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 表 3 抑制circ_0001178表达对胃癌AGS细胞凋亡的影响(ni=9；x±s)
-
双荧光素酶报告实验结果显示，WT-circ_0001178与miR-1179共转染细胞的荧光素酶活性低于WT-circ_0001178与miR-NC共转染的细胞(P < 0.01)；而MUT-circ_0001178与miR-1179或miR-NC共转染的细胞荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)(见表 4)。过表达circ_0001178后miR-1179表达水平降低，而抑制circ_0001178表达后miR-1179表达水平升高(P < 0.05)(见表 5)。
分组 WT-circ_0001178 MUT-circ_0001178 miR-NC 1.03±0.08 1.01±0.07 miR-1179 0.43±0.04 1.02±0.06 t 20.13 0.33 P < 0.01 >0.05 表 4 双荧光素酶报告实验(ni=9；x±s)
分组 miR-1179 F P MS组内 pcDNA组 1.00±0.00 260.87 < 0.05 0.018 pcDNA-circ_0001178组
si-NC组0.32±0.03*
1.01 ±0.06#si-circ_0001178组 2.70±0.26*#▲ q检验：与pcDNA组比较*P < 0.05；与pcDNA-circ_0001178组比较#P < 0.05；与si-NC组比较▲P < 0.05 表 5 circ_0001178调控miR-1179的表达(ni=9；x±s)
-
与miR-NC组比较，miR-1179组miR-1179表达水平升高(P < 0.01)，AGS细胞克隆形成数减少(P < 0.01)，细胞活性降低(P < 0.01)，AGS细胞凋亡率升高(P < 0.01)，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表达水平升高(P < 0.01)(见表 6)。
分组 miR-1179 克隆
形成数/个OD值 凋亡率/% cleaved-caspase3蛋白 cleaved-caspas9蛋白 miR-NC组 1.00±0.00 86.21±7.24 0.72±0.06 6.76±0.65 0.22±0.02 0.12±0.02 miR-1179组 3.19±0.22 44.33±3.66 0.45±0.04 18.61±1.13 0.59±0.04 0.47±0.03 t 29.86 15.49 11.23 27.27 24.82 29.12 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 表 6 miR-1179过表达对胃癌AGS细胞增殖和凋亡的影响(ni=9；x±s)
-
与si-circ_0001178+anti-miR-NC组比较，si-circ_0001178+anti-miR-1179组miR-1179表达水平降低(P < 0.01)，AGS细胞的克隆形成数增加且活性升高(P < 0.01)，而凋亡率降低(P < 0.01)，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表达水平降低(P < 0.01)(见表 7)。
分组 miR-1179 克隆
形成数/个OD值 凋亡率/% cleaved-caspase3蛋白 cleaved-caspas9蛋白 si-circ_0001178+anti-miR-NC组 1.00±0.00 33.24±3.62 0.35±0.03 24.21±2.21 0.66±0.04 0.55±0.03 si-circ_0001178+anti-miR-1179组 0.36±0.03 79.78±6.99 0.60±0.04 11.83±1.19 0.32±0.03 0.26±0.03 t 64.00 17.74 15.00 14.80 20.40 18.38 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 表 7 干扰miR-1179表达逆转了抑制circ_0001178表达对胃癌AGS细胞增殖和凋亡的作用(ni=9；x±s)
-
胃癌是我国高发肿瘤，晚期胃癌以药物治疗为主，然而方法有限，疗效亟待提高；近年来，分子靶向药物的出现给晚期胃癌病人的治疗带来新的方向[10-11]。因此，寻找新的特异性靶点以研发分子靶向药物对胃癌的治疗具有重要意义。研究[12]发现，多种circRNA参与胃癌的进展过程，下调的circRNA_001569降低胃癌细胞活力并促进细胞凋亡。下调circ-ARHGAP26抑制胃癌细胞增殖并促进细胞凋亡[13]。然而circ_0001178对胃癌的影响尚未见研究报道。本实验结果显示，胃癌组织中circ_0001178表达水平升高，提示circ_0001178可能在胃癌中起促癌基因作用。本实验进一步抑制circ_0001178表达后，AGS细胞克隆形成数减少，细胞活性降低，AGS细胞凋亡率升高，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表达水平升高；表明抑制circ_0001178表达可抑制胃癌AGS细胞增殖，诱导细胞凋亡。
研究[14]报道miR-1179通过靶向E2F5抑制人胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。miR-1179通过靶向精子相关抗原5(SPAG5)/Akt轴抑制非小细胞肺癌细胞生长和侵袭[15]。且已有文献[7]报道miR-1179可抑制胃癌细胞的增殖和侵袭。本实验结果显示，胃癌组织中miR-1179表达水平降低，过表达miR-1179可见降低克隆形成数及细胞活性，提高细胞凋亡率；表明过表达miR-1179不仅可抑制胃癌细胞增殖，还可诱导细胞凋亡。有研究[16]报道circ_0084927通过调控miR-1179/CDK2促进宫颈癌发生；circ_0039411通过miR-1179/ABCA9和miR-1205/MTA1信号通路促进甲状腺乳头状癌的发生和发展[17]。说明circRNA可通过调控miR-1179参与肿瘤进展过程。本实验结果显示，circ_0001178靶向负调控miR-1179；干扰miR-1179表达逆转了抑制circ_0001178表达对胃癌AGS细胞增殖和凋亡的作用。
综上所述，抑制circ_0001178表达可能通过靶向上调miR-1179抑制胃癌AGS细胞增殖，诱导细胞凋亡。
circ_0001178靶向miR-1179调控胃癌AGS细胞增殖和凋亡的机制探讨
Study on the mechanism of circ_0001178 targeting miR-1179 to regulate the proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cells
-
摘要:
目的探讨circ_0001178靶向miR-1179调控胃癌AGS细胞增殖和凋亡的机制。 方法选取33例胃癌组织及癌旁组织标本，实时荧光定量PCR检测circ_0001178和miR-1179的表达水平；将胃癌细胞株AGS随机分为si-NC组、si-circ_0001178组、miR-NC组、miR-1179组、si-circ_0001178+anti-miR-NC组、si-circ_0001178+anti-miR-1179组；采用克隆形成实验检测克隆形成数，MTT法检测细胞活性，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blotting法检测蛋白表达；采用双荧光素酶报告实验检测circ_0001178和miR-1179的靶向关系。 结果胃癌组织中circ_0001178表达水平明显高于癌旁组织，而miR-1179表达水平明显低于癌旁组织（P < 0.01）。抑制circ_0001178表达或过表达miR-1179，AGS细胞克隆形成数减少，细胞活性降低，AGS细胞凋亡率升高，cleaved-caspase3和cleaved-caspase9表达水平均升高（P < 0.05）。 结论抑制circ_0001178表达可能通过靶向上调miR-1179抑制胃癌AGS细胞增殖，诱导细胞凋亡。 -
关键词:
- 胃肿瘤 /
- 增殖 /
- 凋亡 /
- circ_0001178 /
- miR-1179
Abstract:ObjectiveTo explore the mechanism of circ_0001178 targeting miR-1179 to regulate the proliferation and apoptosis of gastric cancer AGS cells. MethodsThe expression levels of circ_0001178 and miR-1179 in 33 samples of gastric cancer tissue and adjacent tissues were detected using the real-time fluorescent quantitative PCR.The gastric cancer cell line AGS was randomly divided into the si-NC group, si-circ_0001178 group, miR-NC group, miR-1179 group, si-circ_0001178+anti-miR-NC group and si-circ_0001178+anti-miR-1179 group.The number of clone formation was detected using the clone formation experiment, and the cell viability was detected using MTT assay.The apoptosis and protein expression were detected using the flow cytometry and Western blotting, respectively.The dual luciferase reporter assay was used to detect the targeting relationship between circ_0001178 and miR-1179. ResultsThe expression level of circ_0001178 in cancer tissue was higher than that in adjacent tissues, while the expression level of miR-1179 in cancer tissue was lower than that in adjacent tissues(P < 0.01).The inhibition of circ_0001178 expression or overexpression of miR-1179 could reduce the number of AGS cell clone formation, decrease the cell activity, increase the AGS cell apoptosis rate, and increase the expression levels of cleaved-caspase3 and cleaved-caspase9(P < 0.05). ConclusionsInhibiting the expression of circ_0001178 may inhibit the proliferation of gastric cancer AGS cells, and induce cell apoptosis by targeting up-regulation of miR-1179. -
Key words:
- gastric neoplasms /
- proliferation /
- apoptosis /
- circ_0001178 /
- miR-1179
-
表 1 circ_0001178和miR-1179在胃癌组织中的表达(ni=33；x±s)
分组 circ_0001178 miR-1179 癌旁组织 1.00±0.11 1.00±0.07 胃癌组织 3.88±0.22 0.29±0.03 t 67.26 217.24 P < 0.01 < 0.01 
下载: 导出CSV
表 2 抑制circ_0001178表达对胃癌AGS细胞增殖的影响(ni=9；x±s)
分组 circ_0001178 克隆形成数/个 OD值 si-NC组 1.00±0.00 89.62±7.77 0.71±0.05 si-circ_0001178组 0.32±0.04 34.94±3.78 0.36±0.03 t 51.00 18.98 18.01 P < 0.01 < 0.01 < 0.01
下载: 导出CSV
表 3 抑制circ_0001178表达对胃癌AGS细胞凋亡的影响(ni=9；x±s)
分组 凋亡率/% cleaved-caspase3蛋白 cleaved-caspase9蛋白 si-NC组 6.81±0.61 0.23±0.03 0.13±0.02 si-circ_0001178组 22.53±2.09 0.64±0.05 0.53±0.04 t 21.66 21.09 26.83 P < 0.01 < 0.01 < 0.01
下载: 导出CSV
表 4 双荧光素酶报告实验(ni=9；x±s)
分组 WT-circ_0001178 MUT-circ_0001178 miR-NC 1.03±0.08 1.01±0.07 miR-1179 0.43±0.04 1.02±0.06 t 20.13 0.33 P < 0.01 >0.05
下载: 导出CSV
表 5 circ_0001178调控miR-1179的表达(ni=9；x±s)
分组 miR-1179 F P MS组内 pcDNA组 1.00±0.00 260.87 < 0.05 0.018 pcDNA-circ_0001178组
si-NC组0.32±0.03*
1.01 ±0.06#si-circ_0001178组 2.70±0.26*#▲ q检验：与pcDNA组比较*P < 0.05；与pcDNA-circ_0001178组比较#P < 0.05；与si-NC组比较▲P < 0.05
下载: 导出CSV
表 6 miR-1179过表达对胃癌AGS细胞增殖和凋亡的影响(ni=9；x±s)
分组 miR-1179 克隆
形成数/个OD值 凋亡率/% cleaved-caspase3蛋白 cleaved-caspas9蛋白 miR-NC组 1.00±0.00 86.21±7.24 0.72±0.06 6.76±0.65 0.22±0.02 0.12±0.02 miR-1179组 3.19±0.22 44.33±3.66 0.45±0.04 18.61±1.13 0.59±0.04 0.47±0.03 t 29.86 15.49 11.23 27.27 24.82 29.12 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
下载: 导出CSV
表 7 干扰miR-1179表达逆转了抑制circ_0001178表达对胃癌AGS细胞增殖和凋亡的作用(ni=9；x±s)
分组 miR-1179 克隆
形成数/个OD值 凋亡率/% cleaved-caspase3蛋白 cleaved-caspas9蛋白 si-circ_0001178+anti-miR-NC组 1.00±0.00 33.24±3.62 0.35±0.03 24.21±2.21 0.66±0.04 0.55±0.03 si-circ_0001178+anti-miR-1179组 0.36±0.03 79.78±6.99 0.60±0.04 11.83±1.19 0.32±0.03 0.26±0.03 t 64.00 17.74 15.00 14.80 20.40 18.38 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
下载: 导出CSV
-
[1] 刘艳凤, 苗梦媛, 毛伟征. 胃癌发病分子机制及靶向治疗研究新进展[J]. 解放军预防医学杂志, 2019, 37(4): 189. [2] PELLINO A, RIELLO E, NAPPO F, et al. Targeted therapies in metastatic gastric cancer: current knowledge and future perspectives[J]. World J Gastroenterol, 2019, 25(38): 5773. doi: 10.3748/wjg.v25.i38.5773 [3] SHAN C, ZHANG Y, HAO X, et al. Biogenesis, functions and clinical significance of circRNAs in gastric cancer[J]. Mol Cancer, 2019, 18(1): 136. doi: 10.1186/s12943-019-1069-0 [4] LI J, SONG Y, WANG J, et al. Plasma circular RNA panel acts as a novel diagnostic biomarker for colorectal cancer detection[J]. Am J Transl Res, 2020, 12(11): 7395. [5] REN C, ZHANG Z, WANG S, et al. Circular RNA hsa_circ_0001178 facilitates the invasion and metastasis of colorectal cancer through upregulating ZEB1 via sponging multiple miRNAs[J]. Biol Chem, 2020, 401(4): 487. doi: 10.1515/hsz-2019-0350 [6] GAO S, HU W, HUANG X, et al. Circ_0001178 regulates miR-382/VEGFA axis to facilitate hepatocellular carcinoma progression[J]. Cell Signal, 2020, 72: 109621. doi: 10.1016/j.cellsig.2020.109621 [7] LI Y, QIN C. MiR-1179 inhibits the proliferation of gastric cancer cells by targeting HMGB1[J]. Hum Cell, 2019, 32(3): 352. doi: 10.1007/s13577-019-00244-6 [8] LI WJ, XIE XX, BAI J, et al. Increased expression of miR-1179 inhibits breast cancer cell metastasis by modulating Notch signaling pathway and correlates with favorable prognosis[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2018, 22(23): 8374. [9] YE M, HOU H, SHEN M, et al. Circular RNA circFOXM1 plays a role in papillary thyroid carcinoma by sponging miR-1179 and regulating HMGB1 expression[J]. Mol Ther Nucleic Acids, 2020, 19: 741. doi: 10.1016/j.omtn.2019.12.014 [10] 李丹妮, 刘静, 刘云鹏. 胃癌靶向治疗的现状与思考[J]. 实用肿瘤杂志, 2019, 34(2): 106. [11] 郑锐滨, 李勇. 胃癌的靶向治疗[J]. 实用药物与临床, 2019, 22(2): 113. [12] SHEN F, LIU P, XU Z, et al. CircRNA_001569 promotes cell proliferation through absorbing miR-145 in gastric cancer[J]. J Biochem, 2019, 165(1): 27. doi: 10.1093/jb/mvy079 [13] WANGXIA LV, FANG Y, LIU Y, et al. Circular RNA ARHGAP26 is over-expressed and its downregulation inhibits cell proliferation and promotes cell apoptosis in gastric cancer cells[J]. Saudi J Gastroenterol, 2019, 25(2): 119. doi: 10.4103/sjg.SJG_283_18 [14] LIN C, HU Z, YUAN G, et al. MicroRNA-1179 inhibits the proliferation, migration and invasion of human pancreatic cancer cells by targeting E2F5[J]. Chem Biol Interact, 2018, 291: 65. doi: 10.1016/j.cbi.2018.05.017 [15] SONG L, DAI Z, ZHANG S, et al. MicroRNA-1179 suppresses cell growth and invasion by targeting sperm-associated antigen 5-mediated Akt signaling in human non-small cell lung cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2018, 504(1): 164. [16] QU X, ZHU L, SONG L, et al. circ_0084927 promotes cervical carcinogenesis by sponging miR-1179 that suppresses CDK2, a cell cycle-related gene[J]. Cancer Cell Int, 2020, 20(1): 33. [17] YANG Y, DING L, LI Y, et al. Hsa_circ_0039411 promotes tumorigenesis and progression of papillary thyroid cancer by miR-1179/ABCA9 and miR-1205/MTA1 signaling pathways[J]. J Cell Physiol, 2020, 235(2): 1321. -
