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胚胎染色体异常是导致自然流产的重要原因之一，占自然流产因素的50%~70%[1]，主要为染色体数目异常如染色体三体、多倍体、X染色体单体等, 其次为染色体结构异常如染色体微重复/微缺失、染色体嵌合体、染色体易位等[2]。自然流产不仅对女性的健康造成一定的伤害，而且给社会和家庭增加了负担。对流产物的染色体检测，为探究流产的病因，指导孕妇下一次备孕，实现优生优育，具有重要的意义，本研究采用拷贝数变异测序(copy number variation sequencing，CNV-Seq)联合短串联重复序列(short tandem repeats, STR)分型的方法，对150例流产物进行遗传学检测，并对结果进行分析，为探究自然流产的遗传学病因积累临床资料。
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选择2020年2-7月在安徽省妇幼保健院妇产科就诊的150例流产病人。其中初发流产63例，复发流产87例，年龄21~44岁；孕6~36+6周，超声诊断为胚胎停育，其中流产组织46份，绒毛104份；经遗传咨询，自愿接受流产的病因学检查，留取流产物(流产组织或绒毛)经处理并保存备用，所有病人均签署知情通知书。
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送检的流产组织或绒毛，用0.9%氯化钠溶液反复冲洗，尽量去除母体细胞的污染，放置专用试管内，-20 ℃冰箱保存。选取10 mg的流产组织或绒毛，应用Qiaqen QIAamp DNA Blood Mini Kit试验盒，提取基因组DNA，利用Covaris S220超声波破碎仪将DNA打断，文库构建、纯化、定量、DNA混合文库在illumina Nocaseq6000测序仪上进行双端测序，利用Nx Clinical生信分析软件对染色体非整倍体及100 kb以上的拷贝数变异(CNV)进行分析，对比至人类基因库[hg19]或[GRCh37]，并通过OMIM、DGV、GLINGEN、ClinVar、PubMed、DECIPHER、ISCA、NCBI、UESC等数据库比对, 对检测结果进行判读。
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把DNA样本进行多重荧光PCR扩增，将其产物在ABI 3500 Dx遗传分析仪上进行毛细管电泳，检测出不同分型的相对定位, 应用Genc Mapper软件对结果进行计算分析。
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本研究检测流产物150例，均成功检测，检测成功率100%，染色体正常71例(47.33%)，染色体异常79例(52.67%)(见表 1)。
染色体异常类型 具体异常情况 n 占总数比例/% 染色体数目异常 染色体非整倍体 49 32.67 多倍体 7 4.67 染色体结构异常 染色体微重复/微缺失 4 2.67 染色体嵌合体 嵌合三体 10 6.67 嵌合单体 2 1.33 多条染色体嵌合 2 1.33 纯合区域 单亲二倍体 2 1.33 两种类型及以上异常 染色体数目+结构异常 3 2.00 合计 79 52.67 表 1 不同类型染色体异常的检测结果
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本研究共检出染色体非整倍体49例(染色体三体38例，X染色体单体11例)；多倍体7例(69，XXY, 4例；69，XXX，3例)，染色体数目异常在X、16、21号染色体发生率较高；嵌合体14例，其中16、X号染色体嵌合体发生率较高(见表 2)。
检测结果 n 占总数比例/% 45，X 11 7.33 69，XXY 4 2.67 69，XXX 3 2.00 47，XN, +3 1 0.67 47，XN, +4 3 2.00 47，XN, +5 2 1.33 47，XN, +13 1 0.67 47，XN, +14 2 1.33 47，XN, +15 3 2.00 47，XN, +16 10 6.67 47，XN, +18 5 3.33 47，XN, +20 1 0.67 47，XN, +21 6 4.00 47，XN, +22 1 0.67 49，XN, +3，+14，+5 1 0.67 48，XN, +7，+20 2 1.33 46，XN/45，X 2 1.33 46，XN/47，XN，+3 2 1.33 46，XN/47，XN，+5 1 0.67 46，XN/47，XN，+6 1 0.67 46，XN/47，XN，+7 1 0.67 46，XN/47，XN，+16 4 2.67 46，XN/47，XN，+21 1 0.67 多条染色体嵌合体 2 1.33 表 2 150例流产物染色体非整倍体、多倍体、嵌合体检测结果
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本研究共检出染色体微重复/微缺失4例(2.67%)，同时存在染色体数目、结构异常3例(2.00%)。涉及1、13、14、17、18号染色体，经数据库查询，均存在不同类型的致病性表型(见表 3)。
序号 年龄/岁 孕周/周 孕产史 就诊原因 检测结果 致病性分析 1 29 8+3 G1P0 胚胎停育 Seq[GRCh37]1q21.1 q21.2(145866610-147915109)X1 发育迟缓，先天性心脏病，面部畸形，成人期精神分裂症 2 39 11+5 G4P1 胚胎停育 Seq[GRCh37]18p11.32(1-1553527)X1 发育迟缓，心脏畸形，前脑无裂畸形 3 26 6+6 G1P0 稽留流产 1：Seq[GRCH37]13q31.2 q34(87778439-15169878)X1 2：3q25.32(158047415-158583714)X3 小头畸形，心脏畸形 4 28 9+4 G1P0 稽留流产 1：Seq[GRCh37]14q11.1 q33.33(18944037-107349540)X3 2：45, X 智力低下，发育迟缓，肌张力低下，特纳综合征 5 31 9+5 G1P0 胚胎停育 1：Seq[GRCh37]17P12(14076298-15490260)X1 2：47, XN, +22 发育迟缓，肾脏畸形，智力低下，22-三体综合征 6 40 8+5 G5P2 胚胎停育 1：Seq[GRCh37]17p12(14080405-15473084)X3 2：46, XN/47, XN, +22 Chareot-Marie Tooth病 7 34 9+6 G5P2 胚胎停育 Seq[GRCh37]22q11.21(1888423-21524732)X1 DiGeorge综合征 表 3 流产物染色体CNV的检测结果
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基于高通量测序的CNV-Seq对流产物染色体的测序，是通过将目标染色体的DNA剪切成小片段，构建文库，PCR扩增，以及遗传学信息检测，克服了传统细胞核型技术的染色体制备不良、培养失败、分辨率低等缺点，对染色体非整倍体和染色体CNV可以提供更加准确的遗传学信息，但对染色体多倍体、单亲二倍体、母源性细胞污染的鉴别仍显不足[3]。而STR分型方法是设计荧光引物扩增特定的序列，再进行毛细管电泳，由荧光峰值面积来表达产物扩增的数量，通过等倍基因的剂量变化，来诊断染色体数目异常，对排除母源性细胞污染，以及染色体多倍体、单亲二倍体、性染色体数目异常的诊断具有快速、准确的特点，可弥补CNV-Seq的不足[4]。CNV-Seq联合STR分型方法应用于流产物染色体异常的检测，可覆盖更大范围的染色体异常，能实现对流产物的遗传信息更加准确、全面的诊断，为合理备孕提供科学的依据。
本研究共检出染色体异常79例(52.67%)，其中染色体数目异常56例, 包括染色体非整倍体49例；三倍体7例；嵌合体14例；染色体微重复/微缺失4例；同时存在染色体数目、结构异常3例；单亲二倍体2例。本研究的结果提示：导致自然流产最主要的染色体异常为染色体数目异常(37.33%)，其中主要是染色体非整倍体(32.67%)；其次为嵌合体(9.33%)和三倍体(4.67%)。与自然流产密切相关的染色体异常依次为：45，X、16-三体；69，XNN、21-三体；18-三体；16-三体嵌合体。在染色体异常中的占比依次为13.92%、12.66%、8.86%、7.59%、6.33%、5.06%。相关的临床表现为：69，XNN，常于孕早期出现流产，胎儿可表现为先天性心脏病，肾脏畸形、脑积水、脑部畸形和脊髓脊膜膨出等；45，X，表现为特纳综合征，胎儿发育迟缓，身体矮小，先天性性腺发育不良等，部分胎儿发生孕早期流产；16染色体三体，表现为早孕期胚胎停育。其他染色体三体也有表现为不同程度的，多样性的胎儿畸形，胚胎停育、胎儿宫内生长发育迟缓等临床表现，但检出率较低。NIKITINA等[5]分析了563例自然流产物染色体，染色体正常为296(52.6%), 染色体异常为267(47.4%)；导致自然流产最主要的染色体异常依次为非整倍体、三倍体等，且先前胚胎具有异常核型的孕妇再次受孕后，发生复发流产的频率仍很高。因此，自然流产物的遗传学检查，对指导再次妊娠具有积极意义。
本研究中染色体嵌合体检出14例(9.33%)，分布于3、5、6、7、16、21、X号染色体，其中16号染色体三体嵌合体检出率率最高(2.67%)。16号染色体三体嵌合主要是胚胎早期“三体自救”形成单亲二倍体，或为16-三体/16-二体的复合体，临床表现为：胎儿宫内生长受限、胚胎停育、先天性心脏病、多脏器畸形等[6]。嵌合体的形成可能会增加自然流产的发生率，且嵌合体中异常核型比例越高，临床症状就越明显[7]。单亲二倍体可能因涉及遗传印迹基因、隐性基因纯合突变等, 使胎儿出现各种临床综合征, 表现为胎儿宫内生长受限、器官畸形、胚胎停育等临床症状。本研究中染色体微重复/微缺失以及同时合并染色体数目异常的共7例(4.67%)，均存在不同类型的致病性表型。其中22q11.2微缺失可能导致DiGeorge综合症、腭心面综合症、TaKao综合症等，临床表现包括多种先天畸形：先天性心脏、胸腺发育不全、甲状旁腺功能减退和/或面部畸形。随着时间的推移可能出现的其他临床问题是自身免疫、肾功能不全、发育迟缓、胚胎流产、恶性肿瘤和神经系统表现，如精神分裂症等[8]。17q12微重复涉及Chareot-Marie Tooth病1A型的发生以及压迫麻痹性神经病变，表现为一种慢性进行性肌萎缩症[9]。1q21.1微缺失综合症表现为小头畸形、癫痫发作、发育迟缓和各种先天性异常，如心脏异常和泌尿生殖系统异常等，以及成人期精神分裂症的发生相关[10]。18p11.32微缺失最常见的特征包括严重程度不一的智力低下、身材矮小、流产、前脑无裂畸形、颅面畸形以及言语和认知发育迟缓。其他较少见的临床症状包括行为障碍、心脏畸形、肌张力障碍、生长激素缺乏和自身免疫性疾病[11]。染色体CNV也是导致自然流产的重要因素[12-13]，但其检出率较染色体数目异常低。如检查结果为致病性CNV，还需进一步明确其为新发突变，还是来源于父母。对于检查结果为非致病性的CNV，可能应寻找CNV遗传因素之外的自然流产病因如精子畸形、妇科疾病、内分泌疾病、感染、药物、化学毒物、自身免疫疾病等, 可为再次备孕的产前诊断、遗传咨询提供有价值的临床资料。
综上所述，染色体非整倍体是自然流产的主要遗传学原因。流产物的遗传学的检测，仍需更多的样本量的临床研究。对流产物染色体易位、倒位、单基因病等检测仍面临着一定的困难，仍需选择更多精准的检测方法，避免漏检。对流产物染色体异常的病人，还应结合夫妻双方染色体的检测，从而明确染色体异常的来源，指导再次妊娠。总之，对流产物的遗传学检测可以从基因层面揭示自然流产的病因，对提高生育质量，减少出生缺陷，实现优生优育具有重要的意义。
染色体拷贝数变异测序联合STR分型在流产物遗传学分析中的应用
Application of chromosome copy number variation sequencing combined with STR typing technique in the genetic analysis of abortion
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摘要:
目的对150例流产物进行遗传学检测，并对结果进行分析，为探究自然流产的遗传学病因积累临床资料。 方法选择2020年2-7月在安徽省妇幼保健院妇产科就诊的150例自然流产病人，运用拷贝数变异测序（copy number variation sequencing，CNV-Seq）联合短串联重复序列（Short tandem repeats，STR）分型对流产物进行遗传学检测。 结果150例流产物均成功检测，染色体正常71例（47.33%），染色体异常79例（52.67%），其中染色体数目异常56例，占染色体异常总数的70.89%，染色体微重复/微缺失4例（2.67%），嵌合体14例（9.33%），染色体数目合并结构异常3例（2.00%），单亲二倍体2例（1.33%）。导致自然流产最主要的染色体异常为染色体数目异常（37.33%），包括染色体非整倍体（32.67%）、三倍体（4.67%）；其次为嵌合体（9.33%）。与自然流产密切相关的染色体异常依次为：45，X、16-三体；69，XNN、21-三体；18-三体；16-三体嵌合体。 结论CNV-Seq联合STR技术适用于流产物染色体异常的检测，可覆盖更多范围的染色体异常，能实现更加准确、全面的诊断，对明确自然流产的遗传因素，指导孕妇再次备孕，实现优生优育具有重要的意义。 Abstract:ObjectiveTo explore the genetic causes of spontaneous abortion and accumulate clinical data by genetic detection and analysis of the 150 cases of abortion. MethodsA total of 150 patients with spontaneous abortion who underwent in the Obstetrics and Gynecology Department of Anhui Province Maternity and Child Health Hospital from February 2020 to July 2020 were selected.Copy number variation sequencing(CNV-Seq) combined with short tandem repeats(STR) typing technique were used to detect the genetic characteristics of abortion. ResultsAll 150 cases of abortion were detected successfully, 71 cases were normal(47.33%), 79 cases were chromosomal abnormalities(52.67%).Among them, 56 cases(70.89%) had chromosome number abnormality, 4 cases had chromosome microduplication/microdeletion(2.67%), 14 cases had mosaicisms(9.33%), 3 cases had chromosome number and structure abnormality(2.00%), and 2 cases had uniparental diploid(1.33%).The main chromosomal abnormality which leading to spontaneous abortion was chromosomal number abnormality(37.33%), including chromosome aneuploidy(32.67%) and triploid(4.67%), followed by mosaicisms(9.33%).The chromosomal abnormalities which closely related to spontaneous abortion were (45, X), trisomy 16, (69, XNN), trisomy 21, trisomy18 and mosaic trisomy16. ConclusionsCNV-Seq combined with STR typing technique is suitable for the detection of chromosomal abnormalities in abortion.It can cover more chromosomal abnormalities and also can realize more accurate and comprehensive diagnosis in abortion.It has great significance to diagnose the genetic factors for spontaneous abortion, guide pregnant women to prepare for pregnancy again and realize the eugenics. -
表 1 不同类型染色体异常的检测结果
染色体异常类型 具体异常情况 n 占总数比例/% 染色体数目异常 染色体非整倍体 49 32.67 多倍体 7 4.67 染色体结构异常 染色体微重复/微缺失 4 2.67 染色体嵌合体 嵌合三体 10 6.67 嵌合单体 2 1.33 多条染色体嵌合 2 1.33 纯合区域 单亲二倍体 2 1.33 两种类型及以上异常 染色体数目+结构异常 3 2.00 合计 79 52.67 
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表 2 150例流产物染色体非整倍体、多倍体、嵌合体检测结果
检测结果 n 占总数比例/% 45，X 11 7.33 69，XXY 4 2.67 69，XXX 3 2.00 47，XN, +3 1 0.67 47，XN, +4 3 2.00 47，XN, +5 2 1.33 47，XN, +13 1 0.67 47，XN, +14 2 1.33 47，XN, +15 3 2.00 47，XN, +16 10 6.67 47，XN, +18 5 3.33 47，XN, +20 1 0.67 47，XN, +21 6 4.00 47，XN, +22 1 0.67 49，XN, +3，+14，+5 1 0.67 48，XN, +7，+20 2 1.33 46，XN/45，X 2 1.33 46，XN/47，XN，+3 2 1.33 46，XN/47，XN，+5 1 0.67 46，XN/47，XN，+6 1 0.67 46，XN/47，XN，+7 1 0.67 46，XN/47，XN，+16 4 2.67 46，XN/47，XN，+21 1 0.67 多条染色体嵌合体 2 1.33
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表 3 流产物染色体CNV的检测结果
序号 年龄/岁 孕周/周 孕产史 就诊原因 检测结果 致病性分析 1 29 8+3 G1P0 胚胎停育 Seq[GRCh37]1q21.1 q21.2(145866610-147915109)X1 发育迟缓，先天性心脏病，面部畸形，成人期精神分裂症 2 39 11+5 G4P1 胚胎停育 Seq[GRCh37]18p11.32(1-1553527)X1 发育迟缓，心脏畸形，前脑无裂畸形 3 26 6+6 G1P0 稽留流产 1：Seq[GRCH37]13q31.2 q34(87778439-15169878)X1 2：3q25.32(158047415-158583714)X3 小头畸形，心脏畸形 4 28 9+4 G1P0 稽留流产 1：Seq[GRCh37]14q11.1 q33.33(18944037-107349540)X3 2：45, X 智力低下，发育迟缓，肌张力低下，特纳综合征 5 31 9+5 G1P0 胚胎停育 1：Seq[GRCh37]17P12(14076298-15490260)X1 2：47, XN, +22 发育迟缓，肾脏畸形，智力低下，22-三体综合征 6 40 8+5 G5P2 胚胎停育 1：Seq[GRCh37]17p12(14080405-15473084)X3 2：46, XN/47, XN, +22 Chareot-Marie Tooth病 7 34 9+6 G5P2 胚胎停育 Seq[GRCh37]22q11.21(1888423-21524732)X1 DiGeorge综合征
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