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血管内皮细胞在维持心血管系统的正常生理功能发挥重要作用，它通过分泌一系列血管活性物质调节血液的自分泌、内分泌或旁分泌，改善血流、血管壁张力、血管生成和炎症。由于其屏障功能，血管内皮细胞更容易受到物理或化学危险因素诱导的损伤[1]，因此血管内皮细胞损伤发生在许多临床事件中，包括血管生成、动脉粥样硬化、血栓形成、高血压和心力衰竭[2]。
自噬可以消除不必要或功能失调的细胞器和细胞。众所周知，伴随轻链3 Ⅰ/Ⅱ (LC3 Ⅰ/Ⅱ)和Beclin 1变化的自噬功能障碍与许多疾病的发病机制有关。LC3 Ⅱ是LC3的脂化形式，已被证明是哺乳动物的自噬体标志物，并已应用于研究多种炎症条件下的自噬[3]。Beclin 1是自噬体成核复合物的关键成分，可促进LC3转化和LC3斑点的形成。自噬被破坏，通常会发生LC3 Ⅱ和Beclin 1的表达降低[4]。一些证据表明，血管内皮细胞的自噬功能障碍导致内皮功能障碍和血管稳态破坏，进一步导致心血管疾病的发病机制[5]。此外，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR) 是细胞代谢的主要调节因子，是调节自噬的关键分子[6]。
槲皮素是一种黄酮类化合物，主要存在于中药材。研究[7]表明，槲皮素具有抗氧化、抗癌和抗炎特性，重要的是，槲皮素已被证明可以保护人脐静脉内皮细胞(HUVECs)过氧化氢引起的损伤。而且槲皮素已被证实可在高糖水平可以介导部分细胞系自噬[8]，且氧化应激损伤的线粒体、细胞可通过机体内的自噬降解提高抗氧化能力，增强细胞活力。因此，槲皮素有可能通过介导自噬来防止内皮细胞损伤。本研究主要分析了槲皮素是否可以保护HUVECs免受过氧化氢诱导的损伤并识别可能涉及的机制。
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HUVEC(编号7-1074)购自齐氏生物科技有限公司。槲皮素(成都瑞芬思生物科技有限公司，批号：180704)；兔抗人LC3 Ⅰ/Ⅱ(批号：ABC929)、AKT(批号：SAB4500797)、mTOR(批号：T2949)、β-actin(批号：A3653)抗体、HRP标记的羊抗兔IgG二抗(美国，Sigma公司)。CBl50 CO2细胞培养箱(德国Binder公司)；酶标仪(美国，BioTek)。
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HUVEC在RPMI-1640培养基中培养，辅以10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素，采用5% CO2在37 ℃培养箱中孵育，并进行细胞传代。
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HUVEC以8×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中。细胞贴壁后，分为对照组(RPMI-1640培养基)，H2O2组(200 μmol/L H2O2)，阳性对照组(200 μmol/L H2O2+50 μg/mL维生素E)，槲皮素组(200 μmol/L H2O2+30、15、7.5 μmol/L槲皮素)。
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HUVEC以8×103个细胞/孔的密度接种在96孔板中。细胞贴壁后，依据实验分组给药，48 h后将MTT(20 μL 0.5 mg/μL PBS溶液)加入每个孔中，并将板置于37 ℃下孵育4 h。然后介质去除并在每个孔中加入DMSO(150 μL)，维持10 min以溶解紫色甲臜晶体。使用酶标仪570 μm处测定吸光度。基于以下公式计算细胞活力的百分比：细胞活力(%)=A570给药组/A570对照组×100%。
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MDC染色用作自噬囊泡的示踪剂，阳性细胞在其核区周围着色，所有酸性液泡被染色。对数生长期的细胞接种在24孔板中，设置对照组(RPMI-1640培养基)，H2O2组(200 μmol/L H2O2)，槲皮素组(200 μmol/L H2O2+30、15、7.5 μmol/L槲皮素)，培养48 h制作细胞爬片，细胞爬升片制备过夜进行组处理，37 ℃水浴中加入0.05 mmol/L MDC处理15 min，用PBS洗涤3次，然后用4% 多聚甲醛固定15 min。然后在抗荧光淬灭载玻片上进行荧光显微镜避光观察。
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对数生长期的细胞接种在6孔板中，设置对照组(RPMI-1640培养基)，H2O2组(200 μmol/L H2O2)，槲皮素组(200 μmol/L H2O2+30、15、7.5 μmol/L槲皮素)，培养48 h。将细胞在含有1 mmol/L PMSF的RIPA缓冲液裂解。收集上清液并通过BCA蛋白质测定试剂盒检测蛋白质浓度。在8%~15%梯度SDS-PAGE凝胶上加载和分离蛋白质，然后转移到PVDF膜。用脱脂牛奶封闭非特异性结合位点1 h后，将膜与LC3B(1∶ 1 000)、p-AKT(1∶ 2 000)、AKT(1∶ 2 000)、p-mTOR(1∶ 2 000)、mTOR(1∶ 2 000)、β-actin(1∶ 1 000)一抗一起孵育过夜。然后将膜与辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下以1∶ 5 000稀释度孵育1 h。条带通过WD-9413B成像系统检测，ImageJ软件(1.51a版)用于分析条带密度。
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实验设置对照组、H2O2组(200 μmol/L H2O2)，槲皮素组(200 μmol/L H2O2+30 μmol/L槲皮素)，槲皮素(200 μmol/L H2O2+30 μmol/L槲皮素)+3-MA(10 mmol/L 3-MA)组，处理48 h，每孔添加20 μL MTT，孵育4 h。570 nm测量光密度，Western blotting检测相关蛋白水平。
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采用单因素方差分析和LSD-t检验。
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与对照组比较，H2O2组细胞吸光度值明显降低(P < 0.01), 提示模型建立成功。与H2O2组比较，阳性对照组、30、15、7.5 μmol/L槲皮素组吸光度值明显增加(P < 0.01)(见表 1)。
分组 吸光度(x±s) 细胞活力/% 对照组 0.995±0.015 100.00 H2O2组 0.557±0.057** 55.98±1.24** 阳性对照组(50 μg/mL) 0.716±0.013**△△ 71.96±1.57**△△ 槲皮素组/(μmol/L) 7.5 0.635±0.016**△△ 63.82±1.08**△△ 15 0.715±0.018**△△ 71.86±1.12**△△ 30 0.738±0.017*△△ 74.17±1.21**△△ F 87.42 504.60 P < 0.01 < 0.01 MS组内 0.001 0.001 q检验：与对照组比较**P < 0.01;与H2O2组比较△△P < 0.01 表 1 槲皮素对细胞活力的影响(ni=3)
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与H2O2组比较，槲皮素能增加HUVEC中MDC染色标记的荧光颗粒，并伴随槲皮素浓度的上调明显增加(P < 0.01)(见图 1、表 2)。
图 1 槲皮素对细胞中自噬体的影响
分组 荧光强度 对照组 212.24±21.57 H2O2组 54.23±11.24** 阳性对照组(50 μg/mL) 162.38±18.93**△△ 槲皮素+ H2O2组/(μmol/L) 7.5 101.32±15.32**△△ 15 151.49±18.26**△△ 30 172.52±19.51**△△ F 29.82 P < 0.01 MS组内 0.001 q检验：与对照组比较**P < 0.01;与H2O2组比较△△P < 0.01 表 2 各组HUVEC细胞MDC相对荧光强度(x±s; ni=3)
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槲皮素能促进HUVEC中自噬蛋白LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ水平表达(P < 0.01)，降低p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平(P < 0.01)(见图 2、表 3)。
图 2 槲皮素对自噬相关蛋白的影响
分组 LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ p-AKT/AKT p-mTOR/mTOR 对照组 1.92±0.34 0.15±0.03 0.13±0.04 H2O2组 0.86±0.08** 1.12±0.18** 1.17±0.17** 槲皮素 7.5 1.09±0.11*△ 0.82±0.11**△△ 0.81±0.09**△△ 15 1.35±0.13△△ 0.67±0.09**△△ 0.72±0.07**△△ 30 1.67±0.17△△ 0.21±0.07△△ 0.21±0.06△△ F 15.24 43.54 60.20 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.001 0.001 0.001 q检验：与对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01;与H2O2组比较△P < 0.05, △△P < 0.013-MA对槲皮素诱导自噬的影响(x±s；ni=3) 表 3 槲皮素对自噬相关蛋白的影响(x±s；ni=3)
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与对照组比较，H2O2组LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ明显降低(P < 0.01)，p-mTOR/mTOR明显增加(P < 0.01)，细胞活力明显下调(P < 0.01)；与槲皮素组比较，槲皮素+3-MA组LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ明显降低(P < 0.05)，p-mTOR/mTOR明显增加(P < 0.05)，细胞活力明显降低(P < 0.05)(见图 3、表 4)。
图 3 3-MA对槲皮素诱导自噬的影响
分组 LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ p-mTOR/mTOR 细胞活力/% 对照组 1.82±0.24 0.13±0.04 100 H2O2组 0.87±0.09** 1.18±0.17** 56.12±2.24** 槲皮素组/30 μmol/L 1.59±0.15△ 0.24±0.06△△ 74.12±1.17** 槲皮素+3-MA组 1.02±0.11**# 0.87±0.05**# 61.43±1.35**# F 24.54 83.03 559.30 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.025 0.001 0.001 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与H2O2组比较△P < 0.05, △△P < 0.0；与槲皮素组比较#P < 0.05 表 4 3-MA对槲皮素诱导自噬的影响(x±s；ni=3)
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氧化应激被认为是一种高血糖条件下血管内皮细胞损伤的主要因素。文献[9]显示，槲皮素可被视为抗氧化剂。目前的研究显示，槲皮素可以改善HUVECs暴露于高浓度葡萄糖后的抗氧化防御系统。例如用槲皮素处理后，用30 mmol/L葡萄糖处理的HUVECs细胞的丙二醛和活性氧自由基显着降低[10]。因此，槲皮素对调节氧化剂/抗氧化剂失衡，减少氧化剂对血管内皮损伤具有一定的功能，即通过抗氧化剂清除氧自由基，减少氧化损伤和随后的细胞死亡，并可以通过自噬清除损伤的线粒体、细胞，提高细胞活力。在本研究中，7.5、15、30 μmol/L槲皮素能有效地提高HUVECs细胞活力，这也证实了上述的观点。并且30 μmol/L槲皮素处理HUVECs后，细胞活力达到了74.17%，因此后续验证槲皮素调控自噬的机制时，选择了该浓度进行了相关实验。
槲皮素对H2O2引起的细胞损伤的有效抗氧化能力机制比较复杂，其中自噬作为一种分解代谢过程，能消除受损细胞器，在细胞稳态中发挥着至关重要的作用。自噬受自噬相关基因编码的一些特殊蛋白质的严格调控相关程序[10]。在这些蛋白质中，LC3对于自噬体的生物发生或成熟是必不可少的，它还可作为选择性自噬的衔接蛋白发挥作用。根据多种文献，LC3 Ⅰ被转化为LC3 Ⅱ，这是自噬早期的一个众所周知的标志物[12]。而AKT/mTOR信号通路是负性调控自噬的经典途径，活化AKT使AKT发生磷酸化，之后将信号传至mTOR，触发mTOR磷酸化，从而激活AKT/mTOR信号通路, mTOR通过影响自噬体的形成，对自噬起负调控作用。本研究中，槲皮素会抑制HUVECs细胞中的AKT/mTOR信号传导，诱导自噬体形成和LC3 Ⅱ的上调。自噬阻断(3-MA) 可有效缓解槲皮素对自噬的影响，表明自噬激活有助于槲皮素促进细胞增殖。而且自噬阻断，还会进一步影响AKT/mTOR信号通路的分子水平，自噬抑制剂3-MA和30 μmol/L槲皮素共同处理HUVECs细胞，LC3 Ⅱ表达水平较30 μmol/L槲皮素组明显减弱，mTOR磷酸化水平明显加强，而mTOR磷酸化水平受到p-AKT的调控，这些发现进一步表明AKT/mTOR信号通路参与了HUVECs细胞自噬，并调控细胞增殖。
总之，槲皮素可通过抑制AKT/mTOR信号诱导细胞自噬并促进HUVECs细胞增殖。这些数据阐明了槲皮素改善血管内皮功能的潜在机制，并表明其作为静脉内皮细胞自噬诱导剂的潜在治疗价值。
槲皮素对过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞AKT/mTOR信号通路及自噬的影响
Effect of quercetin on hydrogen peroxide-induced AKT/mTOR signaling pathway and autophagy in human umbilical vein endothelial cells
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摘要:
目的分析槲皮素对人脐静脉内皮细胞自噬和增殖的影响，探讨其与AKT/mTOR信号通路调控的关系及机制。 方法培养人脐静脉内皮细胞，MTT法检测细胞活力，MDC染色法检测自噬泡水平，Western印迹检测自噬相关蛋白水平，运用3-MA研究槲皮素对自噬和细胞增殖的影响。 结果槲皮素能增加人脐静脉内皮细胞活力（P < 0.01），上调细胞中MDC染色标记的荧光颗粒，并伴随浓度的上调明显增加（P < 0.01），能促进脐静脉内皮细胞中自噬蛋白LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ水平表达（P < 0.01），降低p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR水平（P < 0.01）。与槲皮素组比较，槲皮素+3-MA组细胞活力和LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ均明显降低（P < 0.05），p-mTOR/mTOR明显增加（P < 0.05）。 结论槲皮素可通过抑制AKT/mTOR信号通路诱导细胞自噬来调控脐静脉内皮细胞增殖。 -
关键词:
- 槲皮素 /
- AKT/mTOR信号通路 /
- 自噬 /
- 脐静脉内皮细胞 /
- 细胞增殖
Abstract:ObjectiveTo analyze the effect of quercetin on autophagy and proliferation of human umbilical vein endothelial cells and its relationship with AKT/mTOR signaling pathway. MethodsMTT method was used to detect cell viability.MDC staining was used to detect the level of autophagy vesicles.Western blotting was used to detect the levels of autophagy-related proteins, and 3-MA was used to study the effect of quercetin on autophagy and cell proliferation. ResultsQuercetin increased the viability of human umbilical vein endothelial cells and up-regulated the fluorescent particles labeled by MDC staining in the cells followed with the increase in concentration, which promoted the expressions of autophagy protein LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ in umbilical vein endothelial cells and reduce the levels of p-AKT/AKT and p-mTOR/mTOR(P < 0.01).Compared with the quercetin group, the cell viability and LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ of the quercetin+3-MA group were significantly reduced, and p-mTOR/mTOR was significantly increased(P < 0.05). ConclusionsQuercetin can regulate the proliferation of umbilical vein endothelial cells by inhibiting the AKT/mTOR signaling pathway and inducing autophagy. -
表 1 槲皮素对细胞活力的影响(ni=3)
分组 吸光度(x±s) 细胞活力/% 对照组 0.995±0.015 100.00 H2O2组 0.557±0.057** 55.98±1.24** 阳性对照组(50 μg/mL) 0.716±0.013**△△ 71.96±1.57**△△ 槲皮素组/(μmol/L) 7.5 0.635±0.016**△△ 63.82±1.08**△△ 15 0.715±0.018**△△ 71.86±1.12**△△ 30 0.738±0.017*△△ 74.17±1.21**△△ F 87.42 504.60 P < 0.01 < 0.01 MS组内 0.001 0.001 q检验：与对照组比较**P < 0.01;与H2O2组比较△△P < 0.01 
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表 2 各组HUVEC细胞MDC相对荧光强度(x±s; ni=3)
分组 荧光强度 对照组 212.24±21.57 H2O2组 54.23±11.24** 阳性对照组(50 μg/mL) 162.38±18.93**△△ 槲皮素+ H2O2组/(μmol/L) 7.5 101.32±15.32**△△ 15 151.49±18.26**△△ 30 172.52±19.51**△△ F 29.82 P < 0.01 MS组内 0.001 q检验：与对照组比较**P < 0.01;与H2O2组比较△△P < 0.01
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表 3 槲皮素对自噬相关蛋白的影响(x±s；ni=3)
分组 LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ p-AKT/AKT p-mTOR/mTOR 对照组 1.92±0.34 0.15±0.03 0.13±0.04 H2O2组 0.86±0.08** 1.12±0.18** 1.17±0.17** 槲皮素 7.5 1.09±0.11*△ 0.82±0.11**△△ 0.81±0.09**△△ 15 1.35±0.13△△ 0.67±0.09**△△ 0.72±0.07**△△ 30 1.67±0.17△△ 0.21±0.07△△ 0.21±0.06△△ F 15.24 43.54 60.20 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.001 0.001 0.001 q检验：与对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01;与H2O2组比较△P < 0.05, △△P < 0.013-MA对槲皮素诱导自噬的影响(x±s；ni=3)
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表 4 3-MA对槲皮素诱导自噬的影响(x±s；ni=3)
分组 LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ p-mTOR/mTOR 细胞活力/% 对照组 1.82±0.24 0.13±0.04 100 H2O2组 0.87±0.09** 1.18±0.17** 56.12±2.24** 槲皮素组/30 μmol/L 1.59±0.15△ 0.24±0.06△△ 74.12±1.17** 槲皮素+3-MA组 1.02±0.11**# 0.87±0.05**# 61.43±1.35**# F 24.54 83.03 559.30 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.025 0.001 0.001 q检验：与对照组比较**P < 0.01；与H2O2组比较△P < 0.05, △△P < 0.0；与槲皮素组比较#P < 0.05
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