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乳腺癌在全球范围内发病率逐年上升,已位居女性癌症首位;也是全球癌症发病的主要原因之一,占所有癌症病人的11.7%,每年死亡人数为68.5万人,死亡率高达6.9%,是全球第五大癌症死亡原因[1]。根据病人的激素受体及人上皮生长因子受体2(HER-2)表达情况,可将乳腺癌分为4种分子亚型[2],分子亚型与乳腺癌的治疗和预后密切相关,探索乳腺癌预后相关因素有利于早期诊断和靶向治疗。微小RNA(microRNA,miRNA)是一种长度在19~25个核苷酸的非编码RNA,其可以通过和靶基因mRNA的碱基配对,引导沉默复合体降解mRNA或阻碍其翻译,从而发挥癌基因或抑癌基因的作用。本课题组前期研究[3]发现,miR-5585-5p可促进乳腺癌的发生发展,利用TCGA数据库分析发现,多聚免疫球蛋白受体(Polymeric immunoglobulin receptor, pIgR)在癌症组织中表达较癌旁组织降低,且与miR-5585-5p存在结合位点。本研究旨在进一步分析乳腺癌组织中miR-5585-5p和pIgR的差异表达情况,并分析其与临床病理学特征的关系及临床意义。
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临床病理标本选自2020年1-12月蚌埠医学院第一附属医院甲乳外科及中德乳腺科手术治疗的44例乳腺浸润性导管癌BRCR石蜡包埋组织(BRCR组),另选取同期5例非癌症病人的正常乳腺组织标本作为对照组(NCT组)。纳入标准:病人手术前无长期服用非甾体类抗炎药物史;无其他恶性肿瘤病史;其中乳腺癌病人术前检查时未发现明显的远处转移,且手术前、手术中均未进行内分泌或放化疗治疗等。观察组病人均为女性,年龄35~55岁。由2位病理医生对所有标本的病理结果进行确认,其中组织学分级Ⅰ~Ⅱ级22例,Ⅲ期22例;淋巴结转移26例,其中淋巴结转移数目≥3个16例;病理类型均为浸润性导管癌。对照组病人均为女性,年龄37~54岁。2组性别、年龄均具有可比性。
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将石蜡包埋的乳腺组织块做4 μm厚连续石蜡切片,脱蜡至水化,滴加3% H2O2,室温孵育10 min,以阻断内源性过氧化物酶,PBS洗3遍;修复抗原,37 ℃湿盒中孵育一抗2 h,PBS洗3遍;37 ℃湿盒中孵育二抗1 h,PBS洗3遍;DAB显色;显微镜下观察拍照。pIgR免疫组织化学结果判定:以细胞膜出现棕黄色颗粒为判断标准,不着色或着色阳性的细胞数≤10%计0分,>10%为阳性,其中着色弱且不连续计1分,着色中等或部分不连续计2分,着色强且连续计3分。将0分、1分判定为PIGR低表达;2分、3分判定为PIGR高表达。
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Trizol试剂(Invitrogen公司);焦碳酸二乙酯(DEPC)采购于Sigma公司;qRT-PCR试剂、反转录试剂盒(Genecopoeia公司);DEPC(Sigma公司);兔抗人PIGR一抗(proteintech公司)。人乳腺癌细胞株SKBR-3采购于中国科学院细胞研究所;新生胎牛血清采购于LONSA公司;DMEM培养基采购于Gibco公司;has-miR-5585-5p mimics采购于上海吉玛制药技术有限公司。
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SKBR-3细胞使用含10%灭活胎牛血清的DMEM高糖培养基,培养于37 ℃、5% CO2环境的细胞培养箱中,定期观察细胞生长状态,待细胞密度生长至70%左右时分瓶传代或进行后续实验。
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将处于对数生长期的细胞经胰酶消化,1 000 g离心5 min,弃上清液,加入1 mL 10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞,细胞计数后以每孔10万个细胞接种于6孔板内,次日进行转染。
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将处于对数生长期的SKBR-3细胞接种至6孔板,当细胞密度达50%~60%时,设空白对照组与实验组,其中空白对照组加入2 mL无血清培养基,实验组每孔加入500 μL转染试剂(A液为250 μL Opti-MEM+5 μL Lipofectamine 2000,B液为250 μL Opti-MEM+5 μL miR-5585-5p mimics,has-miR-5585-5p mimics序列:UGA AGU ACC AGC UAC UCG AGA G,将A、B液混合均匀后静置一段时间即可)和1.5 mL无血清培养基,轻轻摇晃均匀后移入细胞培养箱中培养。
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利用胰酶消化细胞,1 000 g离心5 min,弃上清液,加入1 mL Trizol(裂解液)重悬细胞,反复吹打,充分混匀后转移至预冷的1.5 mL无酶Ep管中,冰上静置10 min;加入0.2 mL三氯甲烷剧烈振荡15 s成乳状,冰上放置5 min;冷冻离心机12 000 g、4 ℃离心15 min;吸取上清液至新的1.5 mL无酶Ep管中,以枪头不吸到中层的情况下尽量多吸,加入与上清液相同体积的异丙醇,轻轻颠倒混匀,室温静置15 min,每隔5 min混匀一次;冷冻离心机12 000 g、4 ℃离心10 min,弃上清液,倒扣干净;加入1 mL 75%乙醇,洗涤RNA,旋涡震荡均匀;冷冻离心机7 600 g、4 ℃离心5 min,弃上清液,加入适量DEPC水,充分溶解RNA,置于-80 ℃冰箱中备用。
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采用逆转录试剂盒,将上述提取的RNA逆转录为cDNA;利用SYBR荧光染料法,进行PCR扩增,以GAPDH为内参,所用引物序列见表 1。qRT-PCR反应参数:95 ℃预变性10 min,95 ℃ 5 s,57 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40个循环。获得数据采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。
基因名称 上游序列 下游序列 pIgR CCA GCC TTT CTC GTT CC CAG TCC TTT TGG CAG CTC GAPDH CAG CCT CAA GAT CAT CAG CA TGT GGT CAT GAG TCC TTC CA 表 1 引物序列
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利用TargetScanHuman7.2 miRNA靶基因数据库,检索pIgR是否与miR-5585-5p存在结合位点。利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库,分析pIgR在乳腺癌组织与正常乳腺组织中的差异表达,并进行生存分析。
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采用t检验、χ2检验和四格表确切概率法。
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利用TargetScanHuman7.2数据库分析结果显示,miR-5585-5p与pIgR存在结合位点(见图 1),表明pIgR可能为miR-5585-5p的潜在靶基因之一。
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为进一步证实miR-5585-5p对pIgR表达的调控,以miR-5585-5p类似物转染乳腺癌细胞SKBR-3,利用qRT-PCR检测pIgR mRNA相对表达量,结果显示,实验组pIgR表达明显低于空白对照组(P < 0.01)(见表 2)。
分组 n pIgR mRNA t P 空白对照组
实验组3
31.00±0.01
0.20±0.149.87 <0.01 表 2 miR-5585-5p对乳腺癌细胞SKBR-3中pIgR表达的影响(x±s)
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为分析pIgR在乳腺癌组织中差异表达情况,从TCGA数据集(https://portal.gdc.com)获取1 090个乳腺癌肿瘤的RNA测序数据(第3级)和相应的临床信息,另从TCGA数据库获取对照组113例良性病例组织样本数据,统计分析结果显示,pIgR在乳腺癌病人癌组织中表达明显低于良性对照组(P < 0.01)(见表 3),且不同分期乳腺癌病人肿瘤组织中pIgR表达均低于良性对照组(P < 0.01),但不同分期间差异无统计学意义(P>0.05)(见表 4)。根据pIgR表达,将乳腺癌病人分为pIgR低表达组(n=545)和高表达组(n=545)进行生存分析,pIgR低表达组5年生存率为20.18%,病人生存时间中位数为2.07年,上四分位数为4.28年,下四分位数为1.12年;pIgR高表达组5年生存率为25.69%,病人生存时间中位数为2.58年,上四分位数为5.13年,下四分位数为1.37年,pIgR低表达组病人5年生存率低于高表达组(χ2=5.38,P < 0.05)。
分组 n pIgR mRNA t P 良性对照组
BRCA113
1 0906.753±2.8
3.02 ±2.4215.42 < 0.01 表 3 TCGA数据库中乳腺癌与正常组织中pIgR的差异表达(x±s)
分期 n pIgR 良性对照组 113 6.75±2.82 Ⅰ期 182 3.19±2.19** Ⅱ期 624 2.85±2.42** Ⅲ期 251 3.26±2.51** Ⅳ期 33 3.28±2.46** F — 61.248 P — < 0.01 MS组内 — 7 186.657 q检验:与良性对照组比较**P < 0.01 表 4 pIgR在不同分期乳腺癌病人肿瘤组织中的表达(x±s)
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利用免疫组织化学方法比较pIgR在BRCR组与NCT组中表达情况,结果显示,pIgR在BRCR组表达明显低于NCT组(见图 2)。
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基于pIgR在BRCR组病人中表达水平,分析pIgR表达与病人临床病理的相关性,结果显示,不同年龄段、PR表达病人的pIgR表达差异均无统计学意义(P>0.05),而不同组织学分级、淋巴结转移数目和HER-2、ER表达病人的pIgR表达差异均有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01)(见表 5)。
临床特征 n pIgR相对表达水平 校正χ2 P 低表达 高表达 年龄/岁 ≤45
>4521
238
1413
92.28 >0.05 组织学分级/级 Ⅰ~Ⅱ
Ⅲ22
227
1515
75.82 < 0.05 淋巴结转移数目 1~3
>317
95
812
18.33 < 0.05 ER -
+11
339
132
205.94 < 0.05 PR -
+14
309
135
171.68 >0.05 HER-2 -
+18
263
1915
713.54 < 0.01 表 5 pIgR表达与乳腺浸润性导管癌病人临床病理特征关系(n)
miRNA-5585-5p靶向调控多聚免疫球蛋白受体在乳腺癌中的表达及临床意义
Expression and significance of polymeric immunoglobulin receptor regulated by miR-5585-5p in breast cancer
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摘要:
目的探讨微小RNA(microRNA,miR)-5585-5p调控多聚免疫球蛋白受体(pIgR)表达情况和pIgR在乳腺癌组织及良性乳腺肿瘤组织中的差异表达。 方法采用生物信息学方法,利用癌症基因组图谱数据库,分析miR-5585-5p对pIgR的调控作用,以及pIgR在乳腺癌组织与正常乳腺组织中的差异表达,并进行生存分析;采用荧光定量PCR技术,检测miR-5585-5p对pIgR的调控作用;采用免疫组织化学方法检测乳腺浸润性导管癌病人肿瘤组织和非癌症病人正常乳腺组织中pIgR表达情况,并分析pIgR表达与乳腺癌病人临床病理特征间关系。 结果荧光定量PCR结果显示,miR-5585-5p下调pIgR表达(P < 0.01);生物信息学分析显示,pIgR在乳腺癌病人中呈低表达趋势(P < 0.01);免疫组织化学结果显示,不同组织学分级、淋巴结转移数目和HER-2、ER表达病人的pIgR表达差异均有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01)。 结论miR-5585-5p靶向调控pIgR表达,并与乳腺癌病人预后相关,提示其可能可作为生物标志物,帮助进行乳腺癌的分子分型、预后判断及治疗方案选择。 -
关键词:
- 乳腺癌 /
- 微小RNA-5585-5p /
- 多聚免疫球蛋白受体
Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of polymeric immunoglobulin receptor (pIgR) regulated by microRNA (miR)-5585-5p and the differential expression of pIgR in breast cancer tissue (BRCA) and non-cancer tissues (NCT). MethodsBioinformatics method was used to analyze the regulatory effect of miR-5585-5p on pIgR, the expression of pIgR in breast cancer and its effect on survival and prognosis of patients.Fluorescence quantitative PCR was used to detect the regulatory effect of miR-5585-5p on pIgR.Immunohistochemical method was used to detect the expression of pIgR in tumor tissues of breast invasive ductal carcinoma patients and normal breast tissues of non-cancer patients, and to analyze the relationship between the expression of pIgR and the clinicopathological characteristics of patients in BRCR group. ResultsmiR-5585-5p down-regulated the expression of pIgR (P < 0.01).Bioinformatics analysis showed that the expression of pIgR was low in breast cancer patients (P < 0.01).Immunohistochemical results showed that there were significant differences in the expression of pIgR among patients with different histological grades, lymph node metastasis numbers and HER-2, ER expression (P < 0.05 to P < 0.01). ConclusionsmiR-5585-5p targets to regulate the expression of pIgR and is associated with the prognosis of breast cancer patients, suggesting that it may be used as a biomarker to help molecular typing, prognosis judgment and treatment scheme selection of breast cancer. -
Key words:
- breast cancer /
- microRNA-5585-5p /
- polymeric immunoglobulin receptor
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表 1 引物序列
基因名称 上游序列 下游序列 pIgR CCA GCC TTT CTC GTT CC CAG TCC TTT TGG CAG CTC GAPDH CAG CCT CAA GAT CAT CAG CA TGT GGT CAT GAG TCC TTC CA 表 2 miR-5585-5p对乳腺癌细胞SKBR-3中pIgR表达的影响(x±s)
分组 n pIgR mRNA t P 空白对照组
实验组3
31.00±0.01
0.20±0.149.87 <0.01 表 3 TCGA数据库中乳腺癌与正常组织中pIgR的差异表达(x±s)
分组 n pIgR mRNA t P 良性对照组
BRCA113
1 0906.753±2.8
3.02 ±2.4215.42 < 0.01 表 4 pIgR在不同分期乳腺癌病人肿瘤组织中的表达(x±s)
分期 n pIgR 良性对照组 113 6.75±2.82 Ⅰ期 182 3.19±2.19** Ⅱ期 624 2.85±2.42** Ⅲ期 251 3.26±2.51** Ⅳ期 33 3.28±2.46** F — 61.248 P — < 0.01 MS组内 — 7 186.657 q检验:与良性对照组比较**P < 0.01 表 5 pIgR表达与乳腺浸润性导管癌病人临床病理特征关系(n)
临床特征 n pIgR相对表达水平 校正χ2 P 低表达 高表达 年龄/岁 ≤45
>4521
238
1413
92.28 >0.05 组织学分级/级 Ⅰ~Ⅱ
Ⅲ22
227
1515
75.82 < 0.05 淋巴结转移数目 1~3
>317
95
812
18.33 < 0.05 ER -
+11
339
132
205.94 < 0.05 PR -
+14
309
135
171.68 >0.05 HER-2 -
+18
263
1915
713.54 < 0.01 -
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