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阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种表现为认知功能减退的神经退行性病变，其病程长、治疗费用高，给病人家庭和社会带来了沉重的负担[1]。然而，AD病因迄今未明，发病机制学说亦多[2]。寻找AD特异性标志物及研究其机制仍是对AD早发现、早诊疗的有效手段。microRNAs(miRNAs)是一类长为19~22 bp的内源性单链非编码小分子RNA[3]，与包括AD在内的许多神经退行性疾病的发生及发展密切相关[4]，因而也具有作为AD早期诊断的生物标志物的潜能。本研究从GEO数据库获取AD相关miRNAs芯片数据集，使用在线工具GEO2R分析差异表达的miRNAs，并选取明显高表达的miR-182-5p进一步验证。此外，本研究使用生物信息学对miR-182-5p进行系统的靶基因预测及功能分析，以期为深入研究其具体作用机制提供理论基础。
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在GEO数据库搜索框中以“miRNA and Alzheimer′s disease”为检索词，搜索并获得miRNA与AD相关的数据集GSE104514，该数据集包含12对野生型(对照组)和AD模型小鼠样本。随后，选择芯片平台GPL16759，利用GEO2R工具分析差异表达的miRNAs，选取差异最大(|logFC|最大)的miR-182-5p作进一步验证和分析。
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收集2019年5月至2020年2月江苏大学附属医院神经内科就诊的AD病人(AD组)28例。纳入标准：(1)符合2011年美国神经病学及相关疾病协会(NINCDS-ADRDA) 提出的“很可能的AD痴呆”的诊断标准[5]；(2)临床痴呆评定量表(CDR)评分≥1分；(3)头颅CT示脑萎缩、脑室扩大，MRI有双侧颞叶、海马萎缩的证据支持AD的诊断，且除外脑血管病、占位及其他异常信号。排除标准：(1)其他原因导致的痴呆，如脑血管病相关疾病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、路易体痴呆、额颞叶痴呆等引起的认知功能障碍；(2)严重的其他系统疾病，如精神疾病、肿瘤、风湿免疫性疾病、血液系统疾病、严重的肝肾功能不全、其他神经系统疾病、脑器质性疾病、颅脑外伤、严重过敏体质等；(3)不能配合者；(4)有其他不适宜入选的情况。AD组病例平均(72.9±9.1)岁，其中男11例，女17例。另招募年龄及性别相符的同期体检健康者15名(对照组)，其中男6名，女9名，平均(69.1±8.6)岁。2组年龄、性别比较差异均无统计学意义(P>0.05)。所有受试者或其家属均签署知情同意书。本研究经江苏大学附属医院伦理学委员会审查批准。
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使用抗凝管采集研究对象空腹状态下静脉血4~5 mL静脉，离心后收集上清液，参照康为世纪公司RNApure Circulating Reagent、HiFiScript gDNA Removal RT Mastermix说明书提取总RNA及逆转录。用实时荧光定量聚合链反应酶(qPCR)法检测2组血清中miR-182-5p的表达水平，2-ΔΔCt算法进行相对定量分析。上海生物工程技术有限公司设计合成的荧光定量PCR引物序列如下：U6内参引物，上游引物: 5′-GGA ACG ATA CAG AGA AGA TTA GC 3′，下游引物: 5′-TGG AAC GCT TCA CGA ATT TGC G 3′；miR-182-5p引物，上游引物: 5′-GCG CGT GGT TCT AGA CTT GC 3′，下游引物: 5′-ATC CAG CTT GC 3′。
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miRbase(http://www.mirbase.org/)是由曼彻斯特大学研究人员开发的一个开放的miRNA注释信息数据库，该数据库中收录了来自200多个物种，近4万个miRNA的信息，是最全面的miRNA数据库[6]。本研究运用miRBase数据库查找miR-182-5p在不同物种间的成熟体序列并分析其保守性。
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通过TargetScanversion7.2 (http://www.targetscan.org/ver_72/)数据库[7]、miRDB (2016)(http://mirdb.org)数据库[8-9]、miRcode数据库(http://www.mircode.org/index.php)和miRWalk数据库(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)预测miR-182-5p靶基因，对4个数据库的预测结果取交集，使预测结果更具可靠性。
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应用DAVID version 6.8(https://david.ncifcrf.gov)和KOBAS version 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)在线数据库对miR-182-5p靶基因进行GO功能和KEGG通路富集分析，以P < 0.05为界值对富集结果进行筛选。
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采用t(或t′)检验、χ2检验。
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GSE104514芯片数据来自12只AD模型小鼠(Tg)和12只野生型小鼠(wild)的全脑组织或大脑皮层。根据P < 0.05和| logFC |>1筛选获得6个差异表达miRNAs，其在小鼠的表达水平见图 1。其中，miR-182-5p在模型小鼠大脑组织中为差异倍数最大且唯一上调的miRNA(见表 1)，因此选择miR-182-5p并对其进行深入分析。
图 1 筛选出的miRNAs在小鼠的表达水平
基因名称 B LogFC t P miR-M1-2-3p -3.48 -2.01 3.10 < 0.01 miR-877* -3.74 -2.52 2.69 < 0.05 miR-182 -4.02 2.78 2.25 < 0.05 miR-10a -4.03 -1.20 2.23 < 0.05 miR-10b -4.03 -1.20 2.23 < 0.05 miR-17* -4.09 -1.84 2.13 < 0.05 表 1 miRNAs表达水平的差异
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应用qPCR检测AD组和对照组血清中miR-182-5p的表达水平，结果显示，AD病人血清中的miR-182-5p表达量为2.022±1.225, 高于对照组中miR-182-5p表达量0.486±0.442，差异有统计学意义(t′=5.95，P < 0.01)。
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通过miRBase数据库比较miR-182-5p在不同物种间的成熟体序列，结果显示miR-182-5p的序列在人(Homo sapiens)、家鸡(Gallus gallus)、豚鼠(Cavia porcellus)等10个物种中高度相似，表明miR-182-5p在不同物种间具有高度的保守性(见表 2)。
序列号 名称 序列 物种 MIMAT0038556 cli-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU
AGA ACU CAC ACUColumba livia MIMAT0037544 gga-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU AGA
ACU CAC ACU GGallus gallus MIMAT0036764 oha-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU AGA
ACU CAC ACU GOphiophagus hannah MIMAT0037798 cpi-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU AGA
ACU CAC ACUChrysemys picta MIMAT0047699 dno-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU AGA
ACU CAC ACUDasypus novemcinctus MIMAT0048285 ocu-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU AGA
ACU CAC ACUOryctolagus cuniculus MIMAT0047048 cpo-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU AGA
ACU CAC ACUCavia porcellus MIMAT0038194 ami-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU
AGA ACU CAC ACUAlligator mississippiensis MIMAT0038980 pbv-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU AGA
ACU CAC ACUPython bivittatus MIMAT0000259 hsa-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU AGA
ACU CAC ACUHomo sapiens 表 2 不同物种间miR-182-5p的序列比较
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运用miRcode、miRDB、miRWalk和Target Scan数据库预测miR-182-5p的下游靶基因，分别获得281、1 266、6 475、1 325个，结果取交集，共得到23个靶基因(见图 2)，23个交集靶基因(见图 3)。
图 2 miR-182-5p的靶基因数目
图 3 miR-182-5p的23个交集靶基因
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首先，应用DAVID version 6.8(https://david.Ncifcrf.gov)数据库对miR-182-5p交集靶基因进行基因ID转换，随后将转换后的基因ID输入KOBAS version3.0 (http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3/)分析平台，对23个交集靶基因行GO和KEGG富集分析，以P < 0.05作为筛选界值。GO富集结果显示，miR-182-5p靶基因主要参与于锌离子的结合(zinc ion binding)、生物过程的负调控(negative regulation of biological process)、杂环类化合物的结合(heterocyclic compound binding)、主要代谢过程的调节(regulation of primary metabolic process)、gtpase的活性(GTPase binding)、膜的内在成分的组成(intrinsic component of membrane)、大脑的发育(brain development)、部分细胞形态的发生(cell part morphogenesis signaling)、转移酶的活性(transferase activity)、信号的调节(regulation of signaling)、泛素结合酶的结合(ubiquitin conjugating enzyme binding)、耳蜗的发育(cochlea development)、组蛋白h4-k16的乙酰化作用(histone H4-K16 acetylation)、咽系统的发育(pharyngeal system development)、神经元演化方向的规范(cerebral cortex cell migration)、大脑皮层细胞的迁移(cerebral cortex cell migration)、大脑皮层细胞的放射状定向迁移(cerebral cortex radially oriented cell migration)等多个生物学过程。前20个GO功能项见表 3与图 4。而KEGG通路富集分析结果显示，这些靶基因主要参与肾集合管的酸的分泌(collecting duct acid secretion)，醚脂类的代谢(ether lipid metabolism)，志贺菌病的致病过程(shigellosis)，细胞黏膜的黏附(adherens junction)，细菌对上皮细胞的侵袭(bacterial invasion of epithelial cells)等通路(见表 4、图 5)。
GO编号 名称 n P 基因 0008270 zinc ion binding 3 < 0.01 YAF2, ISL1, RBM5 0048519 negative regulation of biological process 4 < 0.01 YAF2, ISL1, RBM5, PAFAH1B1 1901363 heterocyclic compound binding 4 < 0.01 PHF20, ISL1, RBM5, TRIO 0080090 regulation of primary metabolic process 4 < 0.01 ANKIB1, ISL1, PHF20, MEOX1 0051020 gtpase binding 2 < 0.01 TBXA2R, TRIO 0031224 intrinsic component of membrane 4 < 0.01 SLC7A14, TSPAN9, ADAM22, SLC39A9 0007420 brain development 2 < 0.01 ISL1, PAFAH1B1 0032990 cell part morphogenesis 2 < 0.01 ISL1, PAFAH1B1 0023052 signaling 4 < 0.01 TRIO, SYPL1, TSPAN9, PAFAH1B1 0016740 transferase activity 3 < 0.01 PHF20, PDK4, TRIO 0023051 regulation of signaling 3 < 0.01 ISL1, PHF20, PAFAH1B1 0031624 ubiquitin conjugating enzyme binding 1 < 0.01 ANKIB1 0090102 cochlea development 1 < 0.01 PAFAH1B1 0043984 histone h4-k16 acetylation 1 < 0.01 PHF20 0060037 pharyngeal system development 1 < 0.01 ISL1 0048665 neuron fate specification 1 < 0.01 ISL1 0046972 histone acetyltransferase activity(h4-k16 specific) 1 < 0.01 PHF20 0003924 gtpase activity 2 < 0.01 TRIO, PAFAH1B1 0021795 cerebral cortex cell migration 1 < 0.01 PAFAH1B1 0021799 cerebral cortex radially oriented cell migration 1 < 0.01 PAFAH1B1 表 3 miR-182-5p靶基因GO分析结果
图 4 miR-182-5p靶基因GO分析结果
通路编号 名称 n P 基因编号 hsa04966 Collecting duct acid secretion 1 < 0.05 6521 hsa00565 Ether lipid metabolism 1 < 0.05 5048 hsa05131 Shigellosis 1 < 0.05 7414 hsa04520 Adherens junction 1 < 0.05 7414 hsa05100 Bacterial invasion of epithelial cells 1 < 0.05 7414 表 4 miR-182-5p靶基因KEGG分析结果
图 5 miR-182-5p靶基因KEGG分析结果
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AD在所有类型的痴呆中最为常见，属于神经退行性变的一种，其早期症状常表现为记忆力减退，以近事遗忘为主，随疾病发展可出现认知障碍、行为症状及其他精神症状[10]。AD主要的病理学特征包括β淀粉样蛋白的沉积，神经原纤维缠结[11]等。尽管AD的神经病理学特征已被公认，然而，其病因尚未完全明确[12]。目前，临床上对AD的早期诊断、治疗仍存在困难[13]。研究表明miRNAs是AD潜在的生物标志物及治疗靶点，例如SMITH等证明miR-132直接靶向tau mRNA来调节其表达，从而调控AD的疾病进程[14]；LI等[15]证实miR-219-5p缺失介导的TTBK1和GSK-3表达上调可能是促进tau蛋白磷酸化和AD进展的机制。
miR-182-5p的成熟体序列在多个物种间呈现高度保守，提示miR-182-5p在物种进化中具有重要作用。此外，许多研究表明miR-182-5p在多种肿瘤中异常表达，与肿瘤发生发展密切相关。例如，研究[16]显示miR-182-5p在膀胱癌病人组织和细胞系中明显下调，而miR-182-5p上调可抑制Cofilin 1的表达进而抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭及体外肿瘤形成，表明miR-182-5p与膀胱癌发生发展相关，可作为膀胱癌的潜在生物标志物。miR-182-5p与非肿瘤疾病相关, 例如，有研究[17]表明miR-182-5p在局部侵袭性牙周炎病人外周血细胞中显著上调，与病人免疫高反应性相关。本次通过搜集GEO数据库数据中AD相关数据集并进行分析，结果显示AD小鼠相较于野生小鼠明显高表达miR-182-5p，提示miR-182-5p与AD发病可能密切相关。随后，我们进一步通过实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)证实相较于健康人，AD病人血清中的miR-182-5P明显高表达(P < 0.01)，表明miR-182-5p高表达可促进AD发生发展。
然而，miR-182-5p在AD中的作用机制尚不清楚。本研究进一步通过生物信息分析方法预测获得23个miR-182-5p的潜在靶基因，可为深入探讨miR-182-5p在AD发病中的具体机制提供依据。随后，我们对其靶基因进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析，结果显示靶基因主要涉及大脑的发育，大脑皮层细胞迁移、大脑皮层细胞放射状定向迁移等，提示miR-182-5p可能通过多种途径参与AD发生、发展。
综上所述，本研究证实了miR-182-5p在AD病人中明显高表达，分析了miR-182-5p靶基因及其靶基因的功能和相关通路，可为进一步通过荧光素酶报告、体内体外实验等验证miR-182-5p在AD中的作用机制提供理论依据，也可能为更准确地阐明miR-182-5p在AD中的功能及早期诊断、分型和治疗提供帮助。
miR-182-5p在阿尔兹海默病的表达及生物信息学分析
Expression and bioinformatics analysis of miR-182-5p in Alzheimer's disease
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摘要:
目的探究miR-182-5p在阿尔兹海默病（AD）病人血清中的表达水平，并采用生物信息学方法对其进行靶基因预测及功能分析。 方法从GEO数据库获取AD相关miRNAs芯片数据集GSE104514，利用GEO2R在线工具分析差异表达的miRNAs，选择差异最大的miR-182-5p进行深入研究。收集AD病人28例（AD组）及健康者15名（对照组），应用实时荧光定量聚合酶链反应法检测血清中miR-182-5p的表达水平。通过miRBase数据库分析miR-182-5p在不同物种间的保守性；运用miRcode、miRDB、miRWalk和Target Scan数据库预测miR-182-5p靶基因，并取交集靶基因；应用DAVID和KOBAS数据库对miR-182-5p靶基因进行GO功能及KEGG信号通路富集分析。 结果AD小鼠脑组织的miR-182-5p表达明显高于野生型小鼠（P < 0.05），AD病人血清中的miR-182-5p表达量（2.022±1.225）明显高于对照组（0.486±0.442）（P < 0.01）；保守性分析显示miR-182-5p成熟体序列在不同物种间高度保守；在线数据库预测获得miR-182-5p潜在的交集靶基因共23个。GO富集结果显示，miR-182-5p靶基因主要参与于锌离子的结合、生物过程的负调控、杂环类化合物的结合、主要代谢过程的调节、GTPase的活性、膜的内在成分的组成、大脑的发育、部分细胞形态的发生、转移酶的活性、信号的调节、泛素结合酶的结合、耳蜗的发育、组蛋白H4-K16的乙酰化作用、咽系统的发育、神经元演化方向的规范、大脑皮层细胞的迁移、大脑皮层细胞的放射状定向迁移等多个生物学过程。KEGG分析结果显示，miR-182-5p靶基因主要参与肾集合管的酸分泌、醚脂类代谢、志贺菌病、细胞的黏附、细菌侵袭上皮细胞等5条信号通路。 结论miR-182-5p在AD病人血清中高表达，其可能通过多条信号通路参与AD的发展过程。 -
关键词:
- 阿尔兹海默病 /
- miR-182-5p /
- 生物信息学 /
- 靶基因
Abstract:ObjectiveTo investigate the expression level of miR-182-5p in the peripheral blood serum of patients with Alzheimer's disease(AD), predict its target genes and conduct functional analysis by bioinformatics methods. MethodsThe dataset of GSE104514 was searched and downloaded from the GEO database. The differentially expressed miRNAs of the dataset were analyzed by GEO2R tool. Among which, miR-182-5p was the most differentially expressed miRNA and was selected for in-depth analysis. Fifteen normal controls(NC) and twenty-eight patients with AD were enrolled in this study. The expression levels of miR-182-5p in peripheral blood serum were determined by real-time fluorescent quantitative PCR. MiRBase database was used to analyze the conservativeness of miR-182-5p among different species. miRcode, miRDB, miRWalk and Target Scan databases were performed to predict the target genes of miR-182-5p, and the common target genes of these databases were screened out. GO and KEGG functional enrichment analysis of miR-182-5p target genes were conducted by DAVID and KOBAS databases. ResultsThe expression of miR-182-5p in brain tissue of AD mice was higher than that in wild mice(P < 0.05). The expression level of miR-182-5p in the peripheral blood serum of AD patients(2.022±1.225) was significantly higher than that of the control group(0.486±0.442)(P < 0.01). Conservative analysis showed that the mature sequence of miR-182-5p was highly conserved in different species. A total of 23 potential intersection target genes of miR-182-5p were predicted by the online databases. The results of GO enrichment analysis suggested that the target genes of miR-182-5p were mainly enriched in zinc ion binding, negative regulation of biological process, heterocyclic compound binding, regulation of primary metabolic process, GTPase activity, intrinsic component of membrane, brain development, cell part morphogenesis, transferase activity, regulation of signaling, ubiquitin conjugating enzyme binding, cochlea development, histone H4-K16 acetylation, pharyngeal system development, neuron fate specification, cerebral cortex cell migration, and cerebral cortex radially oriented cell migration, etc. The results of KEGG signal pathway showed that target genes were mainly enriched in 5 signal pathways, including acid secretion of renal collecting tube, ether lipid metabolism, Shigellosis, adhesion of cell mucosa, and bacterial invasion of epithelial cells. ConclusionsMiR-182-5p is highly expressed in the peripheral blood serum of AD patients and may participate in the development of AD through multiple signaling pathways. -
Key words:
- Alzheimer's disease /
- miR-182-5p /
- bioinformatics /
- target genes
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表 1 miRNAs表达水平的差异
基因名称 B LogFC t P miR-M1-2-3p -3.48 -2.01 3.10 < 0.01 miR-877* -3.74 -2.52 2.69 < 0.05 miR-182 -4.02 2.78 2.25 < 0.05 miR-10a -4.03 -1.20 2.23 < 0.05 miR-10b -4.03 -1.20 2.23 < 0.05 miR-17* -4.09 -1.84 2.13 < 0.05 
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表 2 不同物种间miR-182-5p的序列比较
序列号 名称 序列 物种 MIMAT0038556 cli-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU
AGA ACU CAC ACUColumba livia MIMAT0037544 gga-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU AGA
ACU CAC ACU GGallus gallus MIMAT0036764 oha-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU AGA
ACU CAC ACU GOphiophagus hannah MIMAT0037798 cpi-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU AGA
ACU CAC ACUChrysemys picta MIMAT0047699 dno-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU AGA
ACU CAC ACUDasypus novemcinctus MIMAT0048285 ocu-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU AGA
ACU CAC ACUOryctolagus cuniculus MIMAT0047048 cpo-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU AGA
ACU CAC ACUCavia porcellus MIMAT0038194 ami-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU
AGA ACU CAC ACUAlligator mississippiensis MIMAT0038980 pbv-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU AGA
ACU CAC ACUPython bivittatus MIMAT0000259 hsa-miR-182-5p UUU GGC AAU GGU AGA
ACU CAC ACUHomo sapiens
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表 3 miR-182-5p靶基因GO分析结果
GO编号 名称 n P 基因 0008270 zinc ion binding 3 < 0.01 YAF2, ISL1, RBM5 0048519 negative regulation of biological process 4 < 0.01 YAF2, ISL1, RBM5, PAFAH1B1 1901363 heterocyclic compound binding 4 < 0.01 PHF20, ISL1, RBM5, TRIO 0080090 regulation of primary metabolic process 4 < 0.01 ANKIB1, ISL1, PHF20, MEOX1 0051020 gtpase binding 2 < 0.01 TBXA2R, TRIO 0031224 intrinsic component of membrane 4 < 0.01 SLC7A14, TSPAN9, ADAM22, SLC39A9 0007420 brain development 2 < 0.01 ISL1, PAFAH1B1 0032990 cell part morphogenesis 2 < 0.01 ISL1, PAFAH1B1 0023052 signaling 4 < 0.01 TRIO, SYPL1, TSPAN9, PAFAH1B1 0016740 transferase activity 3 < 0.01 PHF20, PDK4, TRIO 0023051 regulation of signaling 3 < 0.01 ISL1, PHF20, PAFAH1B1 0031624 ubiquitin conjugating enzyme binding 1 < 0.01 ANKIB1 0090102 cochlea development 1 < 0.01 PAFAH1B1 0043984 histone h4-k16 acetylation 1 < 0.01 PHF20 0060037 pharyngeal system development 1 < 0.01 ISL1 0048665 neuron fate specification 1 < 0.01 ISL1 0046972 histone acetyltransferase activity(h4-k16 specific) 1 < 0.01 PHF20 0003924 gtpase activity 2 < 0.01 TRIO, PAFAH1B1 0021795 cerebral cortex cell migration 1 < 0.01 PAFAH1B1 0021799 cerebral cortex radially oriented cell migration 1 < 0.01 PAFAH1B1
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表 4 miR-182-5p靶基因KEGG分析结果
通路编号 名称 n P 基因编号 hsa04966 Collecting duct acid secretion 1 < 0.05 6521 hsa00565 Ether lipid metabolism 1 < 0.05 5048 hsa05131 Shigellosis 1 < 0.05 7414 hsa04520 Adherens junction 1 < 0.05 7414 hsa05100 Bacterial invasion of epithelial cells 1 < 0.05 7414
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