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抑郁症是一种情绪障碍类疾病，以持续显著的情绪低落、兴致减退、精力消减为主要症状的一类精神疾病[1]。目前研究认为，神经元存活降低是引起抑郁症病人生存及生活能力下降的主要原因，自噬在神经元存活及突触可塑性过程中发挥重要作用，但抑郁症过程中，自噬激活还是抑制也一直存在争议[2-3]。绞股蓝总皂苷(Gypenosides，Gyp)为绞股蓝中的活性成分，现代药理发现Gyp具有镇静催眠和保护缺血性脑损伤的作用[4-5]，近来研究发现Gyp能通过激活脑源性神经营养因子信号传导来发挥抗抑郁作用[6]，但Gyp其他抗抑郁机制还不甚清楚，这不利于其开发应用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)不仅能与自噬激活激酶1(autophagy activated kinase 1，ULK1)结合形成复合物来抑制自噬，还能磷酸化自噬相关蛋白13(ATG13)使ATG13失去结合能力来抑制自噬的诱导过程，且mTOR通路也是自噬调节的主要信号途径之一[7]。Gyp能否通过调控mTOR/ULK1/ATG13途径来调控自噬，发挥抗抑郁作用，还未见报道。故本研究建立大鼠抑郁模型，对此进行探讨，以期阐明抑郁症神经元自噬凋亡的可能机制，并为Gyp的开发应用提供实验依据。
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健康清洁级SD大鼠，体质量200~220 g，6~8周龄，雌雄不限，购自福州海王福药制药有限公司，生产许可证号: SCXK(闽)2020-0001，所有大鼠于海南省安宁医院动物房中常规饲养。本实验经海南省安宁医院动物伦理委员会批准同意，符合3R原则。
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Gyp(货号: 00050023，苏州宝堂医药科技有限公司)；雷帕霉素(Rapamycin，Rap)(货号: R8140-25，北京索莱宝科技有限公司)；TUNEL染色试剂盒(货号: C1086，上海碧云天生物技术有限公司)；磷酸化mTOR(p-mTOR)、磷酸化ULK1(p-ULK1)、mTOR、自噬相关蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3(LC3)、半胱天冬酶-3(Caspase-3)、多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(PARP)等抗体(货号: ab226957，ab203207，ab32028，ab210498，ab229327，ab184787，ab191217，美国abcam公司)；核糖体S6蛋白(S6)、磷酸化S6(p-S6)(货号: #2217、#81736，美国Cell Signaling Technology公司)；ULK1特定位点Ser757蛋白(ULK1 Ser757)(货号: orb614589，武汉博欧特生物科技有限公司)；磷酸化ULK1 Ser757(p-ULKl Ser757)(货号: BJ-KT67647，上海邦景实业有限公司)；p-ATG13(货号: 13007，美国Signalway Antibody公司)；电子显微镜(型号: JCM-6000，日本电子光学公司)；化学发光成像仪(型号: LAS500，美国Cytiva公司)等。
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取SD大鼠，参照文献[7]方法制备慢性轻度不可预见性应激法，即每天将大鼠采用夹尾、强迫游泳等不同方法连续刺激28 d建立大鼠抑郁症模型，若大鼠出现目光呆滞、行动迟缓、活动减少现象，随机取2只大鼠透射电镜观察海马神经形态，若大鼠海马神经元出现肿胀、核仁消失等现象，视为造模成功，共造模成功50只大鼠，随机分为模型组、Gyp低(25 mg/kg) 剂量组、高(100 mg/kg)剂量组、自噬激活剂-雷帕霉素(Rap)组(1mg/kg)、Gyp+Rap组(100 mg/kg+1 mg/kg)，每组10只，另取10只大鼠，不做任何处理，正常喂养，视为正常对照组。
Gyp参照文献[8]设置剂量并灌胃给药1次/天；Rap参照文献[9]设置剂量，并经腹腔注射给药2次/周；Gyp+Rap组灌胃给予Gyp溶液的同时，腹腔注射给予Rap溶液；模型组及正常对照组灌胃给予10 mL/kg 0.9%氯化钠溶液。
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各组大鼠给药结束后，参照文献[10]将大鼠放置于47 cm×47 cm的旷场观察箱中，观察大鼠10 min内在旷场中央区的探索活动时间；将大鼠放入置有1%糖水及等体积清水的实验箱中，适应完成后，禁食禁水24 h后记录大鼠2 h内糖水及清水摄入量，糖水摄取百分比=[糖水消耗量/(糖水消耗量+清水消耗量)]×100%；将大鼠单独置于高45 cm、直径20 cm、水高30 cm、水温(23±3)℃的圆桶中游泳6 min，记录大鼠在水中的活动情况，并记录大鼠不动时间。
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将大鼠麻醉处死，开颅取脑，冰上分离海马组织，剪取1 mm3海马组织，用4%戊二醛固定，送于电镜室处理后，电镜下观察海马神经元结构及自噬小体、溶酶体形成状况。剩余海马组织分成两部分，一部分置于4%多聚甲醛中固定24 h后，常规透明、浸蜡、包埋后切成5 μm的切片，备用；另一部分置于-80 ℃冰箱保存备用。
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取1.2.3中海马组织石蜡切片，脱蜡、透明、水化后，按TUNEL染色试剂盒说明书方法染色后，置于显微镜下观察染成红棕色的凋亡神经元细胞数目，用Image J图像分析软件统计检测细胞凋亡率。
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取剩余海马石蜡切片，脱蜡、水化、抗原修复后，加入一抗抗体(p-ULK1、p-ATG13，1∶ 500)4 ℃孵育过夜，加入羊抗兔二抗(1∶ 800)室温孵育2 h，DAB显色及苏木精复染后封片，光镜下观察拍照，用Image Pro Plus 5.0图像分析系统分析单位面积内棕褐色区域吸光度值。
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Ser757、Beclin1、LC3、Caspase-3、PARP蛋白相对表达水平取海马冰冻组织，4 ℃解冻后，冰上匀浆分离提取蛋白，BCA法测蛋白总浓度。取50 μg蛋白上样，进行电泳、转膜反应，加入一抗(mTOR、p-mTOR、S6、P-S6、ULK1 Ser757、p-ULKl Ser757、Beclin1、LC3、Caspase-3、PARP(1:800)，内参β-actin，1∶ 2 000)，4 ℃孵育过夜，加入羊抗兔二抗HRP(1∶ 2 000)室温孵育4 h，增强化学发光法显色，化学发光成像仪观察条带并拍照，以Image-J软件分析各组蛋白相对表达。
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采用单因素方差分析和q检验。
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与正常对照组相比，模型组大鼠的中央探索时间与糖水摄取百分比降低(P < 0.01)，强迫游泳不动时间延长(P < 0.01)。与模型组相比，Gyp低、高剂量组大鼠的中央探索时间与糖水摄取百分比增加(P < 0.01)，强迫游泳不动时间减少(P < 0.01)；Rap组大鼠的中央探索时间与糖水摄取百分比进一步减少(P < 0.01)，强迫游泳不动时间进一步延长(P < 0.01)。Gyp+Rap组大鼠上述指标变化与Rap组相反(P < 0.01)(见表 1)。
分组 n 中央探索时间/s 糖水摄取百分比/% 强迫游泳不动时间/s 正常对照组 10 91.01±4.10 72.32±3.12 77.69±3.02 模型组 10 43.59±2.16** 45.59±2.26** 125.62±5.16** Gyp低剂量组 10 60.52±3.64**△△ 53.52±2.59**△△ 99.31±4.33**△△ Gyp高剂量组 10 77.09±3.54**△△## 64.35±2.88**△△## 86.52±4.06**△△## Rap组 10 33.98±1.03**△△##◇◇ 36.98±1.66**△△##◇◇ 147.98±5.66**△△##◇◇ Gyp+Rap组 10 42.83±2.11**##◇◇☆☆ 45.63±2.49**##◇◇☆☆ 126.68±5.25**##◇◇☆☆ F — 562.82 268.51 337.44 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 8.795 6.467 21.763 q检验: 与正常对照组比较**P < 0.01；与模型组比较△△P < 0.01；与Gyp低剂量组比较##P < 0.01；与Gyp高剂量组比较◇◇P < 0.01；与Rap组比较☆☆P < 0.01 表 1 各组大鼠中央探索时间、糖水摄取百分比、强迫游泳不动时间比较(x±s)
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正常对照组大鼠海马神经元细胞结构正常。模型组及Gyp+Rap组大鼠海马神经元细胞可见细胞膜破损，细胞核变形、固缩，粗面内质网及线粒体肿胀，甚至空泡化，细胞质中大小不等的自噬空泡形成较多，可见明显的自噬小体。Gyp低、高剂量组大鼠神经细胞核较为规整，细胞核固缩减轻，且坏死减少，细胞质中大小不等的自噬空泡形成减少，自噬小体明显减少。Rap组大鼠神经细胞胞核固缩，细胞膜损伤、细胞器减少进一步加重，细胞质中自噬空泡及自噬小体形成进一步增多(见图 1)。
图 1 各组大鼠海马神经元细胞超微结构及自噬小体观察图(白色箭头所示为自噬小体及自噬空泡形成)
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TUNEL染色显示凋亡神经元细胞呈红棕色。与正常对照组相比，模型组大鼠神经元细胞凋亡率升高(P < 0.01)。与模型组相比，Gyp低、高剂量组大鼠神经元细胞凋亡率降低(P < 0.01)；Rap组大鼠神经元细胞凋亡率进一步升高(P < 0.01)。Gyp+LPA组大鼠上述指标变化与Gyp组相反(P < 0.01)(见表 2)。
分组 n 凋亡率/% 正常对照组 10 9.19±0.65 模型组 10 27.06±2.32** Gyp低剂量组 10 22.96±2.15**△△ Gyp高剂量组 10 16.96±1.15**△△## Rap组 10 39.65±3.28**△△##◇◇ Gyp+Rap组 10 27.22±2.06**##◇◇☆☆ F — 239.75 P — < 0.01 MS组内 — 4.459 q检验: 与正常对照组比较**P < 0.01；与模型组比较△△P < 0.01；与Gyp低剂量组比较##P < 0.01；与Gyp高剂量组比较◇◇P < 0.01；与Rap组比较☆☆P < 0.01 表 2 各组大鼠海马神经元细胞凋亡率比较(x±s)
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免疫组织化学显示，p-ULK1、p-ATG13在正常对照组海马神经元细胞中呈强阳性表达。与正常对照组相比，模型组大鼠海马神经元p-ULK1、p-ATG13阳性表达较弱(P < 0.01)。与模型组相比，Gyp低、高剂量组大鼠海马神经元p-ULK1、p-ATG13阳性表达增强(P < 0.01)；Rap组大鼠海马神经元p-ULK1、p-ATG13阳性表达进一步减弱(P < 0.01)。Gyp+Rap组大鼠上述指标变化与Gyp组相反(P < 0.01)(见表 3)。
分组 n p-ULK1 p-ATG13 正常对照组 10 1.19±0.05 1.16±0.09 模型组 10 0.49±0.03** 0.43±0.03** Gyp低剂量组 10 0.62±0.08**△△ 0.68±0.06**△△ Gyp高剂量组 10 0.85±0.07**△△## 0.83±0.06**△△## Rap组 10 0.15±0.01**△△##◇◇ 0.12±0.01**△△##◇◇ Gyp+Rap组 10 0.46±0.04**##◇◇☆☆ 0.40±0.04**##◇◇☆☆ F — 468.98 450.59 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.003 0.003 q检验: 与正常对照组比较**P < 0.01；与模型组比较△△P < 0.01；与Gyp低剂量组比较##P < 0.01；与Gyp高剂量组比较◇◇P < 0.01；与Rap组比较☆☆P < 0.01 表 3 各组大鼠海马组织p-ULK1、p-ATG13阳性表达水平比较(x±s)
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与正常对照组相比，模型组大鼠海马组织p-mTOR/mTOR、p-S6/S6、p-ULKl Ser757/ULK1 Ser757蛋白表达降低(P < 0.01)。与模型组相比，Gyp低、高剂量组大鼠海马组织p-mTOR/mTOR、p-S6/S6、p-ULKl Ser757/ULK1 Ser757蛋白表达升高(P < 0.01)；Rap组大鼠海马组织p-mTOR/mTOR、p-S6/S6、p-ULKl Ser757/ULK1 Ser757蛋白表达进一步降低(P < 0.01)。Gyp+Rap组大鼠上述指标变化与Gyp组相反(P < 0.01)(见表 4)。
分组 n p-mTOR/mTOR p-S6/S6 p-ULKl Ser757/ULK1 Ser757 正常对照组 10 1.18±0.08 1.16±0.09 1.06±0.08 模型组 10 0.36±0.03** 0.46±0.05** 0.53±0.05** Gyp低剂量组 10 0.53±0.04**△△ 0.69±0.05**△△ 0.72±0.06**△△ Gyp高剂量组 10 0.76±0.07**△△## 0.81±0.08**△△## 0.93±0.09**△△## Rap组 10 0.15±0.02**△△##◇◇ 0.16±0.01**△△##◇◇ 0.22±0.02**△△##◇◇ Gyp+Rap组 10 0.35±0.03**##◇◇☆☆ 0.49±0.04**##◇◇☆☆ 0.50±0.05**##◇◇☆☆ F — 538.29 331.86 241.33 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.003 0.004 0.004 q检验: 与正常对照组比较**P < 0.01；与模型组比较△△P < 0.01；与Gyp低剂量组比较##P < 0.01；与Gyp高剂量组比较◇◇P < 0.01；与Rap组比较☆☆P < 0.01 表 4 大鼠海马组织p-mTOR/mTOR、p-S6/S6、p-ULKl Ser757/ULK1 Ser757蛋白表达比较(x±s)
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与正常对照组相比，模型组大鼠海马组织Beclin1、LC3、Caspase-3、PARP蛋白表达升高(P < 0.01)。与模型组相比，Gyp低、高剂量组大鼠海马组织Beclin1、LC3、Caspase-3、PARP蛋白表达降低(P < 0.01)；Rap组大鼠海马组织Beclin1、LC3、Caspase-3、PARP蛋白表达进一步升高(P < 0.01)。Gyp+Rap组大鼠上述指标变化与Gyp组相反(P < 0.01)(见图 2、表 5)。
图 2 大鼠海马组织Beclin1、LC3、Caspase-3、PARP蛋白免疫印迹图
分组 n Beclin1/β-actin LC3/β-actin Caspase-3/β-actin PARP/β-actin 正常对照组 10 1.01±0.08 1.06±0.10 1.02±0.11 1.13±0.10 模型组 10 2.35±0.23** 2.45±0.25** 2.59±0.25** 2.63±0.24** Gyp低剂量组 10 1.93±0.19**△△ 1.89±0.18**△△ 2.02±0.20**△△ 2.10±0.16**△△ Gyp高剂量组 10 1.46±0.17**△△## 1.51±0.18**△△## 1.63±0.19**△△## 1.73±0.19**△△## Rap组 10 2.75±0.22**△△##◇◇ 2.86±0.21**△△##◇◇ 2.92±0.22**△##◇◇ 2.99±0.26**△△##◇◇ Gyp+Rap组 10 2.33±0.23**##◇◇☆☆ 2.49±0.24**##◇◇☆☆ 2.52±0.25**##◇◇☆☆ 2.64±0.26**##◇◇☆☆ F — 109.88 115.82 113.80 107.90 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.038 0.040 0.044 0.044 q检验: 与正常对照组比较**P < 0.01；与模型组比较△P < 0.05，△△P < 0.01；与Gyp低剂量组比较##P < 0.01；与Gyp高剂量组比较◇◇P < 0.01；与Rap组比较☆☆P < 0.01 表 5 大鼠海马组织Beclin1、LC3、Caspase-3、PARP蛋白表达比较(x±s)
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据世界流行病学分析，全球约有19%的人罹患抑郁症，约有3亿人罹患重度抑郁，预计到2030年，抑郁症将会是引起人类劳动能力丧失的首要病因[11]。目前临床上大部分的抗抑郁药物不良反应多，且改善效果不显著[12]，故寻找安全有效的特异性抗抑郁药物，仍是临床研究的重点之一。绞股蓝中的Gyp活性成分，具有较好的抗衰老、抗脑缺血损伤作用，且来源广泛、价格低廉、毒性较小，具有一定的开发价值，另外YI等[5]发现Gyp能激活海马中糖皮质激素受体和酪氨酸受体激酶B的表达，从而激活脑源性神经营养因子信号传导通路来发挥抗抑郁作用，预示Gyp有望成为治疗抑郁症的潜在药物。本研究用慢性轻度不可预见性应激法制备大鼠抑郁模型后发现，大鼠出现旷场中央探索时间及糖水摄取量减少、强迫游泳不动时间延长等与人类兴致减退、情绪降低相似的抑郁样行为[13-14]，提示大鼠造模成功。而Gyp低、高剂量可显著改善模型大鼠上述抑郁行为，且Gyp剂量越高，其改善效果越显著，证实了Gyp可能为潜在的抗抑郁治疗药物，但其具体机制还需进一步研究。
长期抑郁可导致神经元死亡，自噬可降解和消化受损、变性的细胞器、蛋白质及核酸大分子等，为细胞的再生和修复提供原料，自噬功能失调可引起神经元功能失调及死亡，而导致多种神经系统疾病的发生[15]。越来越多的研究证实，自噬参与抑郁症的发生过程。WANG等[16-17]发现抑郁症模型大鼠海马神经元中存在明显的自噬激活，证实了自噬与抑郁症关系密切。本研究发现，模型组大鼠海马神经元细胞肿胀、核膜损伤，自噬小体及自噬溶媒体增多，自噬标记蛋白Beclin1、LC3表达升高的同时，海马神经元凋亡及凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP表达也异常高于正常对照组，提示抑郁症大鼠神经元凋亡与自噬激活有关。但自噬激活在抑郁症过程中，发挥促神经元存活的正向调控作用，还是发挥促进神经元凋亡的负向调控作用，还一直存在争议。SHU等[17-18]发现氟西丁及硫化氢等抗抑郁药物可通过促进自噬，发挥抗抑郁作用，提示自噬激活发挥正向调控作用，可促进神经元存活。SONG等[19-20]发现抑制脑内自噬，可抑制神经元自噬性死亡，缓解抑郁样行为发生，提示自噬激活发挥负向调控作用，促进自噬可促进自噬性死亡的产生。本研究发现模型组大鼠Gyp剂量越高大鼠海马神经元自噬小体减少越明显，神经元凋亡也越少，提示Gyp发挥抗抑郁作用可能是通过抑制神经元自噬性死亡来实现的。
mTOR是参与自噬调控的核心调节器，可与ULKl、ATG13之间相互作用，成为影响细胞自噬的关键分子，激活后可抑制自噬[6]。研究[21]证实，mTOR磷酸化活化水平增加，可促进ULK1(Ser637和Ser757)和ATG13(Ser258)特定位点的磷酸化活化过程激活，而抑制自噬调节复合物(ULK1-ATG13-FIP200)形成，从而抑制自噬小体形成，从而抑制细胞有丝分裂期自噬的形成，促进细胞生长。Rap可抑制mTOR磷酸化活化，抑制ULK1和ATG13的特定位点的磷酸化活化发生，而使得ULK1-ATG13-FIP200复合物形成，并转移到内质网隔离膜上，启动自噬形成[22]。本研究发现，模型组大鼠海马神组织中p-mTOR水平表达异常降低，p-ULKl、p-ATGl3水平也明显低于正常对照组，可反应mTOR活化水平的mTOR下游信号效应蛋白p-S6蛋白表达也显著降低，ULK1Ser757磷酸化位点(p-ULKl Ser757)表达也显著降低，而用Rap进一步抑制p-mTOR活性及ULK1、ATG13磷酸化水平后，神经元自噬进一步增加，大鼠神经元凋亡及自噬进一步加重，预示模型大鼠神经元自噬性死亡增加，可能与p-mTOR活性抑制，ULK1及ATG13磷酸化活性降低，自噬过度激活有关。Gyp剂量越高，大鼠p-mTOR、p-ULK1及p-ATG13、p-S6水平均越高，自噬小体及自噬溶酶体形成越小，自噬处于抑制状态，提示Gyp可提高mTOR磷酸化活性水平，促进ULK1及ATG13磷酸化活化过程而抑制自噬，防止神经元自噬性死亡发生，这可能为Gyp发挥抗抑郁作用的机制，而Rap可逆转Gyp的上述作用。
综上所述，Gyp可激活mTOR磷酸化活性水平，促进ULK1及ATG13磷酸化活化过程而抑制自噬，防止神经元自噬性死亡发生而发挥抗抑郁作用。这可能为Gyp发挥抗抑郁作用的可能机制提供一定参考。但自噬与神经元存活调控关系复杂，涉及多条通路共同调节，Gyp发挥抗抑郁作用的其他机制，还有待后续深入研究。
基于mTOR/ULK1/ATG13通路探讨绞股蓝总苷对抑郁症大鼠海马神经元过度自噬的保护作用
Protective effect of gypenosides on excessive autophagy of hippocampal neurons in depression rats based on mTOR/ULK1/ATG13 pathway
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摘要:
目的探讨绞股蓝总苷(Gyp)对抑郁症大鼠海马神经元自噬及雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/自噬激活激酶1(ULK1)/自噬相关蛋白13(ATG13)通路的影响。 方法取SD大鼠，随机分为正常对照组、模型组、Gyp低(25 mg/kg)剂量组、高(100 mg/kg)剂量组、自噬激活剂-雷帕霉素(Rap)组(1 mg/kg)、Gyp+Rap组(100 mg/kg+1 mg/kg)，每组10只。用慢性轻度不可预见性应激法制备大鼠抑郁模型，各组连续给药4周，1次/天。用旷场、糖水偏好及强迫游泳试验评估大鼠抑郁样行为，取海马组织，透射电镜观察海马神经元结构变化及自噬小体、自噬溶酶体形成情况；TUNEL法检测神经元凋亡状况；免疫组织化学染色法检测ULK1磷酸化水平(p-ULK1)及p-ATG13在海马组织中阳性表达水平；Western blotting检测总mTOR、p-mTOR、核糖体S6蛋白(S6)及p-S6、ULK1特定位点Ser757蛋白(ULK1 Ser757)及p-ULKl Ser757、自噬相关蛋白Beclin1、微管相关蛋白轻链3(LC3)蛋白、凋亡相关蛋白-半胱天冬酶-3(Caspase-3)及多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(PARP)蛋白表达水平。 结果与正常对照组相比，模型组大鼠旷场实验中央探索时间、糖水摄取百分比均降低(P < 0.01)，强迫游泳不动时间延长(P < 0.01)，海马神经元核膜破坏严重、自噬小体形成较多，凋亡率、凋亡相关蛋白及Beclin1、LC3蛋白表达均升高(P < 0.01)，mTOR/ULK1/ATG13通路蛋白磷酸化水平均降低(P < 0.01)。与模型组相比，Gyp剂量越高，大鼠抑郁样行为缓解(P < 0.01)、海马神经元凋亡及自噬水平减弱，mTOR/ULK1/ATG13通路蛋白磷酸化水平升高(P < 0.01)；Rap组大鼠海马组织mTOR/ULK1/ATG13通路蛋白磷酸化水平进一步降低(P < 0.01)，海马神经元凋亡及自噬水平进一步升高(P < 0.01)，大鼠抑郁样行为进一步加重(P < 0.01)。Gyp+Rap组大鼠上述指标变化与Gyp组相反(P < 0.01)。 结论Gyp可能通过激活mTOR磷酸化活性水平，促进ULK1及ATG13磷酸化来抑制自噬，防止神经元自噬性死亡，发挥抗抑郁作用。 Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of gypenosides (Gyp) on hippocampal neuron autophagy and pathway of mammalian target of rapamycin (mTOR)/autophagy-activated kinase 1 (ULK1)/autophagy-related protein 13 (ATG13) in depression rats. MethodsSD rats were randomly divided into normal control group, model group, Gyp low (25 mg/kg), high (100 mg/kg) dose group, autophagy activator-rapamycin (Rap) group (1 mg/kg), and Gyp+Rap group (100 mg/kg+1 mg/kg), with 10 rats in each group.Chronic mild unpredictable stress was used to prepare rat depression models, and each group was administered for 4 weeks, once daily.Open field, sugar water preference and forced swimming tests were used to assess depression-like behavior in rats, transmission electron microscope was used to observe the changes in hippocampal neuron structure and the formation of autophagosomes and autophagolysosomes.TUNEL method was used to detect neuronal apoptosis.Immunohistochemical staining was used to detect the phosphorylation level of ULK1 (p-ULK1) and the positive expression level of p-ATG13 in the hippocampus.Western blotting was used to detect the total mTOR, p-mTOR, ribosomal S6 protein (S6), p-S6, ULK1 specific site Ser757 protein (ULK1 Ser757) and p-ULKl Ser757, autophagy-related protein Beclin1, microtubule-related protein Light chain 3 (LC3) protein, apoptosis-related protein-Caspase-3 (Caspase-3) and polyadenylic acid diphosphate ribose polymerase (PARP) protein expression levels. ResultsCompared with the normal control group, the central exploration time in the open field experiment and the percentage of sugar water intake in the model group were reduced, the time of forced swimming immobility was prolonged, the depressive behavior was severe, the nuclear membrane of hippocampal neurons was severely damaged, and autophagosomes were formed more, the apoptosis rate, apoptosis-related protein, Beclin1 and LC3 protein expression were increased, the phosphorylation level of mTOR/ULK1/ATG13 pathway protein was decreased, and the changes of each index were significantly different (P < 0.01).Compared with the model group, with the Gyp dose increased, the depressive behavior of rats was relieved, and the hippocampal neuronal apoptosis and level of autophagy were decreased, the phosphorylation level of mTOR/ULK1/ATG13 pathway protein was increased (P < 0.01);the phosphorylation level of mTOR/ULK1/ATG13 pathway protein in the hippocampus tissue of the Rap group was further reduced, the levels of hippocampal neuron apoptosis and autophagy were further increased, and the depression-like behavior in rats was further aggravated (P < 0.01).The changes of the above indicators in the Gyp+Rap group were opposite to those in the Gyp group (P < 0.01). ConclusionsGyp may inhibit autophagy by activating the activity level of mTOR phosphorylation and promoting the phosphorylation of ULK1 and ATG13, so as to prevent autophagic death of neurons, and exert antidepressant effect. -
Key words:
- depression /
- gypenosides /
- hippocampal neurons /
- autophagy
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表 1 各组大鼠中央探索时间、糖水摄取百分比、强迫游泳不动时间比较(x±s)
分组 n 中央探索时间/s 糖水摄取百分比/% 强迫游泳不动时间/s 正常对照组 10 91.01±4.10 72.32±3.12 77.69±3.02 模型组 10 43.59±2.16** 45.59±2.26** 125.62±5.16** Gyp低剂量组 10 60.52±3.64**△△ 53.52±2.59**△△ 99.31±4.33**△△ Gyp高剂量组 10 77.09±3.54**△△## 64.35±2.88**△△## 86.52±4.06**△△## Rap组 10 33.98±1.03**△△##◇◇ 36.98±1.66**△△##◇◇ 147.98±5.66**△△##◇◇ Gyp+Rap组 10 42.83±2.11**##◇◇☆☆ 45.63±2.49**##◇◇☆☆ 126.68±5.25**##◇◇☆☆ F — 562.82 268.51 337.44 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 8.795 6.467 21.763 q检验: 与正常对照组比较**P < 0.01；与模型组比较△△P < 0.01；与Gyp低剂量组比较##P < 0.01；与Gyp高剂量组比较◇◇P < 0.01；与Rap组比较☆☆P < 0.01 
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表 2 各组大鼠海马神经元细胞凋亡率比较(x±s)
分组 n 凋亡率/% 正常对照组 10 9.19±0.65 模型组 10 27.06±2.32** Gyp低剂量组 10 22.96±2.15**△△ Gyp高剂量组 10 16.96±1.15**△△## Rap组 10 39.65±3.28**△△##◇◇ Gyp+Rap组 10 27.22±2.06**##◇◇☆☆ F — 239.75 P — < 0.01 MS组内 — 4.459 q检验: 与正常对照组比较**P < 0.01；与模型组比较△△P < 0.01；与Gyp低剂量组比较##P < 0.01；与Gyp高剂量组比较◇◇P < 0.01；与Rap组比较☆☆P < 0.01
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表 3 各组大鼠海马组织p-ULK1、p-ATG13阳性表达水平比较(x±s)
分组 n p-ULK1 p-ATG13 正常对照组 10 1.19±0.05 1.16±0.09 模型组 10 0.49±0.03** 0.43±0.03** Gyp低剂量组 10 0.62±0.08**△△ 0.68±0.06**△△ Gyp高剂量组 10 0.85±0.07**△△## 0.83±0.06**△△## Rap组 10 0.15±0.01**△△##◇◇ 0.12±0.01**△△##◇◇ Gyp+Rap组 10 0.46±0.04**##◇◇☆☆ 0.40±0.04**##◇◇☆☆ F — 468.98 450.59 P — < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.003 0.003 q检验: 与正常对照组比较**P < 0.01；与模型组比较△△P < 0.01；与Gyp低剂量组比较##P < 0.01；与Gyp高剂量组比较◇◇P < 0.01；与Rap组比较☆☆P < 0.01
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表 4 大鼠海马组织p-mTOR/mTOR、p-S6/S6、p-ULKl Ser757/ULK1 Ser757蛋白表达比较(x±s)
分组 n p-mTOR/mTOR p-S6/S6 p-ULKl Ser757/ULK1 Ser757 正常对照组 10 1.18±0.08 1.16±0.09 1.06±0.08 模型组 10 0.36±0.03** 0.46±0.05** 0.53±0.05** Gyp低剂量组 10 0.53±0.04**△△ 0.69±0.05**△△ 0.72±0.06**△△ Gyp高剂量组 10 0.76±0.07**△△## 0.81±0.08**△△## 0.93±0.09**△△## Rap组 10 0.15±0.02**△△##◇◇ 0.16±0.01**△△##◇◇ 0.22±0.02**△△##◇◇ Gyp+Rap组 10 0.35±0.03**##◇◇☆☆ 0.49±0.04**##◇◇☆☆ 0.50±0.05**##◇◇☆☆ F — 538.29 331.86 241.33 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.003 0.004 0.004 q检验: 与正常对照组比较**P < 0.01；与模型组比较△△P < 0.01；与Gyp低剂量组比较##P < 0.01；与Gyp高剂量组比较◇◇P < 0.01；与Rap组比较☆☆P < 0.01
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表 5 大鼠海马组织Beclin1、LC3、Caspase-3、PARP蛋白表达比较(x±s)
分组 n Beclin1/β-actin LC3/β-actin Caspase-3/β-actin PARP/β-actin 正常对照组 10 1.01±0.08 1.06±0.10 1.02±0.11 1.13±0.10 模型组 10 2.35±0.23** 2.45±0.25** 2.59±0.25** 2.63±0.24** Gyp低剂量组 10 1.93±0.19**△△ 1.89±0.18**△△ 2.02±0.20**△△ 2.10±0.16**△△ Gyp高剂量组 10 1.46±0.17**△△## 1.51±0.18**△△## 1.63±0.19**△△## 1.73±0.19**△△## Rap组 10 2.75±0.22**△△##◇◇ 2.86±0.21**△△##◇◇ 2.92±0.22**△##◇◇ 2.99±0.26**△△##◇◇ Gyp+Rap组 10 2.33±0.23**##◇◇☆☆ 2.49±0.24**##◇◇☆☆ 2.52±0.25**##◇◇☆☆ 2.64±0.26**##◇◇☆☆ F — 109.88 115.82 113.80 107.90 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 — 0.038 0.040 0.044 0.044 q检验: 与正常对照组比较**P < 0.01；与模型组比较△P < 0.05，△△P < 0.01；与Gyp低剂量组比较##P < 0.01；与Gyp高剂量组比较◇◇P < 0.01；与Rap组比较☆☆P < 0.01
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