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宫缩乏力是产后出血的重要原因，产后出血严重或者抢救不及时可增加孕产妇死亡风险[1]。一般认为宫缩乏力性产后出血与子宫肌细胞收缩功能异常密切相关，而调控子宫平滑肌收缩的相关信号通路表达异常则是引起产后出血的关键因素[2]。RhoA/Rho信号通路属于钙敏化调节通路，大量研究已证实其在调控平滑肌收缩中发挥重要作用，可抑制平滑肌中肌球蛋白轻链磷酸酶的活性，以及诱导肌球蛋白轻链的磷酸化，从而维持或者促进平滑肌的收缩功能[3]。AKTAS等[4]研究发现抑制RhoA/Rho信号通路后，则可有效抑制缩宫素诱导的子宫平滑肌收缩力，表明RhoA/Rho信号通路参与了平滑肌的收缩调控。CPI-17(Thr38)、中电导钙激活钾通道(KCa3.1)、Krüppel样因子4(Krüppel-likefactors, KLF4)均是维持平滑肌组织功能的重要蛋白，KLF4可促进平滑肌细胞的表型转化，增加其的增殖和迁移能力，以及促进损伤修复，Thr38属于钙敏化调节因子，也可抑制平滑肌中肌球蛋白轻链磷酸酶活性等[5-7]。目前，关于Thr38、KCa3.1、KLF4与RhoA/Rho信号通路的关系，以及与宫缩乏力性产后出血的关系尚未完全明确，本研究将通过实例进一步探讨，旨在研究宫缩乏力性产后出血的分子机制，从而为临床治疗提供指导。
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选择2018年4月至2021年4于我院收治的80例宫缩乏力性产后出血产妇为观察组，选择同期80例无产后出血产妇为对照组。2组产妇的年龄、产次、孕周等一般资料差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 1)，具有可比性。本研究获得本院伦理委员会批准。
分组 n 年龄/岁 孕周/周 产前BMI/
(kg/m2)产次/次 新生儿体质量/g 观察组 80 58.26±7.13 38.96±1.13 26.57±3.15 1.16±0.33 3 305±413 对照组 80 57.33±6.41 39.23±1.21 27.03±2.91 1.37±0.41 3 403±421 t — 1.05 1.46 0.96 1.87 1.49 P — >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 表 1 2组产妇基线资料的比较(x±s)
产后出血诊断标准[8]：参照乐杰主编的第7版《妇产科学》。失血量采用称重法以及羊水压积测定法测量。称重法：失血量(mL) =[胎儿娩出后接血敷料重(湿重) (g)-接血前敷料重(干重) (g)] /1.05(血液比重为g/mL)。羊水压积测定法：血羊水中血量(mL)=总羊水和血混合液量×羊水中血细胞比容/产前外周血中血细胞比容。
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产妇剖宫产时，预防性使用缩宫素前，剪取子宫下段切口上缘的子宫平滑肌，大小为0.15cm×0.15cm×1.0 cm，立即放入0 ℃克亨氏溶液(Kreb-Henseleit，K-H)，于4 h内测定肌张力。另取0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm大小的标本，采用蛋白质印迹法以及实时荧光定量反转录聚合酶链反应检测相关蛋白、mRNA表示水平。
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将剪取的标本悬挂于37 ℃克亨氏液体浴槽中，通入95%O2、5% CO2的混合气体，连接张力换能器(成都仪器厂)，置前负荷2 g，平衡60 min后，记录子宫平滑肌的收缩活动力、频率以及幅度，采集时间为20 min。待肌条收缩稳定之后，加入终浓度为1 μmol/L的Rho激酶抑制剂Y-27632(美国Sigma公司)，观察子宫平滑肌收缩情况。
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采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应法检测肌条中RhoA、ROCKⅠ以及ROCKⅡmRNA表达水平。按RNAiso Plus试剂盒(Thermo Fisher Scientific)说明书提取标本中的总RNA，分光光度计定量RNA浓度。采用miRNA逆转录试剂盒(Takara公司)逆转录miRNA并进行PCR扩增，RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ、mRNA以及内参U6引物探针由大连宝生物工程有限公司提供，引物序列见表 2。PCR扩增条件：95 ℃预变性5min，95 ℃变性20s，60℃退火20s，共45个循环。采用ABI Prisme Step-one荧光定量PCR仪(Applied Biosystems AB)进行检测，以2-△△ct表示RhoA、ROCKⅠ以及ROCKⅡmRNA相对表达量，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。
miRNA 上游引物 下游引物 RhoA 5′-CTT GCT ACC AGT ATT TAG AA-3′ 5′-AGC CTA ATT CAC AAA AGT TA -3′ ROCKⅠ 5′-CCA ACT ATC GTC TTC CTC -3′ 5′-CCT CAC TCT CCC ATT TTG-3′ ROCKⅡ 5′-CCG ATC ATC TCC TAG AAC -3′ 5′-GCC ATC ATA TTT CAG TCT TG -3′ U6 5′-GCT TCG GCA GCA CAT A-3′ 5′-CTT CAC GAA TTT GCG TG-3′ 表 2 引物序列
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采用蛋白质印迹法检测RhoA、ROCKⅠ以及ROCKⅡ以及Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平，研磨消化标本组织，采用BCA法测定中蛋白浓度。十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后转移至硝酸纤维薄膜上，分别按1:1 000的比例加入对应多克隆抗体(英国Abcam公司)，孵育过夜，次日洗膜，加入二抗-HRP标记的山羊抗兔IgG(美国Santa Cruze公司)。显影，定影，摄片，以β-肌动蛋白(β-Actin)为内参蛋白，用凝胶定量分析软件(Gel-Pro Analyzer 4) 读取蛋白条带灰度值，以目标蛋白/β-Actin的比值表示目标蛋白相对表达量。
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采用t检验和Pearson相关性分析。
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观察组的子宫平滑肌收缩活动力、收缩频率以及收缩幅度均低于对照组(P < 0.05~P < 0.01)，加入Y-27632后，2组子宫平滑肌收缩活动力均低于加入前(P < 0.05)(见表 3)。
分组 n 收缩活动力/
(克·次-1·20分-1)收缩频率/
(次/20分)收缩幅度/g 加入Y-27632前 观察组 80 8.32±1.67 4.12±1.25 2.05±0.67 对照组 80 11.73±2.06 4.73±1.19 2.47±0.59 t — 11.50 3.16 4.21 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 加入Y-27632后 观察组 80 5.72±1.46* 3.82±1.15* 1.53±0.35* 对照组 80 7.43±1.64* 4.23±1.24* 1.75±0.38* t — 6.97 2.17 3.81 P — < 0.01 < 0.05 < 0.01 组内配对t检验：*P < 0.05 表 3 2组产妇子宫平滑肌收缩活力情况比较(x±s)
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观察组的RhoA/Rho信号通路相关mRNA以及蛋白(RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ)表达水平均低于对照组(P < 0.01)(见表 4、5)。
分组 n RhoA ROCKⅠ ROCKⅡ 观察组 80 0.832±0.187 0.742±0.166 0.612±0.155 对照组 80 1.073±0.226 1.043±0.194 0.975±0.169 t — 7.35 10.54 14.16 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 表 4 2组产妇RhoA/Rho信号通路相关mRNA水平比较(x±s)
分组 n RhoA ROCKⅠ ROCKⅡ 观察组 80 0.514±0.125 0.421±0.106 0.435±0.117 对照组 80 0.772±0.129 0.683±0.115 0.677±0.124 t — 12.85 14.98 12.70 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 表 5 2组产妇RhoA/Rho信号通路相关蛋白水平比较(x±s)
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观察组Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平均低于对照组(P < 0.01)(见表 6)。
分组 n Thr38 KCa3.1 KLF4 观察组 80 0.714±0.146 0.872±0.225 0.632±0.184 对照组 80 0.879±0.156 1.094±0.253 0.972±0.254 t — 6.91 5.87 9.70 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 表 6 2组产妇Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平比较(x±s)
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Pearson相关分析显示，子宫平滑肌RhoA/Rho信号通路相关蛋白、收缩活动力分别与Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平呈正相关性(P < 0.05)(见表 7)。
指标 Thr38 KCa3.1 KLF4 RhoA 0.529* 0.512* 0.547* ROCK Ⅰ 0.586* 0.556* 0.623* ROCK Ⅱ 0.518* 0.503* 0.536* 收缩活动力 0.496* 0.474* 0.508* *P < 0.05 表 7 RhoA/Rho信号通路相关蛋白、收缩活动力与Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平的关系(r)
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既往认为，产妇子宫平滑肌中缩宫素的受体数量减少可导致子宫收缩潜能、收缩活动力下降，是引起产后出血的重要分子机制[9]。且研究也证实使用小剂量缩宫素可明显增加产妇的子宫平滑肌收缩活动力和频率，而进一步增加剂量或者提供缩宫素的浓度，刺激1 h后可导致缩宫素受体脱敏，进而引起收缩抑制[10]。近年研究发现RhoA/Rho激酶信号通路参与了多种平滑肌收缩舒张功能障碍相关的疾病，Rho激酶属于丝苏氨酸蛋白激酶，存在ROCK Ⅰ、ROCKⅡ 2种异构体，是RhoA下游的重要靶分子，RhoA与ROCK特异性结合后，通过磷酸化ROCK多个位点而活化信号通路，抑制平滑肌中肌球蛋白轻链磷酸酶活性，进而阻止肌球蛋白轻链的脱磷酸化，增强平滑肌收缩力[11]。本次研究结果显示，观察组的RhoA/Rho信号通路相关蛋白以及mRNA(RhoA、ROCK Ⅰ、ROCK Ⅱ)表达水平均低于对照组(P < 0.01)，且进一步通过Pearson相关分析显示通路蛋白表达水平与子宫平滑肌收缩活动力呈正相关(P < 0.05)，表明RhoA/Rho信号通路可能参与调节子宫平滑肌收缩功能，但宫缩乏力性产后出血产妇的子宫平滑肌组织中RhoA/Rho信号通路处于低表达状态，导致子宫平滑肌收缩力降低，进而引起宫缩乏力性产后出血。有研究[12]认为，正常妊娠孕妇于妊娠晚期以及产前时体内缩宫素受体明显增加，进而诱导RhoA的表达，而产后出血产妇的体内缩宫素受体表达水平明显降低，进而减少对RhoA的诱导作用，导致RhoA/Rho信号通路活化受阻。同时，也有研究[13]认为正常妊娠孕妇临产前子宫平滑肌组织内的一氧化氮水平显著降低，而一氧化氮可通过激活环鸟苷酸依赖性激酶，进而抑制RhoA的膜转位，阻止RhoA/Rho信号通路的转导，而产后出血产妇的一氧化氮变化不明显，相对正常产妇为高水平状态，故而使得RhoA/Rho信号通路抑制的增加，子宫平滑肌收缩活动力减弱，最终引起产后出血。
Thr38是调节钙敏感性的重要分子，作为肌球蛋白轻链磷酸酶的假底物，可与之结合而使得肌球蛋白轻链磷酸酶失活，进而抑制肌球蛋白轻链的去磷酸化，增加细胞质中肌球蛋白轻链的磷酸化水平，促进肌动-肌球蛋白交联以及肌动蛋白微丝骨架的聚合，最终诱导平滑肌细胞收缩[14-15]。KCa3.1是钙激活钾通道家族中的一员，细胞内高钙离子水平激活KCa3.1通道，从而促进钾外流，调控细胞内的钙信号以及细胞膜电位，KCa3.1通道表达增加可促进平滑肌细胞的增殖、迁移等生理过程[16]。KLF4在多种平滑肌中具有调控作用，促进平滑肌细胞的增殖和分化，介导调控血管平滑肌表型转换[17]。本次研究结果显示，观察组Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平均低于对照组，进一步通过相关分析显示Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平与收缩活动力呈正相关关系(P < 0.05)，表明Thr38、KCa3.1、KLF4与子宫平滑肌收缩功能密切关联，其在宫缩乏力性产后出血产妇的子宫平滑肌组织中低表达，使得子宫平滑肌收缩力降低，进而导致宫缩乏力性产后出血。同时本次研究发现RhoA/Rho信号通路相关蛋白表达水平与Thr38、KCa3.1、KLF4呈正相关性，提示平滑肌组织中RhoA/Rho信号通路可能参与Thr38、KCa3.1、KLF4的表达调控，以上因子在调控平滑肌收缩力方面存在整合，相互影响活化状态，共同参与宫缩乏力性产后出血的发生。
综上所述，宫缩乏力性产后出血产妇子宫平滑肌组织的子宫平滑肌组织RhoA/Rho信号通路以及Thr38、KCa3.1、KLF4表达下降，且与收缩能力降低呈正相关性，两者相互调控共同参与产后出血的发生。
基于RhoA/Rho信号通路探讨产妇子宫平滑肌组织Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平与产后出血的关系
The relationship between the expression levels of Thr38, KCa3.1 and KLF4 in uterine smooth muscle and postpartum hemorrhage based on RhoA/Rho signaling pathway
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摘要:
目的基于RhoA/Rho信号通路探讨产妇子宫平滑肌组织CPI-17（Thr38）、KCa3.1、Krüppel样因子4（KLF4）表达水平与产后出血的关系。 方法选择80例宫缩乏力性产后出血产妇为观察组，选择同期80例无产后出血产妇为对照组。采用肌条等长张力测定法检测离体子宫平滑肌的自发收缩活动力，以及加入Rho激酶抑制剂（Y-27632）后的子宫平滑肌收缩活动力。采用实时荧光定量反转录聚合酶链反应法检测子宫平滑肌组织中RhoA、ROCKⅠ以及ROCKⅡmRNA表达水平，采用蛋白质印迹法检测RhoA、ROCKⅠ以及ROCKⅡ以及Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平。采用Pearson相关分析RhoA蛋白以及子宫平滑肌收缩活动力与Thr38、KCa3.1、KLF4的关系。 结果观察组的子宫平滑肌收缩活动力、收缩频率以及收缩幅度均低于对照组（P < 0.05~P < 0.01），加入Y-27632后，2组子宫平滑肌收缩活动力均低于加入前（P < 0.05）。观察组RhoA/Rho信号通路相关mRNA以及蛋白（RhoA、ROCKⅠ、ROCKⅡ）表达水平均低于对照组（P < 0.01）。观察组Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平均低于对照组（P < 0.01）。Pearson相关分析显示，子宫平滑肌RhoA/Rho信号通路相关蛋白、收缩活动力与Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平均呈正相关关系（P < 0.05）。 结论宫缩乏力性产后出血产妇子宫平滑肌组织的RhoA/Rho信号通路以及Thr38、KCa3.1、KLF4表达下降，且与收缩能力降低呈正相关关系，共同参与产后出血的发生。 -
关键词:
- 产后出血 /
- 子宫平滑肌组织 /
- RhoA/Rho信号通 /
- p-CPI-17 /
- KCa3.1 /
- Krüppel样因子4
Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of p-cpi-17 (Thr38), KCa3.1 and Kr in uterine smooth muscle tissue of puerpera and postpartum hemorrhage based on RhoA/Rho signaling pathway. MethodsA total of 80 patients of postpartum hemorrhage due to uterine inertia were selected as study group, and 80 patients without postpartum hemorrhage in the same period were selected as control group.The spontaneous contractile activity of isolated uterine smooth muscle and the contractile activity of uterine smooth muscle with Rho kinase inhibitor were measured by isometric tension test.Real-time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction method was used to detect the expression levels of RhoA, ROCKⅠ, and ROCKⅡmRNA in uterine smooth muscle tissues.Western blotting was used to detect the expression levels of RhoA, ROCKⅠ, ROCKⅡ, Thr38, KCa3.1, and KLF4.Pearson correlation was used to analyze the relationship between RhoA protein and uterine smooth muscle contractility and Thr38, KCa3.1, KLF4. ResultsThe uterine smooth muscle contraction activity, contraction frequency and contraction amplitude of the study group were lower than those of the control group (P < 0.05 to P < 0.01).After Y-27632 was added, the uterine smooth muscle contraction activity was lower than before (P < 0.05).The expression levels of RhoA/Rho signaling pathway related mRNA and protein (RhoA, ROCKⅠ, ROCK Ⅱ) in the study group were lower than those in the control group (P < 0.01).The expression levels of Thr38, KCa3.1, and KLF4 in the study group were lower than those in the control group (P < 0.01).Pearson correlation analysis showed that RhoA/Rho signaling pathway related proteins and contractile activity were positively correlated with Thr38, KCa3.1, and KLF4 expression levels (P < 0.05). ConclusionsThe RhoA/Rho signaling pathway and expression of Thr38, KCa3.1, and KLF4 decrease in uterine smooth muscle tissue of parturients with postpartum hemorrhage due to uterine asthenia, and are positively correlated with the decrease of contractility, and jointly participate in the occurrence of postpartum hemorrhage. -
表 1 2组产妇基线资料的比较(x±s)
分组 n 年龄/岁 孕周/周 产前BMI/
(kg/m2)产次/次 新生儿体质量/g 观察组 80 58.26±7.13 38.96±1.13 26.57±3.15 1.16±0.33 3 305±413 对照组 80 57.33±6.41 39.23±1.21 27.03±2.91 1.37±0.41 3 403±421 t — 1.05 1.46 0.96 1.87 1.49 P — >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 
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表 2 引物序列
miRNA 上游引物 下游引物 RhoA 5′-CTT GCT ACC AGT ATT TAG AA-3′ 5′-AGC CTA ATT CAC AAA AGT TA -3′ ROCKⅠ 5′-CCA ACT ATC GTC TTC CTC -3′ 5′-CCT CAC TCT CCC ATT TTG-3′ ROCKⅡ 5′-CCG ATC ATC TCC TAG AAC -3′ 5′-GCC ATC ATA TTT CAG TCT TG -3′ U6 5′-GCT TCG GCA GCA CAT A-3′ 5′-CTT CAC GAA TTT GCG TG-3′
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表 3 2组产妇子宫平滑肌收缩活力情况比较(x±s)
分组 n 收缩活动力/
(克·次-1·20分-1)收缩频率/
(次/20分)收缩幅度/g 加入Y-27632前 观察组 80 8.32±1.67 4.12±1.25 2.05±0.67 对照组 80 11.73±2.06 4.73±1.19 2.47±0.59 t — 11.50 3.16 4.21 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 加入Y-27632后 观察组 80 5.72±1.46* 3.82±1.15* 1.53±0.35* 对照组 80 7.43±1.64* 4.23±1.24* 1.75±0.38* t — 6.97 2.17 3.81 P — < 0.01 < 0.05 < 0.01 组内配对t检验：*P < 0.05
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表 4 2组产妇RhoA/Rho信号通路相关mRNA水平比较(x±s)
分组 n RhoA ROCKⅠ ROCKⅡ 观察组 80 0.832±0.187 0.742±0.166 0.612±0.155 对照组 80 1.073±0.226 1.043±0.194 0.975±0.169 t — 7.35 10.54 14.16 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01
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表 5 2组产妇RhoA/Rho信号通路相关蛋白水平比较(x±s)
分组 n RhoA ROCKⅠ ROCKⅡ 观察组 80 0.514±0.125 0.421±0.106 0.435±0.117 对照组 80 0.772±0.129 0.683±0.115 0.677±0.124 t — 12.85 14.98 12.70 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01
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表 6 2组产妇Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平比较(x±s)
分组 n Thr38 KCa3.1 KLF4 观察组 80 0.714±0.146 0.872±0.225 0.632±0.184 对照组 80 0.879±0.156 1.094±0.253 0.972±0.254 t — 6.91 5.87 9.70 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01
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表 7 RhoA/Rho信号通路相关蛋白、收缩活动力与Thr38、KCa3.1、KLF4表达水平的关系(r)
指标 Thr38 KCa3.1 KLF4 RhoA 0.529* 0.512* 0.547* ROCK Ⅰ 0.586* 0.556* 0.623* ROCK Ⅱ 0.518* 0.503* 0.536* 收缩活动力 0.496* 0.474* 0.508* *P < 0.05
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