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miR-1229-5p对人结直肠癌细胞SW480增殖、迁移及侵袭的作用研究

芮静 周少波

引用本文:
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miR-1229-5p对人结直肠癌细胞SW480增殖、迁移及侵袭的作用研究

    作者简介: 芮静(1991-), 女, 住院医师
    通讯作者: 周少波, zhoushaobodoctor@sina.com
  • 基金项目:

    蚌埠医学院自然科学研究重点项目 BYKY2019145ZD

  • 中图分类号: R735.3

Effect of miR-1229-5p on proliferation, migration and invasion of human colorectal cancer cells SW480

    Corresponding author: ZHOU Shao-bo, zhoushaobodoctor@sina.com
  • CLC number: R735.3

  • 摘要: 目的探讨miR-1229-5p对SW480细胞生物学功能的影响和作用机制。方法采用瞬时转染在SW480细胞中过表达miR-1229-5p,进行细胞克隆、EdU实验、MTT、细胞划痕、Transwell小室迁移及侵袭实验,检测miR-1229-5p mimics组与对照组结直肠癌细胞SW480生物学功能变化。转染过表达miR-1229-5p慢病毒后进行裸鼠皮下成瘤实验,观察miR-1229-5p在体内对细胞增殖能力的影响。通过预测软件TargetScan筛选出X连锁凋亡抑制蛋白相关因子1(XAF1)作为miR-1229-5p的潜在下游靶基因,并检测miR-1229-5p对其蛋白表达的影响。在SW480细胞中转染XAF1过表达质粒,共转染miR-1229-5p后进行回复实验验证miR-1229-5p通过靶向XAF1促进SW480细胞增殖及侵袭。结果miR-1229-5p mimics组较miR-NC组细胞的增殖、迁移及侵袭能力均提高(P < 0.01);miR-1229-5p组瘤体体积高于miR-NC组(P < 0.01);miR-1229-5p组对靶基因XAF1表达量低于miR-NC组(P < 0.01),转染XAF1质粒后可逆转miR-1229-5p mimics对细胞增殖及侵袭的促进作用(P < 0.01)。结论miR-1229-5p可通过靶向XAF1促进结直肠癌细胞SW480的增殖和侵袭能力。
  • 图 1  过表达miR-1229-5p后促进SW480细胞在体外的增殖能力

    图 2  过表达miR-1229-5p后促进SW480细胞迁移和侵袭能力

    图 3  转染GFP荧光慢病毒后荧光表达情况

    图 4  miR-1229-5p可靶向XAF1, 过表达XAF1表达可逆转miR-1229-5p mimics的促癌作用

    表 1  过表达miR-1229-5p后可增强SW480细胞的增殖能力(x±s)

    分组 n miR-1229-5p相对表达量 克隆数量/个 96 h吸光度值 EdU阳性细胞率/%
    miR-NC 3 1.00±0.17 229.33±28.91 0.85±0.10 32.66±4.04
    miR-1229-5p mimics 3 800.60±137.42 391.33±17.61 1.10±0.11 50.66±5.13
    t 4.16 4.16 2.86 4.77
    P < 0.01 < 0.01 < 0.02 < 0.02
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    表 2  过表达miR-1229-5p后可增强SW480细胞的迁移及侵袭能力及体内成瘤能力(x±s)

    分组 n 24 h划痕面积比例/% 迁移细胞数量/个 侵袭细胞数量/个 瘤体体积/mm3
    miR-NC 3 32.08±1.65 73.33±9.07 85.67±12.90 0.51±0.14
    miR-1229-5p mimics 3 20.22±2.05 164.67±11.06 181.00±17.52 1.70±0.48
    t 7.8 11.06 7.59 4.17
    P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
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    表 3  过表达XAF1可逆转miR-1229-5p mimics的促癌作用(x±s)

    分组 n 96 h吸光度值 克隆数量/个 24 h划痕面积比例/% 迁移细胞数量/个 侵袭细胞数量/个
    miR-1229-5p mimics 3 1.14±0.14 199.67±22.81 34.00±3.60 43.33±8.02 53.33±12.01
    +pcDNA3.1-XAF1 miR-1229-5p mimics +Vector-NC 3 1.49±0.16 353.00±33.60 21.64±3.85 141.00±13.53 129.00±17.69
    t 2.84 6.54 4.06 10.76 6.13
    P < 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-03-28
  • 录用日期:  2023-05-14
  • 刊出日期:  2023-11-15

miR-1229-5p对人结直肠癌细胞SW480增殖、迁移及侵袭的作用研究

    通讯作者: 周少波, zhoushaobodoctor@sina.com
    作者简介: 芮静(1991-), 女, 住院医师
  • 蚌埠医学院第二附属医院 普通外科, 安徽 蚌埠 233040
基金项目:  蚌埠医学院自然科学研究重点项目 BYKY2019145ZD

摘要: 目的探讨miR-1229-5p对SW480细胞生物学功能的影响和作用机制。方法采用瞬时转染在SW480细胞中过表达miR-1229-5p,进行细胞克隆、EdU实验、MTT、细胞划痕、Transwell小室迁移及侵袭实验,检测miR-1229-5p mimics组与对照组结直肠癌细胞SW480生物学功能变化。转染过表达miR-1229-5p慢病毒后进行裸鼠皮下成瘤实验,观察miR-1229-5p在体内对细胞增殖能力的影响。通过预测软件TargetScan筛选出X连锁凋亡抑制蛋白相关因子1(XAF1)作为miR-1229-5p的潜在下游靶基因,并检测miR-1229-5p对其蛋白表达的影响。在SW480细胞中转染XAF1过表达质粒,共转染miR-1229-5p后进行回复实验验证miR-1229-5p通过靶向XAF1促进SW480细胞增殖及侵袭。结果miR-1229-5p mimics组较miR-NC组细胞的增殖、迁移及侵袭能力均提高(P < 0.01);miR-1229-5p组瘤体体积高于miR-NC组(P < 0.01);miR-1229-5p组对靶基因XAF1表达量低于miR-NC组(P < 0.01),转染XAF1质粒后可逆转miR-1229-5p mimics对细胞增殖及侵袭的促进作用(P < 0.01)。结论miR-1229-5p可通过靶向XAF1促进结直肠癌细胞SW480的增殖和侵袭能力。

English Abstract

  • 结直肠癌严重威胁人类生命健康,2021年癌症数据统计显示,不论是新发病率还是死亡率,结直肠癌在男女中均位于第3位,且在65岁以上人群中,发病率逐年升高[1]。结直肠癌的发病和其他所有癌症相似,均是多因素、多步骤的复杂过程,早期诊断治疗,大部分病人可获益,得到临床治愈,若在疾病晚期才确诊治疗,预后极差,严重影响病人生存质量,对病人经济造成严重负担,故研究结直肠癌发生发展机制,尝试寻找新的诊断及治疗方向,对于提高结直肠癌诊断和治愈率具有重要意义。miRNA在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用[2],miRNA通过结合到与其互补的mRNA的位点,诱导其靶点mRNA的降解或翻译后的表达发挥作用[3-4],miRNA参与调控包括细胞的分化、发育、增殖、凋亡等多种功能,其表达失调将导致重大疾病的发生,如肿瘤、代谢异常等等。有文献[5]报道,7例miRNA(let-7a,miR-1229,miR-1246,miR-150,miR-21,miR-223和miR-23a)在早期结直肠癌病人血清的外泌体中高表达;HU等[6]亦发现循环exomiR-1229水平在结直肠癌病人的血清外泌体中显着增加,并且与肿瘤大小、淋巴转移、TNM分期和不良存活显著相关。JIN等[7]通过基因芯片技术发现,与亲代细胞相比,3种耐药性结直肠癌细胞系细胞中14种miRNA的表达显著升高,在这些miRNA中,miR-21-5p、miR-1246、miR-1229-5p、miR-135b、miR-425和miR-96-5p在来自抗性细胞的培养基的外泌体中上调;但鲜见单纯miR-1229-5p对结直肠癌细胞SW480生长及侵袭作用的研究。本研究通过在SW480细胞中过表达miR-1229-5p并进行体内外功能实验,探讨miR-1229-5p在结直肠癌细胞SW480中的生物学功能及潜在机制,为筛选结直肠癌疾病发生发展的相关分子机制提供思路。

    • 采用ATCC细胞库(Manassas, VA, USA)的人结直肠癌细胞株SW480进行实验。所有细胞培养在含有10%胎牛血清和100 U/mL青霉素-链霉素抗生素的RPMI-1640培养基中,并放置在37 ℃含有5% CO2和95%饱和湿度的细胞培养箱中培养。本实验使用成熟的miRNA样本: 由GenePharma公司(中国上海)合成Hsa-miR-1229-5p模拟物(miR-1229-5p mimics)和阴性对照(miR-NC),X连锁凋亡抑制蛋白过表达质粒(pcDNA3.1-XAF1)和空质粒(Vector-NC),转染过程使用Lipo3000和Opti-MEM培养基,转染效率通过转染FAM荧光后使用荧光显微镜进行观察。

    • 细胞使用Trizol提取总RNA后,使用逆转录试剂盒按照说明书操作,将RNA逆转录为cDNA,荧光试剂盒购买自罗氏公司。按照说明书操作,miR 1229-5p上游引物序列: 5′-ACA CTC CAG CTG GGC TCT CAC CAC TGC CCT 3′-下游序列: 5′-TGT CGT GGA GTC GGC AAT TC 3′; U6上游引物序列: 5′- GCT CGC TTC GGC AGC ACA TA 3′,下游引物序列: 5′-AAT ATG GAA CGC TTC ACG AAT TTG C 3′。以U6作为内参,通过2-△△Ct法计算miR-1229-5p的相对含量。

    • 将转染后的结直肠癌细胞(500个/孔)种植到6孔板中,3~4 d进行细胞换液,在细胞培养8~12 d后,观察阳性克隆团块形成(>50细胞/团块)后甲醇固定15 min,用结晶紫进行染色20 min后拍照。

    • 转染48 h后,将细胞2 000个/孔接种于96孔板中,分为24、48、72、96 h组,在每孔加入MTT试剂20 μL,培养4 h后去除上清液,加入200 μL二甲基亚砜,将孔板放入37 ℃培养箱孵育10 min后用酶标仪检测每孔吸光度值,吸收波长570 nm,以仅加二甲基亚砜的空白孔作为对照。

    • 使用BeyoClickTM EdU-594细胞增殖检测试剂盒(碧云天,C0078S)进行细胞增殖检测,将转染48 h后的细胞均匀布孔到24孔板中,细胞核使用DAPI(碧云天,C1002) 染色标记,实验方法遵循生产商的使用说明。最后使用活细胞工作站进行荧光拍照,在高倍镜下每张玻片随机选取5个不同的视野。

    • 转染细胞接种于6孔板中。当细胞渐渐融合铺满后,使用10 μL的枪头和移液枪在标尺定位后进行细胞划痕。然后用PBS冲洗2次,去除脱落细胞,分别于0、24 h在倒置显微镜下拍照(40×),划痕后的细胞培养在含1%胎牛血清的RPMI-1640培养基中。细胞迁移(细胞伤口愈合率)通过计算伤口愈合面积占总面积的比值来确定。

    • 侵袭实验是使用Transwell小室在24孔板中进行,在小室的基底膜上层加入均匀的基质胶。将转染后的细胞(5×104个/孔)种植于小室上层,24 h后用棉签轻柔去除上层非侵袭性细胞后,用甲醇固定小室下层侵袭的细胞15 min,然后用结晶紫染色20 min。迁移实验所有操作步骤相同,但不使用基质胶。在活细胞工作站高倍显微镜下(200×),记录每个小室中5个不同区域视野的侵袭染色后的细胞。

    • TargetScan(http://www.targetscan.org/)预测miR-1229-5p的潜在靶基因,最终选择XAF1作为靶基因。

    • 48 h后从转染的SW480细胞中提取蛋白并进行BCA蛋白浓度测定。上样缓冲液(5生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒配置10%的分离胶,电泳时的电压设置为80 V运行约30 min后观察彩色蛋白分子量标志物的条带分离后将电压调增至110 V。转PVDF膜时电流设置为200 mA运行90~120 min。封闭使用5%的脱脂奶粉,摇床2~3 h。孵育一抗使用的抗体分为:小鼠来源的β-actin (1∶1 000, AA128,碧云天公司),兔来源的XAF1 (1∶1 000, ab17204, Abcam公司)。孵育二抗使用的抗体有:山羊抗小鼠IgG(1∶1 000, A0216,碧云天公司),山羊抗兔IgG(1∶1 000, A0208,碧云天公司))。最后使用Bio-Rad公司的曝光仪进行条带发光显影。

    • 慢病毒LV-miR-1229-5p及其对照慢病毒购自上海吉凯生物科技有限公司。按照说明书的要求,分别将过表达miR-1229-5p的慢病毒和对照病毒按病毒感染复数(MOI)=20感染SW480细胞,感染后72 h使用2 μg/mL嘌呤霉素筛选细胞。慢病毒转染效率及方法是否成功通过转染带绿色荧光的GFP慢病毒,在荧光显微镜下观察绿色荧光明确。取0.2 mL细胞悬液(细胞密度1×107/mL)分别在裸鼠腋下皮下接种,瘤体生长至合适大小后处死裸鼠,获取瘤体。肿瘤体积=长径×短径2×0.5。

    • 采用t检验。

    • 采用瞬时转染实验,通过转染FAM荧光标记的NC(FAM-miR-NC)后荧光显微镜观察显示转染效率高于90%(见图 1A)。荧光定量PCR结果验证转染miR-1229-5p后细胞内miR-1229-5p表达量升高(P < 0.01)(见表 1);克隆形成实验、MTT实验、EdU实验检测miR-1229-5p在体外对细胞增殖能力影响,结果显示过表达miR-1229-5p后可增强细胞增殖能力(P < 0.01)(见表 1图 1B~1C)。

      图  1  过表达miR-1229-5p后促进SW480细胞在体外的增殖能力

      分组 n miR-1229-5p相对表达量 克隆数量/个 96 h吸光度值 EdU阳性细胞率/%
      miR-NC 3 1.00±0.17 229.33±28.91 0.85±0.10 32.66±4.04
      miR-1229-5p mimics 3 800.60±137.42 391.33±17.61 1.10±0.11 50.66±5.13
      t 4.16 4.16 2.86 4.77
      P < 0.01 < 0.01 < 0.02 < 0.02

      表 1  过表达miR-1229-5p后可增强SW480细胞的增殖能力(x±s)

    • 划痕实验结果提示过表达miR-1229-5p可增加SW480细胞迁移能力(P < 0.01)(见表 2图 2A);侵袭实验检测miR-1229-5p mimics组与miR-NC组对结直肠癌细胞SW480侵袭能力的影响,miR-1229 mimics可促进SW480细胞侵袭能力(P < 0.01)(见表 2图 2B)。

      分组 n 24 h划痕面积比例/% 迁移细胞数量/个 侵袭细胞数量/个 瘤体体积/mm3
      miR-NC 3 32.08±1.65 73.33±9.07 85.67±12.90 0.51±0.14
      miR-1229-5p mimics 3 20.22±2.05 164.67±11.06 181.00±17.52 1.70±0.48
      t 7.8 11.06 7.59 4.17
      P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01

      表 2  过表达miR-1229-5p后可增强SW480细胞的迁移及侵袭能力及体内成瘤能力(x±s)

      图  2  过表达miR-1229-5p后促进SW480细胞迁移和侵袭能力

    • 通过转染GFP绿色观察慢病毒转染效率及筛选情况,可见SW480细胞均可见GFP绿色荧光(见图 3),提示转染成功。将SW480细胞转染慢病毒及对照后进行裸鼠皮下成瘤实验,通过测量2组瘤体大小,结果证明miR-1229-5p组瘤体体积(1.70±0.48)mm3高于miR-NC组的(0.51±0.14)mm3(t=4.17, P < 0.01)。

      图  3  转染GFP荧光慢病毒后荧光表达情况

    • 生物信息学分析软件TargetScan显示了miR-1229-5p与XAF1的结合位点图(见图 4A)。蛋白免疫印迹实验结果表明,miR-1229-5p mimics组的XAF1表达低于miR-NC组(P < 0.05)(图 4B)。将miR-1229-5p mimics与pcDNA3.1-XAF1或Vector-NC共转染后进行功能学实验,MTT及克隆形成实验结果均表明pcDNA3.1-XAF1可逆转miR-1229-5p mimics的促癌作用,降低细胞增殖能力(P < 0.01),划痕实验、Transwell小室迁移及侵袭实验验证pcDNA3.1-XAF1可减少miR-1229-5p对SW480细胞的迁移、侵袭能力的促进作用(P < 0.01)(见图 4C~4F表 3)。

      图  4  miR-1229-5p可靶向XAF1, 过表达XAF1表达可逆转miR-1229-5p mimics的促癌作用

      分组 n 96 h吸光度值 克隆数量/个 24 h划痕面积比例/% 迁移细胞数量/个 侵袭细胞数量/个
      miR-1229-5p mimics 3 1.14±0.14 199.67±22.81 34.00±3.60 43.33±8.02 53.33±12.01
      +pcDNA3.1-XAF1 miR-1229-5p mimics +Vector-NC 3 1.49±0.16 353.00±33.60 21.64±3.85 141.00±13.53 129.00±17.69
      t 2.84 6.54 4.06 10.76 6.13
      P < 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01

      表 3  过表达XAF1可逆转miR-1229-5p mimics的促癌作用(x±s)

    • 早期结直肠癌发病隐匿,大部分病人症状较轻微,待症状明显就诊时,常常已至中晚期,甚至并发远处转移,临床治疗困难重重。结直肠癌诊断的金标准是行结直肠镜,并取病理活检,缺点较为明显,如标本取材过浅易对肿瘤病理判断产生影响,过深容易导致肠道损伤,成本高昂等[8],无法常规的对一些潜在高风险人群进行筛查,亦无法对肿瘤进行动态监视,对随访及治疗帮助不大[9]。miRNA的异常表达已被大量文献报道,miRNA的表达失调可以起到促癌或或抑癌基因作用,miRNA虽不直接发挥功能,但通过调控转录后基因表达参与集体各种生理过程,并且miRNA可通过各种方式进入循环系统,与AGO2等RNA结合蛋白结合,防止被降解,可以作为各种肿瘤的潜在标志物[10]

      miRNA差异表达能影响各种肿瘤的发生发展,miR-140-5p的上调显着抑制了乳腺癌细胞在体内外的增殖、细胞侵袭和迁移能力,并且miR-140-5p上调可使乳腺癌细胞停止在G0/G1期从而抑制其增殖,在机制上,miR-140-5p降低了STAT3、p65和AKT的磷酸化水平,降低CDK2表达、增加E-钙黏蛋白表达水平,表明miR-140-5p可通过抑制AKT/STAT3/NF-κB通路来抑制乳腺癌细胞的肿瘤进展[11]。通过对208个舌肿瘤的免疫组织化学和实时定量PCR分析显示,基质金属蛋白酶MMP10在86%的淋巴结阳性舌肿瘤中过表达,并且在酪氨酸激酶基因AXL介导下促进体内淋巴结和远处转移,但该促癌通路可以被miR-944负向调控从而减轻促癌作用[12]。在肺癌中,Circ_0060937与miR-1304-5p结合使得LAD1基因表达增加,提示circ_0060937通过调节miR-1304-5p/LAD1轴影响肺癌进展[13]。在结直肠癌中,也有许多关于非编码RNA的相关研究。例如有研究团队探究了敲低circ-ERBB2的表达可调节miR-181a-5p/PTEN/Akt途径促进结直肠癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性[14],环状RNA-IFNGR2通过在转录后水平海绵吸附miR-30b间接调节靶基因KRAS,从而诱导结直肠癌细胞产生西妥昔单抗耐药性[15],miRNA125a-5p和miRNA125b-1-5p可通过降低DDB2基因的表达,进而调节EMT标志物的表达水平,从而增强结直肠癌细胞的侵袭和转移能力[16]。外泌体是直径在40~100nm的盘状囊泡,外泌体内可包含RNA及蛋白质,近年来有大量关于外泌体内包裹miRNA对肿瘤影响的研究。CircSTAU2可以被外泌体包裹并递送至胃癌细胞内,并可海绵吸附miR-589来减轻其对CAPZA1基因的抑制作用,从而抑制胃癌的进展[17],此外,MBNL1作为circSTAU2的上游RNA结合蛋白,显着影响circSTAU2的表达。在食管鳞状细胞中,miR-10527-5p在病人的血浆外泌体和肿瘤组织中显着减少,并且外泌体内的miR-10527-5p对鉴别病人是否存在淋巴结转移状态具有高敏感性和特异性,外泌体包裹的miR-10527-5p在体外和体内通过Wnt/β-连环蛋白信号抑制食管鳞状细胞癌细胞的迁移、侵袭和上皮-间质转化[18]

      在人类许多肿瘤的发生过程中,都涉及miR-1229-5p的异常表达。然而,目前鲜见miR-1229-5p与XAF1结合并过表达结直肠癌细胞SW480的增殖和侵袭的相关研究。XAF1与许多疾病以及生物过程都息息相关,在抗病毒免疫中,干扰素调节因子会促进后期干扰素的进一步诱导,形成正反馈通路,加重病毒感染,而XAF1可以通过靶向干扰素调节因子来防止病毒感染后干扰素的过度产生[19];XAF1还可以作为干燥综合征[20]、糖尿病溃疡[21]、狼疮性肾炎[22]、心力衰竭[23]等疾病及预测因子或者是标志物。在各种恶性肿瘤中,XAF1同样扮演者重要的角色,通常被认为是一种促进肿瘤凋亡的肿瘤抑制因子。在三阴性乳腺癌中,沉默PGK1基因可使三阴性乳腺癌细胞系对紫杉醇治疗敏感,同时XAF1在PGK1基因敲除细胞中增加,其凋亡蛋白的表达也增加,抑制PGK1的表达可能通过高表达XAF1使得三阴乳腺癌对紫杉醇治疗再次敏感[24];在卵巢癌细胞系A2780中稳定过表达XAF1可以促进细胞凋亡、抑制细胞增殖[25];在结直肠癌中,TGF-β1通过抑制XAF1转录,从而保护肿瘤细胞,使其凋亡率下降[26];XAF1的过表达显著降低了卵巢癌细胞的侵袭和迁移,并抑制了血管内皮生长因子蛋白的表达[27]。本研究结果表明,不论在体内还是体外,miR-1229-5p的过表达可增强SW480细胞的增殖、侵袭和侵袭能力,并且能抑制XAF1的表达。为进一步明确XAF1能否逆转miR-1229-5p mimics的抑促癌作用,笔者进行了回复实验,将miR-1229-5p mimics与pcDNA3.1-XAF1或Vector-NC共转染后进行功能学实验,结果表明共转染pcDNA3.1-XAF1后可逆转miR-1229-5p mimics的促癌作用,说明miR-1229-5p可通过靶向XAF1促进细胞的恶性进展。

参考文献 (27)

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