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类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是临床常见的一种系统性自身免疫性疾病,随着疾病的发展病人关节骨与软骨组织逐渐被破坏,甚至致使病人残疾,研究[1-2]发现滑膜成纤维细胞过度增殖及迁移可促进RA的发展。环状RNA(circular RNA,circRNA)是由5′端与3′端以共价键结合形成的一种环状RNA分子,其在RA或滑膜成纤维细胞中表达异常,并可能调控细胞增殖及转移等过程[3-4]。circPTPRA高表达可促进动脉粥样硬化的发生及发展[5]。但circPTPRA与RA的相关研究尚鲜见报道。生物信息学预测显示circPTPRA与miR-140-5p存在结合位点,研究[6]表明miR-140-5p在RA滑膜成纤维细胞中表达下调,其可抑制细胞增殖及炎性因子的分泌。但circPTPRA/miR-140-5p分子轴在RA发生发展过程中的作用机制尚未阐明。因此,本研究主要探讨circPTPRA通过靶向调控miR-140-5p而影响RA滑膜成纤维细胞增殖及转移。
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选取2019年10月至2020年1月期间于本院关节外科行膝关节置换术的26例RA病人为研究对象,所有病人均符合2010ACR/EULAR颁布的类风湿关节炎分类标准,其中男16例,女10例,年龄52~67岁,平均年龄(58.59±7.46)岁,术中切除滑膜组织置于-80 ℃冰箱内保存。选取同期于本院接受关节手术的外伤病人26例为对照,所有病人均为外伤所致且均未患有RA,其中男16例,女10例,年龄45~66岁,平均年龄(57.26±3.25)岁。
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DMEM培养液与胎牛血清购自美国Gibco;MTT、DMSO购自美国Sigma;Lipofectamine2000、Transwell小室购自北京索莱宝;Trizol试剂购自美国Invitrogen;逆转录试剂及qRT-PCR试剂均购自美国Thermo Fisher;si-NC、si-circPTPRA、miR-NC、miR-140-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-140-5p购自广州锐博生物;pcDNA3.1、pcDNA-circPTPRA购自上海吉玛;兔抗人CyclinD1、MMP2、MMP9与二抗购自美国CST。
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取出病人的滑膜组织,PBS浸泡后冲洗,剪去滑膜附属的外周组织,将滑膜组织剪接呈小块(2 mm3),PBS洗涤后将组织块转移至细胞培养瓶内,于37℃培养箱内培养30 min,向培养瓶中加入含有10%胎牛血清的DMEM培养液3 mL,继续培养,用倒置显微镜下观察细胞生长情况,待细胞汇合度达到90%时进行传代培养,选用第3~4代细胞进行后续实验[7]。
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RA滑膜成纤维细胞按照每孔1×105个细胞的密度接种于6孔板,用不含胎牛血清的培养液分别稀释si-NC、si-circPTPRA、miR-NC、miR-140-5p mimics、anti-miR-NC与si-circPTPRA、anti-miR-140-5p与si-circPTPRA室温孵育5 min(A液),用不含胎牛血清的培养液稀释Lipofectamine2000转染试剂(B液),A液与B液充分混匀后按照每孔400 μL的密度加入6孔板中,分别记为si-NC组、si-circPTPRA组、miR-NC组、miR-140-5p组、anti-miR-NC+si-circPTPRA组、anti-miR-140-5p+si-circPTPRA组。同时将未经转染的RA滑膜成纤维细胞记为NC组。
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研磨RA滑膜成纤维细胞与正常滑膜成纤维细胞后用Trizol试剂提供细胞总RNA,将总RNA逆转录合成cDNA,以2 μL cDNA为模板进行荧光定量PCR实验,按照试剂盒说明书操作并用2-ΔΔCt法分析circPTPRA、miR-140-5p的表达水平。
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取各组RA滑膜成纤维细胞按照每孔5000个细胞的密度接种于96孔板,于37℃培养箱内培养24 h,分别进行MTT反应并用酶标仪检测490 nm处的吸光度值。
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收集RA滑膜成纤维细胞(5×105个/毫升)加入上室中(200微升/孔),在小室加入500 μL含有20%胎牛血清的培养液,孵育24 h后取出小室,PBS洗涤后用甲醇固定20 min,结晶紫染色液染色15 min,用水冲洗后晾干,于显微镜下拍照,随机选取5个视野计数细胞数量。
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构建包含miR-140-5p潜在结合序列的circPTPRA重组荧光素酶报告质粒WT-circPTPRA及包含突变结合序列的重组质粒MUT-circPTPRA,RA滑膜成纤维细胞按照每孔1×105个细胞的密度接种于12孔板,分别转染1.5 μg重组荧光素酶报告质粒与miR-140-5p mimics(100 nmol/L)或miR-NC(100 nmol/L),24 h后检测萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性,二者荧光素酶活性比值可表示circPTPRA与miR-140-5p的结合能力。
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取各组RA滑膜成纤维细胞加入100 μL蛋白裂解液(1 μL蛋白酶抑制剂与1 μL磷酸酶抑制剂)提取细胞总蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度,蛋白样品煮沸后变性,按照每孔50 μg蛋白上样进行SDS-PAGE电泳反应,分离后蛋白湿转至PVDF膜,用8%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜1.5 h,加入CyclinD1(1∶800)、MMP2(1∶800)、MMP9(1∶800)、β-actin(1∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜,TBST洗涤后二抗(1∶2 000)孵育1 h,ECL化学发光法显示条带,用ImageJ软件分析各条带灰度值。
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采用t检验、方差分析及q检验。
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与Control组比较,RA-FLSs组circPTPRA的表达量升高,miR-140-5p的表达量降低(P < 0.01)(见表 1)。
分组 n circPTPRA miR-140-5p Control组 9 1.00±0.07 1.00±0.10 RA-FLSs组 9 2.84±0.16 0.41±0.03 t — 31.61 16.95 P — < 0.01 < 0.01 表 1 RA滑膜成纤维细胞RA-FLSs中circPTPRA及miR-140-5p表达情况(x±s;ni=9)
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与si-NC组比较,si-circPTPRA组细胞活力降低,迁移细胞数减少,CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平降低(P < 0.05)(见图 1、表 2)。
分组 circPTPRA CyclinD1 MMP2 MMP9 吸光度值 细胞迁移数量 NC组 1.00±0.10 0.82±0.06 0.89±0.06 0.71±0.06 0.946±0.07 167.03±10.03 si-NC组 0.98±0.07 0.81±0.08 0.90±0.07 0.70±0.07 0.937±0.07 161.01±8.77 si-circPTPRA组 0.42±0.03* 0.39±0.02* 0.43±0.03* 0.33±0.03* 0.517±0.05* 84.02±5.11* F 185.24 156.38 207.10 134.71 131.90 284.07 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.005 0.002 0.002 0.001 0.002 67.875 q检验: 与si-NC组比较*P < 0.05 表 2 低表达circPTPRA对RA滑膜成纤维细胞RA-FLSs增殖和转移的影响(x±s;ni=9)
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与miR-NC组比较,miR-140-5p组细胞活力降低,迁移细胞数减少,CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平降低(P < 0.01)(见图 2、表 3)。
分组 miR-140-5p CyclinD1 MMP2 MMP9 吸光度值 细胞迁移数量 miR-NC组 1.00±0.10 0.82±0.08 0.92±0.08 0.72±0.07 0.942±0.08 164.07±7.53 miR-140-5p组 1.96±0.11 0.43±0.03 0.48±0.03 0.34±0.03 0.549±0.05 76.06±4.06 t 19.37 13.69 15.45 14.97 12.50 30.86 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 表 3 miR-140-5p对RA滑膜成纤维细胞RA-FLSs增殖和转移的影响(x±s;ni=9)
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circPTPRA与miR-140-5p存在结合位点(见图 3)。miR-140-5p过表达可明显降低野生型载体WT-circPTPRA的荧光素酶活性(P < 0.01)(见表 4)。circPTPRA可负向调控miR-140-5p的表达(P < 0.05)(见表 5)。
分组 荧光素酶活性 WT-circPTPRA MUT-circPTPRA miR-NC组 1.00±0.07 1.00±0.09 miR-140-5p组 0.46±0.03 0.98±0.09 t 21.27 0.47 P < 0.01 >0.05 表 4 双荧光素酶活性检测(x±s;ni=9)
分组 circPTPRA miR-140-5p pcDNA-NC组 1.00±0.08 1.00±0.10 pcDNA-circPTPRA组 2.69±0.15* 0.39±0.04* si-NC 1.02±0.09 1.04±0.09 si-circPTPRA组 0.48±0.03*# 2.37±0.18*# F 877.96 481.52 P < 0.01 < 0.01 MS组内 0.005 0.007 q检验: 与pcDNA-NC组比较*P < 0.05;与si-NC组比较#P < 0.05 表 5 qRT-PCR检测miR-140-5p的表达(x±s;ni=9)
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与anti-miR-NC+si-circPTPRA组比较,anti-miR-140-5p+si-circPTPRA组细胞活力升高,迁移细胞数增多,CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平升高(P < 0.01)(见图 4、表 6)。
分组 miR-140-5p CyclinD1 MMP2 MMP9 吸光度值 细胞迁移数量 anti-miR-NC+si-circPTPRA组 1.00±0.07 0.38±0.02 0.45±0.04 0.32±0.02 0.523±0.04 88±4.89 anti-miR-140-5p+si-circPTPRA组 0.45±0.03 0.86±0.07 0.81±0.06 0.77±0.06 0.973±0.07 179±13.22 t 21.67 19.78 14.98 21.35 16.75 19.37 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 表 6 anti-miR-140-5p逆转si-circPTPRA对RA-FLSs增殖和转移的影响(x±s;ni=9)
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circRNA与线性RNA不同,其不易被降解且具有组织、时序特异性,研究[8-10]发现circRNA在RA病人中表达异常,并可能作为临床诊断RA的潜在生物标志物,但circRNA在RA形成及发展过程中的作用机制尚需进一步探究。
circPTPRA在膀胱癌中表达下调,并可通过充当miR-636的海绵分子而上调KLF9表达进而抑制膀胱癌的发展进程[11]。有研究[12]发现circPTPRA可抑制非小细胞肺癌细胞转移。但circPTPRA在RA中的表达及其作用机制尚未可知。本研究结果显示,RA滑膜成纤维细胞中circPTPRA的表达量升高,干扰circPTPRA表达可明显降低RA滑膜成纤维细胞活力及CyclinD1蛋白水平。研究[13]表明CyclinD1与CDK4/6结合形成复合物而正向调控细胞周期,促进细胞增殖。本研究结果提示干扰circPTPRA表达可抑制RA滑膜成纤维细胞增殖。MMP2、MMP9可降解细胞外基质而促进细胞转移[14]。本研究结果显示,干扰circPTPRA表达后RA滑膜成纤维细胞迁移细胞数减少,MMP2、MMP9蛋白水平降低,提示干扰circPTPRA表达可抑制RA滑膜成纤维细胞迁移。
为进一步探究circPTPRA在RA发展过程中的作用机制,本研究证实RA滑膜成纤维细胞中circPTPRA可靶向结合miR-140-5p。miR-140-5p可促进炎症反应的发生[15]。研究[16-17]显示,miR-140-5p通过靶向FUT1抑制骨关节炎软骨细胞凋亡;miR-140-5p过表达通过下调Toll样受体4而抑制脂多糖诱导的人椎间盘炎症反应。本研究结果显示,RA滑膜成纤维细胞中miR-140-5p的表达量降低,miR-140-5p过表达可明显降低RA滑膜成纤维细胞活力及迁移能力,而抑制miR-140-5p表达可逆转干扰circPTPRA表达对RA滑膜成纤维细胞增殖及迁移的抑制作用。
综上所述,RA滑膜成纤维细胞中circPTPRA的表达量升高,而miR-140-5p的表达量降低,干扰circPTPRA表达可通过上调miR-140-5p的表达而抑制RA滑膜成纤维细胞增殖及迁移,circPTPRA可能作为RA诊断与治疗的潜在靶点。本研究不足之处在于circPTPRA是否可通过靶向调控其他miRNA表达而参与RA发生及发展过程中尚未可知。未来将进一步研究证实circPTPRA/miR-140-5p分子轴在RA发生及发展过程中的作用机制。
circPTPRA靶向miR-140-5p调控类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖及迁移的机制研究
Mechanism of circPTPRA on regulating the proliferation and migration of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes by targeting miR-140-5p
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摘要:
目的探讨circPTPRA对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移的影响及其对miR-140-5p的调控作用。 方法原代分离培养人正常滑膜成纤维细胞与类风湿关节炎滑膜成纤维细胞, 将类风湿关节炎滑膜成纤维细胞分为NC组(不转染)、si-NC组(转染si-NC)、si-circPTPRA组(转染si-circPTPRA)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-140-5p组(转染miR-140-5p mimics)、anti-miR-NC+si-circPTPRA组(共转染anti-miR-NC和si-circPTPRA)、anti-miR-140-5p+si-circPTPRA组(共转染anti-miR-140-5p和si-circPTPRA)。qRT-PCR检测circPTPRA与miR-140-5p的表达量; MTT实验检测细胞增殖; Transwell小室实验检测细胞迁移; 双荧光素酶报告基因实验检测circPTPRA与miR-140-5p的靶向关系。 结果与正常滑膜成纤维细胞比较, 类风湿关节炎滑膜成纤维细胞中circPTPRA的表达量升高, miR-140-5p的表达量降低(P < 0.01);与si-NC组比较, si-circPTPRA组细胞活力降低, 迁移细胞数减少(P < 0.05);与miR-NC组比较, miR-140-5p组细胞活力降低, 迁移细胞数减少(P < 0.01);circPTPRA可靶向调控miR-140-5p;与anti-miR-NC+si-circPTPRA组比较, anti-miR-140-5p+si-circPTPRA组细胞活力升高, 迁移细胞数增多(P < 0.01)。 结论干扰circPTPRA表达可通过靶向调控miR-140-5p的表达而抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖及迁移。 Abstract:ObjectiveTo explore the effect of circPTPRA on the proliferation and migration of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes and its regulatory effect on miR-140-5p. MethodsThe primary human normal fibroblast-like synoviocyte and rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocyte were isolated and cultured.The synovial fibroblasts of rheumatoid arthritis were divided into NC group(without transfection), si-NC group(transfected si-NC), si-circPTPRA group (transfected si-circPTPRA), miR-NC group (transfected miR-NC) and miR-140-5p group (transfected miR-140-5p mimics), anti-miR-NC+si-circPTPRA group (co-transfected anti-miR-NC and si-circPTPRA), anti-miR-140-5p+si-circPTPRA group (co-transfected anti-miR-140-5p and si-circPTPRA).The expression levels of circPTPRA and miR-140-5p were detected by qRT-PCR.The cell proliferation was detected by MTT test, and the cell migration was tested by Transwell chamber.The targeting relationship between circPTPRA and miR-140-5p was detected through the dual luciferase reporter gene experiment. ResultsCompared with normal fibroblast-like synoviocytes, in rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes, the expression of circPTPRA was increased, while the expression of miR-140-5p was decreased (P < 0.01).Compared with the si-NC group, in the si-circPTPRA group, the cell viability was decreased, the number of migrating cells was decreased (P < 0.05).Compared with the miR-NC group, in the miR-140-5p group, the cell viability and the number of migrating cells were decreased (P < 0.01).CircPTPRA could target miR-140-5p.Compared with the anti-miR-NC+si-circPTPRA group, the cell viability was increased as well as the number of migrating cells in the anti-miR-140-5p+si-circPTPRA group (P < 0.01). ConclusionsInterference with the expression of circPTPRA can inhibit the proliferation and migration of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocyte by targeting the expression of miR-140-5p. -
Key words:
- rheumatoid arthritis /
- fibroblast-like synoviocytes /
- circPTPRA /
- miR-140-5p /
- cell proliferation /
- migration
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表 1 RA滑膜成纤维细胞RA-FLSs中circPTPRA及miR-140-5p表达情况(x±s;ni=9)
分组 n circPTPRA miR-140-5p Control组 9 1.00±0.07 1.00±0.10 RA-FLSs组 9 2.84±0.16 0.41±0.03 t — 31.61 16.95 P — < 0.01 < 0.01 表 2 低表达circPTPRA对RA滑膜成纤维细胞RA-FLSs增殖和转移的影响(x±s;ni=9)
分组 circPTPRA CyclinD1 MMP2 MMP9 吸光度值 细胞迁移数量 NC组 1.00±0.10 0.82±0.06 0.89±0.06 0.71±0.06 0.946±0.07 167.03±10.03 si-NC组 0.98±0.07 0.81±0.08 0.90±0.07 0.70±0.07 0.937±0.07 161.01±8.77 si-circPTPRA组 0.42±0.03* 0.39±0.02* 0.43±0.03* 0.33±0.03* 0.517±0.05* 84.02±5.11* F 185.24 156.38 207.10 134.71 131.90 284.07 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.005 0.002 0.002 0.001 0.002 67.875 q检验: 与si-NC组比较*P < 0.05 表 3 miR-140-5p对RA滑膜成纤维细胞RA-FLSs增殖和转移的影响(x±s;ni=9)
分组 miR-140-5p CyclinD1 MMP2 MMP9 吸光度值 细胞迁移数量 miR-NC组 1.00±0.10 0.82±0.08 0.92±0.08 0.72±0.07 0.942±0.08 164.07±7.53 miR-140-5p组 1.96±0.11 0.43±0.03 0.48±0.03 0.34±0.03 0.549±0.05 76.06±4.06 t 19.37 13.69 15.45 14.97 12.50 30.86 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 表 4 双荧光素酶活性检测(x±s;ni=9)
分组 荧光素酶活性 WT-circPTPRA MUT-circPTPRA miR-NC组 1.00±0.07 1.00±0.09 miR-140-5p组 0.46±0.03 0.98±0.09 t 21.27 0.47 P < 0.01 >0.05 表 5 qRT-PCR检测miR-140-5p的表达(x±s;ni=9)
分组 circPTPRA miR-140-5p pcDNA-NC组 1.00±0.08 1.00±0.10 pcDNA-circPTPRA组 2.69±0.15* 0.39±0.04* si-NC 1.02±0.09 1.04±0.09 si-circPTPRA组 0.48±0.03*# 2.37±0.18*# F 877.96 481.52 P < 0.01 < 0.01 MS组内 0.005 0.007 q检验: 与pcDNA-NC组比较*P < 0.05;与si-NC组比较#P < 0.05 表 6 anti-miR-140-5p逆转si-circPTPRA对RA-FLSs增殖和转移的影响(x±s;ni=9)
分组 miR-140-5p CyclinD1 MMP2 MMP9 吸光度值 细胞迁移数量 anti-miR-NC+si-circPTPRA组 1.00±0.07 0.38±0.02 0.45±0.04 0.32±0.02 0.523±0.04 88±4.89 anti-miR-140-5p+si-circPTPRA组 0.45±0.03 0.86±0.07 0.81±0.06 0.77±0.06 0.973±0.07 179±13.22 t 21.67 19.78 14.98 21.35 16.75 19.37 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 -
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