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克罗恩病(Crohn′s disease，CD)归属于炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)，以复发性肠道炎症为主要临床表现[1-2]。CD具有发病机制不明、无法治愈以及致残性等特点[3]。近年来，CD在我国的发病率呈现逐年升高趋势，但其诊疗水平却相对滞后[4]。当前可用于CD治疗的临床药物如免疫抑制剂、糖皮质激素及生物制剂等均有不同程度的不良反应，且长期使用均存在安全性和有效性等问题[5-6]，因此，面对日益增长的CD治疗需求，更为安全、有效的新药物亟待开发。近年来，天然植物提取物因其疗效稳定、不易产生药物抵抗和药物依赖等优点引起了学术界的广泛关注[7]。连翘脂素(Phillygenin，PHI)是一种从木犀科植物连翘中提取的天然小分子化合物。既往研究显示，PHI可通过抑制核因子-κB(NF-κB)信号拮抗脂多糖诱导的巨噬细胞炎症反应[8]，同时还能够激活过氧化物酶体增殖物激活受体-γ信号进而抑制肺上皮细胞的凋亡[9]。PHI拮抗炎症、保护细胞等多种药理学作用提示其可能具有改善CD肠炎的潜在价值。基于此，本研究首先观察PHI干预对2, 4, 6-三硝基苯磺酸(2, 4, 6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)诱导的CD模型小鼠结肠炎的作用效果，并进一步采用网络药理学和在体实验共同分析其可能的分子机制，以期为CD临床治疗发掘新的有效药物。
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选取18只6~8周龄，体质量(20±3)g的野生型(Wild type，WT；C57BL/6J背景)小鼠，购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。小鼠于无特定病原菌(specific pathogen free，SPF)环境下饲养，自由进食和饮水。本研究通过蚌埠医学院动物研究伦理委员会的批准。
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将WT小鼠随机分成3组：对照组(WT组)、模型组(TNBS组)和PHI干预组(PHI组)，每组6只。TNBS组和PHI组均接受TNBS造模处理，造模过程：采用1%戊巴比妥钠麻醉小鼠(腹腔注射)，待麻醉成功后，于小鼠肛门处涂抹石蜡油，将聚乙烯软管与1 mL注射器连接后经肛门推注2.5%的TNBS乙醇溶液(5%TNBS与无水乙醇溶液1∶1混合)100 μL，并保持头低足高位5 min[10]。PHI组小鼠在造模成功后给予PHI干预(20 mg·kg-1·d-1，灌胃)，给药时间持续7 d，WT组和TNBS组小鼠每日灌胃等量的0.9%氯化钠溶液。造模后第8天处死小鼠，并采集结肠组织标本进行后续检测。
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采用疾病活动度指数(disease activity index，DAI)评估各组小鼠肠炎症状，评分范围为0~5分，分值越高代表症状越重[11]。造模前后称量各组小鼠体质量并计算变化量。取检时测量各组小鼠结肠长度。
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收集小鼠结肠组织制备石蜡切片，行HE染色，并依据Spencer推荐的肠炎组织学评分量表评估各组小鼠结肠组织炎症程度。分值范围为0~4分，分数越高代表炎症越重。
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刮取各组小鼠结肠黏膜组织，称重后加入0.9%氯化钠溶液制备组织匀浆，再经离心获得上清液。采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测结肠黏膜组织中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)水平，实验操作依据试剂盒说明书进行。
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从Swiss Target Prediction(
http://www.swisstargetprediction.ch/ )和SuperPred(http://prediction.charite.de/index.php )数据库获取PHI潜在的作用靶点。从GeneCards(https://www.genecards.org )、DrugBank(https://go.drugbank.com )、TTD(db.idrblab.net)、PharmGKB(http-s://www.pharmgkb.org )和DisGeNet(https://www.disgenet.org/ )数据库获取CD相关疾病靶点。利用VENNY(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ )软件绘制韦恩图，去除重复值后，取疾病靶点和药物作用靶点的交集，即为PHI作用于CD的潜在靶点。 -
采用DAVID(
https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp )数据库对上述获得的潜在靶点进行基因本体(Gene-Ontology，GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，以预测PHI治疗小鼠CD样结肠炎的可能机制。 -
采用免疫印迹实验对各组小鼠结肠黏膜组织中IL-17、白细胞介素-17受体A(interleukin-17 receptor A，IL-17RA)以及NF-κB激活剂1(nuclear factor kappa B activator 1，Act1)表达水平进行检测。使用RIPA裂解液裂解小鼠结肠黏膜组织，提取总蛋白后经BCA法测定蛋白浓度。用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，依次经转膜、封闭、孵育一抗(IL-17、IL-17RA、Act1或β-actin)、TBST洗膜、孵育二抗、ECL显色后使用凝胶成像系统进行曝光显影。最后利用ImageJ软件对蛋白条带灰度值进行分析，并计算相对表达量。
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采用t检验、方差分析以及q检验。
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通过对各组小鼠肠炎临床症状进行评估发现：PHI组小鼠DAI评分低于TNBS组；PHI组小鼠体质量下降幅度、结肠缩短程度均低于TNBS组，高于WT组，差异均有统计学意义(P < 0.01)(见表 1)。
分组 n DAI评分/分 体质量变化/g 结肠长度/cm WT组 6 — 2.06±0.46 11.02±0.30 TNBS组 6 4.17±0.75 -1.16±0.53** 7.42±0.48** PHI组 6 1.83±0.75# 0.99±0.34**## 9.40±0.95**## F — 5.37△ 79.86 48.15 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — — 0.203 0.408 △示t值；q检验：与WT组比较**P < 0.01；与TNBS组比较#P < 0.05, ##P < 0.01 表 1 各组小鼠肠炎症状比较(x±s)
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基于HE染色对各组小鼠结肠组织进行病理学评分发现：PHI组小鼠结肠炎症评分(1.67±0.52)分低于TNBS组(3.67±0.52)分(t=6.71，P < 0.01)(见图 1)。
图 1 各组小鼠结肠组织HE染色代表性图片
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ELISA检测结果显示：PHI组小鼠结肠黏膜炎症介质水平(TNF-α、IL-6和IFN-γ)低于TNBS组，但仍高于WT组，差异均有统计学意义(P < 0.01)(见表 2)。
分组 n TNF-α IL-6 IFN-γ WT组 6 9.93±1.79 13.34±4.08 10.42±2.38 TNBS组 6 43.63±7.91** 51.39±8.92** 48.37±11.17** PHI组 6 23.18±6.08**## 31.24±7.28**## 25.93±4.96**## F — 50.54 43.73 42.28 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 34.211 49.705 51.665 q检验：与WT组比较**P < 0.01；与TNBS组比较##P < 0.01 表 2 各组小鼠结肠黏膜组织炎症介质表达水平(x±s; pg/mg)
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从Swiss Target Prediction和SuperPred数据库获取PHI潜在的作用靶点，从GeneCards、DrugBank、TTD、PharmGKB和DisGeNet数据库中获取CD相关疾病靶点(见图 2A)；去除重复值后，取疾病靶点和药物作用靶点交集，得到交集靶点63个(见图 2B)。
图 2 网络药理学预测PHI治疗CD的潜在作用靶点
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对上述63个交集靶点进行GO和KEGG富集分析，共得到1 072条目，包括生物过程(BP)119个、细胞组分(CC)38个，分子功能(MF)32个，其中生物过程主要涉及对炎症反应的调控作用等(见图 3A)。KEGG通路富集分析共得到34条通路，包括癌症通路、IL-17信号通路和趋化因子信号通路等。根据P值大小选取排名前20条通路进行可视化处理(见图 3B)。其中IL-17信号通路与CD的发生发展密切相关，故我们选择IL-17信号通路进行后续的分子机制验证。
图 3 PHI和CD交集靶点的GO和KEGG通路富集分析
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采用免疫印迹实验对网络药理学预测结果进行在体验证，结果显示：PHI组小鼠结肠黏膜IL-17信号蛋白水平(TNF-α、IL-6和IFN-γ)低于TNBS组，但仍高于WT组，差异均有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01)(见图 4、表 3)。
图 4 各组小鼠结肠黏膜组织中IL-17信号相关蛋白的表达水平
分组 n IL-17 IL-17RA Act1 WT组 6 1.00±0.25 1.00±0.20 1.00±0.16 TNBS组 6 4.96±0.92** 4.94±0.85** 3.25±0.65** PHI组 6 1.94±0.29**# 2.94±0.73**# 1.92±0.37**# F — 77.06 54.32 39.18 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.333 0.430 0.195 q检验：与WT组比较**P < 0.01；与TNBS组比较#P < 0.05 表 3 各组小鼠检测信号蛋白水平比较(x±s)
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本研究以TNBS诱导的结肠炎小鼠为研究对象，首先通过在体实验证实PHI干预能够改善TNBS模型小鼠肠炎临床症状、结肠组织学损伤并抑制肠黏膜炎症介质水平；进一步通过网络药理学预测和在体实验验证发现PHI改善TNBS模型小鼠CD样结肠炎可能与抑制IL-17信号有关。
TNBS诱导的结肠炎小鼠是目前国内外较为公认且运用广泛的CD动物模型，具有造模周期短、诱导成功率高及肠炎稳定等特点[12]。本研究首先通过在体动物实验发现，PHI干预可显著缓解TNBS小鼠DAI评分、体质量下降幅度以及结肠缩短等症状。以上结果初步证实PHI具有改善CD模型小鼠肠道炎症的潜力。肠黏膜组织炎症细胞浸润是CD肠道重要的病理学改变[13]。本研究通过HE染色发现，PHI干预后显著抑制了TNBS模型小鼠结肠黏膜组织中炎症细胞的聚集和浸润。同时，对小鼠结肠组织炎症损伤程度进行量化发现，PHI组小鼠结肠组织病理学评分较TNBS组显著降低。以上结果进一步证实PHI对CD模型小鼠结肠组织损伤具有改善作用。此外，通过ELISA检测我们发现，PHI可显著抑制TNBS小鼠结肠黏膜组织中TNF-α、IL-6及IFN-γ的水平。CD肠道炎症反应主要由辅助性T淋巴细胞1和经典激活型巨噬细胞(M1型)介导，其可通过分泌TNF-α、IL-6及IFN-γ等促炎因子以直接损伤或诱发炎症级联反应等形式损伤肠道[14], 因此，我们的实验结果分别从肠炎临床症状、组织病理学和分子层面共同证实PHI具有保护CD模型小鼠肠道炎症的作用。
接下来，我们尝试进一步探究PHI改善CD样肠炎的可能分子机制。本研究首先通过网络公共数据库获取PHI治疗CD的交集靶点，并对其进行GO和KEGG富集分析。GO-BP富集结果显示PHI主要参与炎症反应的调控过程。既往报道显示，PHI不仅可以保护小鼠足跖组织免受角叉菜胶的炎性损伤[15]，还能通过调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路抑制脂多糖诱导的人肝星形细胞炎症反应[16]。我们的研究发现PHI能够显著改善TNBS小鼠CD样结肠炎，这不仅验证了网络药理学的预测结果，还进一步拓宽了PHI发挥抗炎作用的疾病应用领域。同时，KEGG富集分析结果显示，PHI改善CD样结肠炎作用可能与IL-17信号通路有关。诸多研究表明，CD病人肠黏膜组织中IL-17水平升高[17]。IL-17是一种主要由Th17细胞分泌的促炎型细胞因子，其可与IL-17受体(IL-17RA)结合传递信号，导致细胞内NF-κB激活剂1(Act1)的募集[18]。Act1是IL-17及其受体家族信号传导的关键蛋白，其可通过激活下游不同的信号通路从而诱导促炎介质(TNF-α、IL-6和IFN-γ)的表达[19]。最后，本研究采用免疫印迹实验对各组小鼠结肠黏膜组织中IL-17信号通路关键蛋白进行检测并发现，PHI能够显著抑制TNBS小鼠结肠黏膜组织中IL-17、IL-17RA以及Act1的表达水平，因此，IL-17信号可能在一定程度上解释PHI改善TNBS小鼠CD样结肠炎的作用机制。
本研究具有一定的临床应用价值。CD是一种复发和缓解交替进行的慢性炎症性疾病，手术切除病变肠管仅是权宜之计，采用药物诱导或维持肠炎缓解是治疗CD的主要手段[20]。然而，缺少更为安全、有效的治疗药物是当前CD临床治疗的主要短板[21]。我们的研究发现PHI可显著改善TNBS模型小鼠CD样结肠炎，提示其具有潜在的药物开发价值，并有望为CD临床治疗药物选择提供参考。
连翘脂素通过抑制IL-17信号改善2, 4, 6-三硝基苯磺酸诱导的小鼠克罗恩病样结肠炎
Phillygenin alleviated 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid-induced Crohn's disease-like colitis by inhibiting IL-17 signaling
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摘要:
目的探究连翘脂素(PHI)对2, 4, 6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的克罗恩病(CD)样结肠炎的治疗效果及潜在的分子机制。 方法选取18只6~8周龄的野生型小鼠(C57BL/6J), 并将其随机分为对照组(WT组)、模型组(TNBS组)和PHI干预组(PHI组), 每组6只。其中TNBS组和PHI组小鼠均采用TNBS诱导CD样结肠炎模型, PHI组小鼠于造模成功后给予PHI干预(20 mg·kg-1·d-1, 灌胃), 而WT组和TNBS组小鼠给予等量的0.9%氯化钠溶液。干预7 d后, 采用疾病活动度指数(DAI)、体质量变化及结肠长度评估小鼠肠炎症状; 采用HE染色和炎症评分观察小鼠结肠组织炎症程度; 采用酶联免疫吸附实验检测小鼠结肠黏膜组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和干扰素-γ(IFN-γ)水平。使用网络药理学预测PHI作用于CD的可能机制, 并进一步采用免疫印迹法进行验证。 结果PHI组小鼠DAI评分、结肠缩短程度均低于TNBS组(P < 0.01), 高于WT组(P < 0.01);PHI小鼠体质量高于TMBS组(P < 0.01), 低于WT组(P < 0.01);PHI组小鼠结肠组织学评分及肠黏膜炎症介质(TNF-α、IL-6和IFN-γ)水平均低于TNBS组(P < 0.01), 高于WT组(P < 0.01)。网络药理学分析获得PHI作用于CD的潜在靶点共63个; 生物信息学富集分析显示, PHI主要参与炎症反应的调控过程, 且可能与白细胞介素-17(IL-17)信号通路有关。免疫印迹结果显示PHI组小鼠结肠黏膜组织中IL-17、白细胞介素-17受体A及核因子-κB激活剂1表达水平较TNBS组降低, 但仍高于WT组(P < 0.05~P < 0.01)。 结论PHI可改善TNBS诱导的小鼠CD样结肠炎, 这可能与其抑制IL-17信号通路有关。 Abstract:ObjectiveTo explore the effect and potential molecular mechanism of phillygenin (PHI) on Crohn's disease (CD) -like colitis induced by 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS). MethodsEighteen wild-type mice (C57BL/6J) aged 6-8 weeks were randomly divided into control group (WT group), model group (TNBS group) and PHI administration group (PHI group), with 6 mice in each group.Mice in the TNBS group and PHI group were treated with TNBS-induced CD colitis model while mice in the PHI group were given PHI administration (20 mg·kg-1·d-1, gavage) after modeling, while mice in the WT group and the TNBS group were given the same amount of 0.9% sodium chloride solution.After 7 days, the disease activity index (DAI), bodyweight changes and colon length were used to evaluate the symptoms of colitis.HE staining and histological inflammation scores were used to observe the injury degree of colon tissue.The levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6) and interferon-γ (IFN-γ) in colonic mucosal tissues of mice were determined by enzyme-linked immunosorbent assay.Network pharmacology was used to predict the possible mechanism of PHI action on CD and further verified by Western blotting. ResultsThe DAI scores and colon shortening in the PHI group were significantly lower than those in the TNBS group (P < 0.01), but still higher than those in the WT group (P < 0.01).The body mass of mice in the PHI group was higher than that in the TNBS group and lower than that in the WT group(P < 0.01).The scores of colon histology and the levels of inflammatory mediators (TNF-α, IL-6 and IFN-γ) in colonic mucosa in the PHI group were significantly lower than those in the TNBS group (P < 0.01), but still higher than those in the WT group (P < 0.01).Network pharmacology analysis identified a total of 63 potential targets of PHI on CD.Bioinformatics enrichment analysis showed that PHI was mainly involved in the regulation of inflammatory response, and might be related to interleukin-17(IL-17) signaling pathway.Finally, Western blotting showed that the expression levels of IL-17, interleukin-17RA and nuclear factor κB activator 1 in colonic mucosal tissue of mice in the PHI group were significantly lower than those in the TNBS group, but still higher than those in the WT group(P < 0.05 to P < 0.01). ConclusionsPHI can improve TNBS-induced CD-like colitis in mice, which may be related to the inhibition effect of IL-17 signaling pathway. -
Key words:
- Crohn's disease /
- phillygenin /
- colitis /
- interleukin -17 signaling
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表 1 各组小鼠肠炎症状比较(x±s)
分组 n DAI评分/分 体质量变化/g 结肠长度/cm WT组 6 — 2.06±0.46 11.02±0.30 TNBS组 6 4.17±0.75 -1.16±0.53** 7.42±0.48** PHI组 6 1.83±0.75# 0.99±0.34**## 9.40±0.95**## F — 5.37△ 79.86 48.15 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — — 0.203 0.408 △示t值；q检验：与WT组比较**P < 0.01；与TNBS组比较#P < 0.05, ##P < 0.01 
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表 2 各组小鼠结肠黏膜组织炎症介质表达水平(x±s; pg/mg)
分组 n TNF-α IL-6 IFN-γ WT组 6 9.93±1.79 13.34±4.08 10.42±2.38 TNBS组 6 43.63±7.91** 51.39±8.92** 48.37±11.17** PHI组 6 23.18±6.08**## 31.24±7.28**## 25.93±4.96**## F — 50.54 43.73 42.28 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 34.211 49.705 51.665 q检验：与WT组比较**P < 0.01；与TNBS组比较##P < 0.01
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表 3 各组小鼠检测信号蛋白水平比较(x±s)
分组 n IL-17 IL-17RA Act1 WT组 6 1.00±0.25 1.00±0.20 1.00±0.16 TNBS组 6 4.96±0.92** 4.94±0.85** 3.25±0.65** PHI组 6 1.94±0.29**# 2.94±0.73**# 1.92±0.37**# F — 77.06 54.32 39.18 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.333 0.430 0.195 q检验：与WT组比较**P < 0.01；与TNBS组比较#P < 0.05
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图(4)表(3)
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