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骨缺损的修复一直是创伤骨科的治疗难点，临床上经常因各种疾病如骨质疏松症、骨肿瘤、创伤等因素限制了骨组织的修复能力[1-2]。自体骨移植存在骨量有限、有创取材等弊端，同种异体骨移植的免疫排斥也给大段骨缺损的治疗造成一定的困扰[3-4]。近些年，随着骨科生物组织工程技术的不断创新发展，给骨缺损的修复带来了新的曙光，尤其是水凝胶生物支架的应用效果更是让人为之振奋。甲基丙烯酸明胶(gelatin methacrylamide, GelMA)因其理化性质易，生活活性强等优点，被越来越多地应用到骨科基础研究中[5-6]。然而单纯的生物支架还未完全达到满意的骨损伤修复效果。CD271的发现为解决上述难题提供了可能。CD271又称神经生长因子受体(nerve growth factor receptor，NGFR)，是一种相对分子质量约为75 000的Ⅰ型跨膜磷酸化糖蛋白。CD271抗原特异性表达在一群具有多向分化潜能的人的骨髓细胞中，并且这种表达在不受生长因子刺激的体外培养中可以持续存在[7]。目前，已有多项研究在人骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)中采用CD271磁珠进行分选，并在进一步实验中使用所得细胞，均取得了很好的修复效果[8-9]。同时，BMSCs分化成为骨组织的过程中需要多种因子的调节，其中，血小板衍生生长因子(platelet derived growth factors，PDGF)起到了关键作用。PDGF可以有效促进成骨细胞的增殖和分化，而PDGF的趋化作用则大大增强了单核巨噬细胞的聚集和成纤维细胞向创伤部位的聚集，进一步加强了纤维细胞的增殖分化和胶原分泌功能，从而促进新生骨组织的形成[10-11]。故本实验将CD271和PDGF包裹在GelMA水凝胶中，得到混合水凝胶支架，并将制作好的混合水凝胶支架在体外和体内分别验证其对BMSCs的成骨分化效果。
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SPF级SD大鼠(济南朋悦实验动物繁殖有限公司)；GelMA水凝胶(苏州永沁泉智能设备有限公司)；CD271、PDGF(北京义翘神州生物技术有限公司)；三系分化诱导培养基(美国Cyagen公司)；碱性磷酸酶(ALP)抗体(ab224335, Abcam)、骨钙素(OCN)抗体(ab93876, Abcam)、骨桥蛋白(OPN)抗体(ab11503，Abcam)和Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)抗体(EPR24331-53, Abcam)；活/死细胞染色剂(南京建成公司)。
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利用PBS将冻干的GelMA单体和光引发剂混合，按质量体积比制成5%的GelMA水凝胶溶液，并将混合溶液通过针头滤器(0.22 μm/28 mm)过滤到无菌的离心管中得到5%的GelMA水凝胶溶液。向无菌的混合溶液内加入质量比为1∶ 50的PDGF并混匀，得到GelMA/PDGF溶液，4 ℃避光保存。所有GelMA/PDGF溶液均在紫外光(83 mW/cm2, 405 nm)下照射10 s制成复合水凝胶支架进行后续实验。
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将biotin标记的N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-hydroxysuccinimide ester，NHS)粉末用PBS溶解制成1 mg/mL的溶液，在室温下与GelMA/PDGF水凝胶搅拌反应3 h，使biotin与支架表面连接。将反应后的支架复合物与DyLight488标记的SAV(10 μg/mL)在室温下反应15 min，在荧光显微镜下观察，以观察连接效果。未接枝的GelMA/PDGF支架复合物与DyLight 488 SAV反应，以相同的方法进行对照。
biotin修饰支架复合物在室温下与50 μg/mL SAV搅拌反应15 min洗去未反应溶液后，与biotin-CD271抗体(4.17 μg/mL)室温下混合反应15 min。PBS反复冲洗3次，冲刷未反应溶液，得到CD271抗体修饰的支架复合物。后在室温下与Cy3标记的二级抗体反应10 min，荧光显微镜观察支架表面的抗体修饰效果。将只连接SAV的支架复合物作为对照组，与Cy3标记的二级抗体反应以同样的方式进行。
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分别取GelMA、GelMA/PDGF、GelMA/ CD271、GelMA/PDGF/CD271 4组的凝胶，在紫外光照射固化后，放置于-80 ℃冰箱中过夜，然后将冻凝后的4组支架进行冷冻干燥处理，并在冻干的复合水凝胶支架上喷金，用扫描电子显微镜(SEM，蔡司Gemini 300，德国)观察拍照。
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选取4周龄雄性SD大鼠，于双侧股骨、胫骨骨骺处切断。髓腔用注射器吸取5 mL的DMEM/F12进行冲洗。再用200目滤网过滤掉剩余组织块，1 200 r/min离心5 min，弃去上清液，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞沉淀5 mL，骨髓细胞悬液分离后加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基及1%青霉素/链霉素的DMEM/F12进行孵育，48 h后换液。培养基每3 d更换1次。实验采用2~3代细胞。然后对提取的细胞进行三系分化鉴别，并进行染色处理。
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提前用支架在96孔板中进行铺板，待水凝胶凝固后，将5×104个BMSCs播种在孔板上进行培养，在第1、3、5天时间点检测。每孔加入CCK-8检测液10 μL，与细胞共同孵育2 h。酶标仪检测480 nm吸光度值, 每组实验重复3次。
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采用AV和PI荧光染料对BMSCs进行活/死细胞测定。将细胞培养液在水凝胶支架上处理后，再用PBS清洗2遍。用5 mL Annexin V和5 mL碘化丙啶对水凝胶上的细胞进行染色。5 min后用PBS冲洗3次。最后用荧光显微镜拍摄照片。每组实验重复3次。
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BMSCs在用不同的水凝胶支架7 d后，细胞孵育在Anti-ALP(1∶ 200)、Anti-OCN(1∶ 200)、Anti-OPN(1∶ 200)、Anti-COL-I(1∶ 2 000)的一抗中，再用相应的二抗，定量分析成骨基因的表达。荧光倒置显微镜拍摄观察表达结果。
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利用各种支架培养到细胞融合达到80%~90%，成骨诱导分化培养基继续培养，收集细胞，抽取定量蛋白后，电泳、转移、封闭；与抗OCN抗体(1∶ 1 000)在4 ℃下过夜，用二抗HRP室温孵育2 h (1∶ 2 000)。曝光分析。每组实验重复3次。
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SD大鼠腹腔内注射苯巴比妥钠，麻醉效果满意后沿颅骨纵向全层切开皮肤直至骨膜显露顶骨，骨膜下分别于左右侧各钻一直径5 mm骨窗，骨缺损处分别植入各组水凝胶支架。植入支架后全层缝合皮肤皮下组织，造模术后3 d给予大鼠20万U青霉素肌内注射，每日1次。
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术后8周，对造模大鼠进行Micro-CT检查，通过CT结果评价不同分组大鼠颅骨缺损的修复情况。每组取3只动物进行检测。在Micro-CT参数中，骨体积(bone volume, BV)和组织体积(tissue volume, TV)的比值可直接反映骨量变化情况，因此本研究通过比较各组BV/TV结果评价其成骨效果。
组织学分析：颅骨缺损区取新生骨组织，后将骨组织脱钙软化处理，EDTA脱钙液(pH7.2)中浸泡30 d，每天更换一次。后将样本脱水、透明化石蜡包埋；在植入的中心区域切下10 μm厚的切片，并将去石蜡的切片用HE染色以及Masson′s三色试剂染色，在光学显微镜下评估骨形成区。
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采用单因素方差分析和q检验。
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细胞培养至第三代时，细胞成细长的条索状生长，并且视野下较为纯净(见图 1A)。后分别进行成软骨(见图 1B)、成骨(见图 1C)和成脂(见图 1D)检测。通过表征鉴定，证实提取的细胞为BMSCs。
图 1 BMSCs的提取与鉴定
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扫描电镜观察发现，4组支架的横断面均呈蜂窝状孔隙结构；4组水凝胶支架表征孔径直径从大到小顺位依次是：GelMA组、GelMA+PDGF组、GelMA+CD271、GelMA+CD271+PDGF组(P < 0.05)(见图 2、表 1)。
图 2 扫描电镜观察水凝胶支架表征
分组 n 水凝胶孔径直径/μm GelMA 3 154.25±2.65 GelMA+CD271 3 131.87±3.26* GelMA+PDGF 3 153.97±5.52# GelMA+CD271+PDGF 3 110.33±6.69*#△ F — 5 439.88 P — < 0.01 MS组内 — 30.210 q检验：与GelMA组比较*P < 0.05；与GelMA+CD271组比较#P < 0.05；与GelMA+PDGF组比较△P < 0.05 表 1 4组水凝胶支架表征孔径直径的比较(x±s)
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分别在BMSCs种植在4组水凝胶上的第1、3、5天进行CCK-8实验增殖情况检测。其中在种植的3 d后，GelMA+PDGF组和GelMA+CD271+PDGF组细胞的生长情况明显强于其他2组(P < 0.05)，且GelMA+CD271+PDGF组生长效果最佳(P < 0.05)(见表 2)。
分组 n 第1天 第3天 第5天 F P MS组内 GelMA 3 0.36±0.09 0.66±0.07 0.78±0.04 28.85 < 0.01 0.005 GelMA+CD271 3 0.41±0.05 0.70±0.08 0.82±0.07 28.98 < 0.01 0.005 GelMA+PDGF 3 0.42±0.05 0.81±0.02* 1.06±0.07*# 120.04 < 0.01 0.003 GelMA+CD271+PDGF 3 0.41±0.05 1.05±0.04*#△ 1.36±0.08*#△ 201.17 < 0.01 0.004 F — 0.33 14.22 22.21 — — — P — >0.05 < 0.01 < 0.01 — — — MS组内 — 0.007 0.006 0.009 — — — q检验：与GelMA组比较*P < 0.05；与GelMA+CD271组比较#P < 0.05；与GelMA+PDGF组比较△P < 0.05 表 2 CCK-8检测不同水凝胶支架对BMSCs增殖的影响(x±s)
随后，对种植在不同组别的水凝胶中的细胞染色发现，每组水凝胶中均有活细胞(见图 3)，4组活细胞数量比较显示，GelMA+CD271+PDGF组活细胞数量最多，其次为GelMA+CD271和GelMA+PDGF组，最少为GelMA组(P < 0.05)(见表 3)。
图 3 活/死细胞染色检测不同水凝胶支架BMSCs活细胞情况(绿色为活细胞)
分组 n 活细胞百分比/% GelMA 3 79.03±1.21 GelMA+CD271 3 89.55±0.80* GelMA+PDGF 3 91.44±0.86* GelMA+CD271+PDGF 3 96.10±1.01*#△ F — 83.36 P — < 0.01 MS组内 — 1.873 q检验：与GelMA组比较*P < 0.05；与GelMA+CD271组比较#P < 0.05；与GelMA+PDGF组比较△P < 0.05 表 3 活/死细胞染色检测不同水凝胶支架BMSCs活细胞数量情况(x±s)
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GelMA组诱导干细胞分化，促进细胞分化成骨，在负载因子后，成骨相关基因的表达均高于单纯GelMA水凝胶组，特别是在CD271与PDGF共同混合时候，成骨能力最强(见图 4)。
图 4 免疫荧光检测不同的水凝胶支架BMSCs的体外成骨分化情况
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Western blotting结果提示，相对于单纯的GelMA水凝胶组，负载单一药物的复合水凝胶(GelMA+CD271和GelMA+PDGF)组细胞内OCN蛋白增加(P < 0.05)，而复合水凝胶负载2组因子(GelMA+CD271+PDG)组的含量最高(P < 0.05)(见图 5、表 4)。
图 5 Westernblotting检测不同水凝胶支架中BMSCs细胞中OCN蛋白水平
分组 n OCN蛋白水平 GelMA 3 32.09±3.25 GelMA+CD271 3 48.55±2.36* GelMA+PDGF 3 46.00±1.59* GelMA+CD271+PDGF 3 58.48±2.56*#△ F — 28.93 P — < 0.01 MS组内 — 12.290 q检验：与GelMA组比较*P < 0.05；与GelMA+CD271组比较#P < 0.05；与GelMA+PDGF组比较△P < 0.05 表 4 不同水凝胶支架中BMSCs的OCN表达水平的比较(x±s)
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术后8周，单纯的GelMA水凝胶组仅有稀疏的骨痂生成，较少的新生骨组织出现，其他组的新骨组织形成较多，与GelMA组相比，其中GelMA+CD271+PDGF组的骨再生率最高，缺损部位几乎被新骨组织覆盖(见图 6)。定量分析显示，GelMA+CD271+PDGF组的BV/TV显著高于其他各组(P < 0.05)(见表 5)。然后，对颅骨缺损处骨组织样本进行脱钙、软化等处理并制备成石蜡切片，镜下观察骨组织生长情况。新形成的骨组织通过HE染色和Masson′s三色染色，结果与Micro-CT的结果一致。在颅骨缺损建模8周后，GelMA水凝胶在GelMA+CD271+PDGF组已完全降解，新形成的骨组织已经完全覆盖了缺损部位，厚度已经达到覆盖缺损部位，达到正常骨组织的80%，骨组织的成熟度程度明显高于其他组(见图 7)。
图 6 CT检测8周后，不同的水凝胶支架大鼠颅骨缺损修复情况
分组 n (BV/TV)/% GelMA 3 7.76±0.83 GelMA+CD271 3 15.54±0.60* GelMA+PDGF 3 33.50±1.32*# GelMA+CD271+PDGF 3 45.14±1.88*#△ F — 279.5 P — < 0.01 MS组内 — 3.090 q检验：与GelMA组比较*P < 0.05；与GelMA+CD271组比较#P < 0.05；与GelMA+PDGF组比较△P < 0.05 表 5 不同水凝胶支架促进骨再生BV/TV的比较(x±s)
图 7 组织学染色(HE染色和Masson三色染色)
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骨骼有较强的自我再生能力，小面积的骨缺损通常可以通过自身细胞增生自愈。然而，由创伤性骨折、先天性畸形导致的大面积骨缺损可能无法正常愈合，往往需要进行骨移植修复。骨组织工程旨在开发体外骨移植替代品，克服天然骨移植的缺陷，是一种很有前途的治疗策略[12-13]。
正常骨组织的形成与吸收保持一种动态平衡，这一平衡由成骨细胞和破骨细胞二者相互作用营造的[14]。据报道[15-16]，CD271表达于多数羟链霉素及Ⅲ型胶原的骨髓基质细胞中，同时还出现在早期发育中的人胚胎骨骺骨的骨髓基质中，暗示着其与人骨髓中干细胞之间的关联性，可促进成骨分化和骨形成。研究[17]表明，成纤维细胞克隆形成单位(colony-forming unit-fibroblast, CFU-F)活性具有一定的生物特异性，仅存在于CD271细胞群内，而在培养过程中，CD271细胞并没有表现出CFU-F的特性。经过成骨诱导分化后，CD271细胞形成的矿化结节明显大于贴壁法获得的BMSCs，同时在成骨相关基因如ALP、OCN等的表达上也具有绝对优势，因此CD271细胞获得的BMSCs与传统的贴壁培养相比，分化成骨的潜力更为显著[16, 18]。过去的研究[19]发现，在骨折愈合过程中PDGF处于持续高水平表达，这一研究结果表明PDGF不仅参与骨折愈合早期的血供的恢复重建，在骨愈合后期的新生骨重建塑型过程中同样起着至关重要的作用。将外源性PDGF运用于原位骨组织工程学中，可协助诱导募集后的细胞进行成骨分化，以更好地达成骨缺损修复。
在本研究中，我们设计并制备了GelMA+CD271+PDGF的混合支架。这一混合支架复合体兼具有促进成骨分化和生物支架的作用，更加有利于骨缺损修复。为了确定GelMA+CD271+PDGF混合支架对骨髓间充质干细胞的增殖影响，笔者进行了细胞增殖实验和活/死细胞染色，结果表明，单纯的水凝胶和水凝胶负载药物组对骨髓间充质干细胞具有一定的促进增殖作用，但是当使用GelMA+CD271+PDGF混合支架时，这种增殖的效率明显高于其他组别。在BMSCs进行成骨诱导时，ALP、OCN等成骨相关蛋白表达增高[20]。同时，本研究通过对成骨分化早期指标ALP和COL-I基因的表达检测，以及骨成熟晚期标志物OCN和OPN的表达水平的测定，鉴定出复合物支架对成骨分化的影响，发现GelMA+CD271+PDGF混合支架中ALP、COL-I、OCN和OPN在使用BMSCs诱导分化后，荧光强度比其他支架高，且Western blotting检测OCN蛋白的表达量比其他支架的表达量更高，与细胞增殖实验结果一致。
本研究分别将不同的生物支架复合体植入SD大鼠颅骨缺损部位，通过CT扫描，观察骨缺损部位骨生长情况评价生物支架复合体对机体骨再生的影响效果。术后8周取头颅进行CT扫描，所有组别中支架填充后新形成骨组织的数量明显增加，这可能与既往研究[21-22]报道的GelMA水凝胶的骨导电性有关。以甲基丙烯酸酐和明胶为原料制备了凝胶-凝胶，后者含有基质金属蛋白酶和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的目标基序，可能在提高细胞黏附性和生物降解性方面发挥了作用[23-24]。在本研究各实验组中，缺损位置均大量形成新生骨，而在使用GelMA+CD271+PDGF混合水凝胶支架组中，新生骨的面积大于缺损处的50%，体内成骨能力最好。
总之，本研究成功地合成了GelMA+CD271+PDGF混合水凝胶支架作为骨组织工程的支架，该支架实现了缓慢和持续的CD271释放，从而增强了体外的成骨分化和体内骨再生；且通过术后8周MicroCT扫描结果进一步证实了该组大鼠颅骨缺损成骨愈合情况最佳。本研究结果表明GelMA+CD271+PDGF混合支架可以促进体外成骨分化和体内骨再生，并在骨组织工程中显示出巨大的应用潜力。
可注射GelMA水凝胶搭载CD271与PDGF修复骨缺损的实验研究
Experimental study of injectable GelMA hydrogel loaded with CD271 and PDGF in bone defect repair
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摘要:
目的探讨负载CD271与血小板衍生生长因子(PDGF)的可注射甲基丙烯酸明胶(GelMA)水凝胶支架在SD大鼠颅骨缺损修复中的效果。 方法利用5%的GelMA水凝胶与PDGF共同构建得到GelMA/PDGF支架，然后将CD271抗体对支架进行修饰。实验共分为GelMA、GelMA/PDGF、GelMA/ CD271、GelMA/PDGF/CD271 4组。通过水凝胶支架与雄性SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体外共同培养，检测细胞的生物相容性及成骨相关蛋白的表达情况；颅骨缺损模型使用的动物为质量约350 g的SD雄性大鼠，并在骨缺损处植入水凝胶支架；大鼠颅骨在术后8周接受Micro-CT检测以评估修复效果。 结果BMSCs与负载CD271与PDGF的GelMA水凝胶支架具有良好的生物相容性，可提高成骨相关蛋白(碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原蛋白、骨钙素和骨桥蛋白)的表达(P < 0.05)，并可促进修复体内颅骨的缺损。 结论负载CD271与PDGF的混合水凝胶支架具有良好的生物相容性，在骨组织工程中极具应用潜力，能促进BMSCs的成骨分化。 -
关键词:
- 骨缺损 /
- 可注射甲基丙烯酸明胶水凝胶 /
- CD271 /
- 血小板衍生生长因子 /
- 骨髓间充质干细胞
Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of an injectable gelatin methacrylamide (GelMA) hydrogel scaffold loaded with CD271 and PDGF in the repair of skull defects in SD rats. MethodsThe GelMA/PDGF scaffold was jointly constructed by using a 5% GelMA hydrogel and PDGF, and then the scaffold was modified with the CD271 antibody.The experiments were divided into four groups: GelMA, GelMA/PDGF, GelMA/CD271, and GelMA/PDGF/CD271.The biocompatibility of the cells and the expression of osteogenic-related proteins were examined by co-culturing hydrogel scaffolds with male SD rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in vitro.The skull defect model was established in SD male rats weighing about 350 g and implanted with hydrogel scaffolds.Micro-CT of the rat skull was performed at 8 weeks after surgery to assess repair efficacy. ResultsBMSCs and GelMA hydrogel scaffold loaded with CD271 and PDGF had good biocompatibility, could upregulate the expression of osteogenic-related proteins (alkaline phosphatase, collagen Ⅰ, osteocalcin, and osteopontin), and promoted the repair of cranial defects in vivo. ConclusionsMixed hydrogel scaffold loading CD271 and PDGF has good biocompatibility and promotes the osteogenic differentiation of BMSCs, and has great application potential in bone tissue engineering. -
表 1 4组水凝胶支架表征孔径直径的比较(x±s)
分组 n 水凝胶孔径直径/μm GelMA 3 154.25±2.65 GelMA+CD271 3 131.87±3.26* GelMA+PDGF 3 153.97±5.52# GelMA+CD271+PDGF 3 110.33±6.69*#△ F — 5 439.88 P — < 0.01 MS组内 — 30.210 q检验：与GelMA组比较*P < 0.05；与GelMA+CD271组比较#P < 0.05；与GelMA+PDGF组比较△P < 0.05 
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表 2 CCK-8检测不同水凝胶支架对BMSCs增殖的影响(x±s)
分组 n 第1天 第3天 第5天 F P MS组内 GelMA 3 0.36±0.09 0.66±0.07 0.78±0.04 28.85 < 0.01 0.005 GelMA+CD271 3 0.41±0.05 0.70±0.08 0.82±0.07 28.98 < 0.01 0.005 GelMA+PDGF 3 0.42±0.05 0.81±0.02* 1.06±0.07*# 120.04 < 0.01 0.003 GelMA+CD271+PDGF 3 0.41±0.05 1.05±0.04*#△ 1.36±0.08*#△ 201.17 < 0.01 0.004 F — 0.33 14.22 22.21 — — — P — >0.05 < 0.01 < 0.01 — — — MS组内 — 0.007 0.006 0.009 — — — q检验：与GelMA组比较*P < 0.05；与GelMA+CD271组比较#P < 0.05；与GelMA+PDGF组比较△P < 0.05
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表 3 活/死细胞染色检测不同水凝胶支架BMSCs活细胞数量情况(x±s)
分组 n 活细胞百分比/% GelMA 3 79.03±1.21 GelMA+CD271 3 89.55±0.80* GelMA+PDGF 3 91.44±0.86* GelMA+CD271+PDGF 3 96.10±1.01*#△ F — 83.36 P — < 0.01 MS组内 — 1.873 q检验：与GelMA组比较*P < 0.05；与GelMA+CD271组比较#P < 0.05；与GelMA+PDGF组比较△P < 0.05
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表 4 不同水凝胶支架中BMSCs的OCN表达水平的比较(x±s)
分组 n OCN蛋白水平 GelMA 3 32.09±3.25 GelMA+CD271 3 48.55±2.36* GelMA+PDGF 3 46.00±1.59* GelMA+CD271+PDGF 3 58.48±2.56*#△ F — 28.93 P — < 0.01 MS组内 — 12.290 q检验：与GelMA组比较*P < 0.05；与GelMA+CD271组比较#P < 0.05；与GelMA+PDGF组比较△P < 0.05
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表 5 不同水凝胶支架促进骨再生BV/TV的比较(x±s)
分组 n (BV/TV)/% GelMA 3 7.76±0.83 GelMA+CD271 3 15.54±0.60* GelMA+PDGF 3 33.50±1.32*# GelMA+CD271+PDGF 3 45.14±1.88*#△ F — 279.5 P — < 0.01 MS组内 — 3.090 q检验：与GelMA组比较*P < 0.05；与GelMA+CD271组比较#P < 0.05；与GelMA+PDGF组比较△P < 0.05
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