• 中国科技论文统计源期刊
  • 中国科技核心期刊
  • 中国高校优秀期刊
  • 安徽省优秀科技期刊

留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

KRT81在乳腺癌组织中的表达及其调控AKT/mTOR通路影响糖代谢抑制乳腺癌细胞增殖的作用

王腾 张晖

引用本文:
Citation:

KRT81在乳腺癌组织中的表达及其调控AKT/mTOR通路影响糖代谢抑制乳腺癌细胞增殖的作用

    作者简介: 王腾(1988-), 男, 主治医师
    通讯作者: 张晖, dajian0629@163.com
  • 基金项目:

    蚌埠医学院自然科学研究重点项目 2020byzd148

  • 中图分类号: R737.9

Expression of KRT81 in breast cancer tissues and its inhibitory effect on proliferation of breast cancer cells by affecting glucose metabolism through regulating AKT/mTOR pathway

    Corresponding author: ZHANG Hui, dajian0629@163.com
  • CLC number: R737.9

  • 摘要: 目的探究KRT81在乳腺癌组织中的表达及其调控AKT/mTOR通路影响糖代谢抑制乳腺癌细胞增殖的作用。方法收集100例乳腺癌病人的病理切片,免疫组织化学检测KRT81在乳腺癌中的表达,分析KRT81表达量与临床病理特征相关性。同时在MCF-7细胞中分别转染过表达质粒、对照质粒、对照敲低质粒、敲低质粒,记作oeKRT81组、NC组、Control组及si-KRT81组。通过集落克隆形成实验检测细胞增殖,流式细胞术检测凋亡细胞,蛋白印迹实验检测AKT/mTOR通路相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的表达。结果免疫组织化学检测结果显示,KRT81蛋白在癌组织中阳性表达明显低于癌旁正常组织(P < 0.01)。KRT81表达水平与Her2、TNM分期、远处转移和组织分级相关(P < 0.05~P < 0.01)。细胞集落克隆形成实验结果显示,oeKRT81组MCF-7细胞集落克隆数明显低于NC组,siKRT81组MCF-7细胞集落克隆数明显高于Control组(P < 0.01)。流式细胞术结果显示,与NC组相比,oeKRT81组MCF-7细胞凋亡率明显增加(P < 0.01);与Control组相比,si-KRT81组MCF-7细胞凋亡率明显减少(P < 0.01)。蛋白印迹实验结果显示,oeKRT81组MCF-7细胞中Bax蛋白水平明显高于NC组,Bcl2、GLUT1、LDH、p-AKT、p-mTOR蛋白水平明显低于NC组(P < 0.01);si-KRT81组Bax蛋白水平明显低于Control组,Bcl2、GLUT1、LDH、p-AKT、p-mTOR蛋白水平明显Control组(P < 0.01)。结论KRT81低表达与乳腺癌的不良预后结局相关,其可能通过抑制AKT/mTOR通路影响糖代谢抑制乳腺癌细胞增殖。
  • 图 1  KRT81在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达

    图 2  KRT81在乳腺癌细胞株中的表达水平及转染效率

    图 3  KRT81对MCF-7细胞集落克隆形成能力的影响

    图 4  KRT81对MCF-7细胞凋亡的影响

    图 5  KRT81对MCF-7细胞糖代谢相关蛋白表达的影响

    图 6  KRT81对MCF-7细胞AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响

    表 1  KRT81在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达(n)

    分组 n KRT81阴性 KRT81阳性 χ2 P
    癌组织 100 70 30 32.00 < 0.01
    癌旁组织 100 30 70
    下载: 导出CSV

    表 2  乳腺癌病人KRT81表达与临床资料的关系(n)

    特征 n KRT81水平 χ2 P
    年龄/岁
        <60 44 33 11 0.94 >0.05
        ≥60 56 37 19
    肿瘤大小/cm
        ≤2 19 10 9 3.37 >0.05
        >2 81 60 21
    ER
        阴性 60 41 19 0.20 >0.05
        阳性 40 29 11
    PR
        阴性 72 48 24 1.36 >0.05
        阳性 28 22 6
    Her2
        阴性 53 47 6 18.74 < 0.01
        阳性 47 23 24
    TNM分期
        Ⅰ~Ⅱ 51 31 20 4.21 < 0.05
        Ⅲ~Ⅳ 49 39 10
    淋巴结转移
        无 47 35 12 0.84 >0.05
        有 53 35 18
    远处转移
        有 36 33 3 12.57 < 0.01
        无 64 37 27
    组织分级
        G1 24 6 19 35.13 < 0.01
        G2 57 47 10
        G3 19 18 1
    下载: 导出CSV

    表 3  KRT81在乳腺癌细胞株中的表达水平比较(ni=3;x±s)

    分组 KRT81蛋白相对表达量 F P MS组内
    MCF-10A细胞 0.86±0.10 20.39 < 0.01 0.010
    MDA-MB-231细胞 0.55±0.11*
    MCF-7细胞 0.34±0.09*#
    q检验:与MCF-10A细胞比较*P < 0.05;与MDA-MB-231细胞比较#P < 0.05
    下载: 导出CSV

    表 4  KRT81在乳腺癌细胞株中的转染效率(ni=3;x±s)

    分组 KRT81蛋白相对表达量 F P MS组内
    NC组 0.31±0.06 140.60 < 0.01 0.004
    oeKRT81组 0.96±0.08*
    Control组 0.98 ±0.04*
    si-KRT81组 0.18±0.06*#▲
    q检验:与NC组比较*P < 0.05;与oeKRT81组比较#P < 0.05; 与Control组比较▲P < 0.05
    下载: 导出CSV

    表 5  过表达KRT81对MCF-7细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)

    分组 Bax蛋白相对表达量 Bcl2蛋白相对表达量 细胞凋亡率/%
    NC组 0.48±0.14 1.37±0.14 5.38±1.02
    oeKRT81组 1.26±0.03 0.55±0.10 15.06±3.21
    t 9.44 8.43 4.978
    P < 0.01 < 0.01 < 0.01
    下载: 导出CSV

    表 6  敲低KRT81对MCF-7细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)

    分组 BAX蛋白相对表达量 Bcl2蛋白相对表达量 细胞凋亡率/%
    Control组 0.89±0.10 0.36±0.08 7.12±0.68
    si-KRT81组 0.22±0.09 1.52±0.15 4.11±0.11
    t 8.15 11.56 7.58
    P < 0.01 < 0.01 < 0.01
    下载: 导出CSV

    表 7  敲低KRT81对MCF-7细胞糖代谢相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)

    分组 GLUT1 LDH
    Control 0.69±0.12 0.66±0.10
    si-KRT81 1.35±0.10 1.31±0.11
    t 7.48 7.63
    P < 0.01 < 0.01
    下载: 导出CSV

    表 8  过表达KRT81对MCF-7细胞糖代谢相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)

    分组 GLUT1 LDH
    NC组 1.13±0.21 1.31±0.11
    oeKRT81组 0.31±0.09 0.25±0.19
    t 6.99 9.77
    P < 0.01 < 0.01
    下载: 导出CSV

    表 9  敲低KRT81对MCF-7细胞AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)

    分组 p-AKT p-mTOR
    Control 0.45±0.10 0.46±0.11
    si-KRT81 1.00±0.12 1.13±0.10
    t 6.15 8.38
    P < 0.01 < 0.01
    下载: 导出CSV

    表 10  过表达KRT81对MCF-7细胞AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)

    分组 p-AKT p-mTOR
    NC组 0.77±0.11 0.89±0.11
    oeKRT81组 0.33±0.10 0.25±0.09
    t 5.27 7.12
    P < 0.01 < 0.01
    下载: 导出CSV
  • [1] ZHAO Y, HU Z, LI J, et al. EZH2 exacerbates breast cancer by methylating and activating STAT3 directly[J]. J Cancer, 2021, 12(17): 5220. doi: 10.7150/jca.50675
    [2] ZHANG H, GE Z, WANG Z, et al. Circular RNA RHOT1 promotes progression and inhibits ferroptosis via mir-106a-5p/STAT3 axis in breast cancer[J]. Aging (Albany NY), 2021, 13(6): 8115.
    [3] SUN D, LI YC, ZHANG XY. Lidocaine promoted ferroptosis by targeting miR-382-5p /SLC7A11 axis in ovarian and breast cancer[J]. Front Pharmacol, 2021, 12: 681223. doi: 10.3389/fphar.2021.681223
    [4] GUO C, LI S, LIANG A, et al. PPA1 Promotes breast cancer proliferation and metastasis through PI3K/AKT/GSK3β signaling pathway[J]. Front Cell Dev Biol, 2021, 9: 730558. doi: 10.3389/fcell.2021.730558
    [5] WANG C, ZHANG R, WANG X, et al. Silencing of kif3b suppresses breast cancer progression by regulating emt and Wnt/β-Catenin signaling[J]. Front Oncol, 2020, 10: 597464.
    [6] LE J, FU Y, HAN Q, et al. Transcriptome analysis of the inhibitory effect of sennoside a on the metastasis of hepatocellular carcinoma cells[J]. Front Pharmacol, 2020, 11: 566099.
    [7] LI J, XUE H, XIANG Z, et al. Genetic profiles affect the biological effects of serine on gastric cancer cells[J]. Front Pharmacol, 2020, 11: 1183. doi: 10.3389/fphar.2020.01183
    [8] YAO X, ZHANG H, TANG S, et al. Bioinformatics analysis to reveal potential differentially expressed long non-coding RNAs and genes associated with tumour metastasis in lung adenocarcinoma[J]. Onco Targets Ther, 2020, 13: 3197. doi: 10.2147/OTT.S242745
    [9] ZHANG K, LIANG Y, ZHANG W, et al. KRT81 knockdown inhibits malignant progression of melanoma through regulating interleukin-8[J]. DNA Cell Biol, 2021, 40(10): 1290. doi: 10.1089/dna.2021.0317
    [10] ZHANG J, ZHANG S, LI X, et al. HOXB5 promotes the progression of breast cancer through wnt/β-catenin pathway[J]. Pathol Res Pract, 2021, 224: 153117. doi: 10.1016/j.prp.2020.153117
    [11] SUNG H, FERLAY J, SIEGEL RL, et al. Global cancer statistics 2020: globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J]. CA Cancer J Clin, 2021, 71(3): 209. doi: 10.3322/caac.21660
    [12] SHI X, SUN Y, ZHANG Y, et al. MEX3A promotes development and progression of breast cancer through regulation of PIK3CA[J]. Exp Cell Res, 2021, 404(1): 112580. doi: 10.1016/j.yexcr.2021.112580
    [13] HINTERLEITNER C, ZHOU Y, TANDLER C, et al. Platelet-expressed tnfrsf13b (TACI) predicts breast cancer progression[J]. Front Oncol, 2021, 11: 642170. doi: 10.3389/fonc.2021.642170
    [14] XUN J, GAO R, WANG B, et al. Histone demethylase KDM6B inhibits breast cancer metastasis by regulating Wnt/β-catenin signaling[J]. FEBS Open Bio, 2021, 11(8): 2273. doi: 10.1002/2211-5463.13236
    [15] XIE H, XIAO R, HE Y, et al. MicroRNA-100 inhibits breast cancer cell proliferation, invasion and migration by targeting FOXA1[J]. Oncol Lett, 2021, 22(6): 816. . doi: 10.3892/ol.2021.13077
    [16] LIU H, QIN H, ZHOU Y, et al. HET0016 attenuates the stemness of breast cancer cells through targeting CYP4Z1[J]. Mol Carcinog, 2021, 60(6): 413. doi: 10.1002/mc.23302
    [17] WU Y, FU L, WANG B, et al. Construction of a prognostic risk assessment model for lung adenocarcinoma based on Integrin β family-related genes[J]. J Clin Lab Anal, 2022, 36(6): e24419. . doi: 10.1002/jcla.24419
    [18] KRUGER SF, LOHNEIS A, ABENDROTH A, et al. Prognosis and tumor biology of pancreatic cancer patients with isolated lung metastases: translational results from the German multicenter AIO-YMO-PAK-0515 study[J]. ESMO Open, 2022, 7(1): 100388. doi: 10.1016/j.esmoop.2022.100388
    [19] WANG K, HUANG W, SANG X, et al. Atractylenolide I inhibits colorectal cancer cell proliferation by affecting metabolism and stemness via AKT/mTOR signaling[J]. Phytomedicine, 2020, 68: 153191. doi: 10.1016/j.phymed.2020.153191
    [20] 张菊香, 赵晓慧, 史艳春. T2DM合并NAFLD病人FC-P、FINS、血糖指标表达及其与肝纤维化的关系[J]. 蚌埠医学院学报, 2021, 46(6): 807. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2021.06.025
    [21] WENG HC, SUNG CJ, HSU JL, et al. The Combination of a novel glut1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the dna damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways[J]. Front Pharmacol, 2022, 13: 879748. doi: 10.3389/fphar.2022.879748
    [22] NILCHIAN A, GIOTOPOULOU N, SUN W, et al. Different regulation of glut1 expression and glucose uptake during the induction and chronic stages of TGFβ1-induced EMT in breast cancer cells[J]. Biomolecules, 2020, 10(12): 1621. doi: 10.3390/biom10121621
    [23] OKRAH EA, WANG Q, FU H, et al. PdpaMn inhibits fatty acid synthase-mediated glycolysis by down-regulating PI3K/Akt signaling pathway in breast cancer[J]. Anticancer Drugs, 2020, 31(10): 1046. doi: 10.1097/CAD.0000000000000968
  • [1] 徐卫强关翰陈志军 . miR-107靶向肿瘤蛋白D52抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭. 蚌埠医学院学报, 2022, 47(10): 1347-1351. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2022.10.004
    [2] 吴海华李钰张凌宇王海凤陈丽黄文明陈素莲陈昌杰杨清玲 . 长链非编码RNA GAS5对人乳腺癌细胞株增殖和侵袭能力的影响. 蚌埠医学院学报, 2016, 41(7): 849-853. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2016.07.003
    [3] 谢安心王思源张洁张惠娟唐海欧谭敦勇 . miR-99b-5p通过靶向TRIB1基因调控乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的研究. 蚌埠医学院学报, 2022, 47(10): 1331-1335. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2022.10.001
    [4] 张生义张己为张旭峰张逸许斌斌左顺庆 . 华蟾素对非小细胞肺癌细胞株A549细胞增殖及PTEN/AKT/mTOR信号通路表达的影响. 蚌埠医学院学报, 2020, 45(9): 1159-1162. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2020.09.004
    [5] 杨清陈广业 . Ninjurin2在乳腺癌中的表达及其与预后的关系. 蚌埠医学院学报, 2023, 48(7): 877-880. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2023.07.005
    [6] 杨硕陈天天王文锐杨清玲陈昌杰 . 长链非编码RNA LINC00173在紫杉醇耐药乳腺癌细胞中的作用. 蚌埠医学院学报, 2020, 45(9): 1153-1158. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2020.09.003
    [7] 杨雯娣王峰 . circ_AFF2通过调节PI3K/AKT通路对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖、迁移和侵袭的影响. 蚌埠医学院学报, 2023, 48(7): 872-876. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2023.07.004
    [8] 苗健马涛李楠张松松霍强吴成柱 . 厚朴酚葡萄糖苷对人乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响. 蚌埠医学院学报, 2018, 43(5): 567-572. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2018.05.002
    [9] 尚丹王辉韩晔赵冲 . 木犀草素对小鼠体外培养前成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化、矿化和Wnt通路的影响. 蚌埠医学院学报, 2017, 42(1): 44-47. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2017.01.012
    [10] 刘红艳齐创 . 萝卜硫素调控TGF-β1/Smad信号通路抑制结肠癌HT-29细胞增殖的机制研究. 蚌埠医学院学报, 2020, 45(3): 311-314. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2020.03.007
    [11] 武峻捷朱永娜姜丽娜武庆华张伟健石昕刘茜 . IL-34介导的NF-кB信号通路对根尖牙乳头干细胞增殖、迁移的调节作用. 蚌埠医学院学报, 2023, 48(8): 1024-1029. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2023.08.003
    [12] 王雨罗璨吉兆宁 . 鸦胆子苦素D通过PI3K/Akt信号通路抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞的能量代谢研究. 蚌埠医学院学报, 2020, 45(5): 561-565. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2020.05.001
    [13] 苏智祥于滨魏晓辉张燕军 . 弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中IP-10及受体CXCR3表达与细胞增殖、侵袭、耐药蛋白表达的相关性. 蚌埠医学院学报, 2022, 47(4): 487-490. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2022.04.015
    [14] 刘宏莉龚萍刘浩张旭东蒋志文 . 抑制葡萄糖调节蛋白78表达对阿霉素诱导人乳腺癌SK-BR-3细胞凋亡的增敏作用. 蚌埠医学院学报, 2010, 35(6): 555-557,561.
    [15] 欧阳雪岩朱朕杨超王丽姜峰丁罡 . 焦虑状态下去甲肾上腺素激活Akt信号通路对乳腺癌作用研究. 蚌埠医学院学报, 2019, 44(7): 841-845. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2019.07.001
    [16] 禹莉章尧陈昌杰高绪锋王惠 . 同型半胱氨酸对A7r5细胞增殖及MMP-2表达的影响. 蚌埠医学院学报, 2008, 33(3): 266-269.
    [17] 付晓艳秦锡虎陈同珏谈敏 . 新辅助化疗对乳腺癌细胞凋亡和增殖的影响. 蚌埠医学院学报, 2006, 31(6): 624-626.
    [18] 胡嵩张岩巍姜鹏飞孙贝贝 . 转录因子ETS-1对乳腺癌细胞增殖作用的影响. 蚌埠医学院学报, 2017, 42(1): 27-29,33. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2017.01.007
    [19] 王慧吴俊英 . siRNA靶向抑制4-1BBL基因表达在HL-60细胞对淋巴细胞增殖和凋亡的影响. 蚌埠医学院学报, 2018, 43(9): 1121-1124. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2018.09.001
    [20] 刘华长杨彦立薛增明任珊 . miR-503-5p对IL-1β诱导的血管内皮细胞增殖、迁移、凋亡和黏附的影响. 蚌埠医学院学报, 2021, 46(12): 1668-1672. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2021.12.006
  • 加载中
图(6)表(10)
计量
  • 文章访问数:  2609
  • HTML全文浏览量:  1540
  • PDF下载量:  20
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2022-02-14
  • 录用日期:  2022-05-08
  • 刊出日期:  2023-11-15

KRT81在乳腺癌组织中的表达及其调控AKT/mTOR通路影响糖代谢抑制乳腺癌细胞增殖的作用

    通讯作者: 张晖, dajian0629@163.com
    作者简介: 王腾(1988-), 男, 主治医师
  • 蚌埠医学院第一附属医院 肿瘤外科, 安徽 蚌埠 233004
基金项目:  蚌埠医学院自然科学研究重点项目 2020byzd148

摘要: 目的探究KRT81在乳腺癌组织中的表达及其调控AKT/mTOR通路影响糖代谢抑制乳腺癌细胞增殖的作用。方法收集100例乳腺癌病人的病理切片,免疫组织化学检测KRT81在乳腺癌中的表达,分析KRT81表达量与临床病理特征相关性。同时在MCF-7细胞中分别转染过表达质粒、对照质粒、对照敲低质粒、敲低质粒,记作oeKRT81组、NC组、Control组及si-KRT81组。通过集落克隆形成实验检测细胞增殖,流式细胞术检测凋亡细胞,蛋白印迹实验检测AKT/mTOR通路相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的表达。结果免疫组织化学检测结果显示,KRT81蛋白在癌组织中阳性表达明显低于癌旁正常组织(P < 0.01)。KRT81表达水平与Her2、TNM分期、远处转移和组织分级相关(P < 0.05~P < 0.01)。细胞集落克隆形成实验结果显示,oeKRT81组MCF-7细胞集落克隆数明显低于NC组,siKRT81组MCF-7细胞集落克隆数明显高于Control组(P < 0.01)。流式细胞术结果显示,与NC组相比,oeKRT81组MCF-7细胞凋亡率明显增加(P < 0.01);与Control组相比,si-KRT81组MCF-7细胞凋亡率明显减少(P < 0.01)。蛋白印迹实验结果显示,oeKRT81组MCF-7细胞中Bax蛋白水平明显高于NC组,Bcl2、GLUT1、LDH、p-AKT、p-mTOR蛋白水平明显低于NC组(P < 0.01);si-KRT81组Bax蛋白水平明显低于Control组,Bcl2、GLUT1、LDH、p-AKT、p-mTOR蛋白水平明显Control组(P < 0.01)。结论KRT81低表达与乳腺癌的不良预后结局相关,其可能通过抑制AKT/mTOR通路影响糖代谢抑制乳腺癌细胞增殖。

English Abstract

  • 乳腺癌是全球女性最常见的致命癌症[1]。尽管各种治疗方法取得了进展,但乳腺癌仍然是女性肿瘤相关死亡的第二个主要原因[2-3]。辅助治疗、根治性手术和早期诊断可提高乳腺癌病人的生存时间和预后,但死亡率仍不能令人满意[4]。为了制定实用的治疗策略,迫切需要全面了解乳腺癌发病机制中的分子信号传导[5]

    角蛋白是一种在特定区域的表皮细胞中表达的中间丝。大的角蛋白多基因家族由细胞角蛋白组成,它们在各种类型的上皮中差异表达[6-8]。角蛋白81(KRT81)是一种Ⅱ型头发角蛋白,是头发皮质中表达的主要头发蛋白质之一。据报道[9], KRT81表达在黑色素瘤组织中上调,在人黑色素瘤细胞系中也发现了KRT81的过表达,并且KRT81通过调节白细胞介素8(IL-8)来抑制黑素瘤的进展。然而,截至目前KRT81在乳腺癌组织中的表达及对乳腺癌的影响机制尚无报道。因此,本研究分析KRT81在乳腺癌组织中的表达及与临床病理因素的相关性,体外实验观察KRT81调控AKT/mTOR通路影响糖代谢从而干预乳腺癌细胞的增殖,为寻找较为特异的分子标志物提供实验依据。

    • 收集2016-2021年就诊于我院的100例乳腺癌病人的肿瘤和癌旁组织(距离肿瘤>4 cm)的标本。纳入标准:(1)病理学诊断为乳腺癌;(2)术前未放化疗治疗。排除标准:(1)非原发性乳腺癌;(2)失访及预后信息不全者。根据病人信息电话随访,日期至2021年12月。

    • 病人组织经过低温保存固定后,石蜡包埋。并收集相关临床资料,包括年龄、肿瘤大小、雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)、人类表皮生长因子-2(epidermal growth factor-2,Her2)、TNM分期、淋巴结转移、远处转移、组织分级、生存时间和预后结局。肿瘤组织经过两位病理学专家诊断为乳腺癌,免疫组织化学检测KRT81的表达和位置。判定标准:根据染色强度和染色范围判定结果。其中染色强度,根据颜色分为无染色(0分),淡黄色(1分),棕黄色(2分),深棕色(3分);染色范围为0分(0~10%)、1分(>10%~25%)、2分(>25%~50%)、3分(>50%~76%)和4分(>75%~100%)。用染色强度得分和细胞数得分的作为判断表达结果,积分0~4分为阴性,>4~12分为阳性。本研究获得蚌埠医学院第一附属医院研究伦理委员会的批准,并且所有病人知情同意。

    • 乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-231和人乳腺上皮细胞MCF-10A购自中国科学院上海细胞库。使用含10%胎牛血清(FBS)和1%青-链霉素的RPMI 1640培养基培养。细胞在37 ℃、含5% CO2的培养箱中培养。

      KRT81过表达质粒(pcDNA3.1-KRT81-Flag)购自上海吉凯公司,一抗(KRT81、GAPDH、GLUT1、LDH、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、Bax、Bcl2)均购买于Abcam公司,二抗购于武汉三鹰生物科技有限公司,蛋白印迹试剂盒、BCA蛋白浓度测量试剂盒和RIPA裂解液购自碧云天生物技术公司,CCK8购自Biofroxx公司。Transwell购自NEST公司。

    • 取对数生长期细胞,于转染前24 h将细胞以3.0×104个/孔接种于6孔板;转染时按照脂质体LipofectamineTM2000转染试剂说明书,MCF-7细胞分别转染过表达质粒、对照质粒、对照敲低质粒、敲低质粒,记作oeKRT81、NC、Control及si-KRT81组。转染时加入相应试剂并混合均匀,将细胞培养基换为无血清培养基,5%CO2、37 ℃培养箱培养6 h后更换新鲜培养基,然后进行后续实验。实验分组:NC组、oeKRT81组、Control组、si-KRT81组。

    • 取转染的细胞消化离心后,以1 000/孔的密度种植于6孔板中,加入含10% FBS的培养基,随后培养10 d。去上清,加入4%的多聚甲醛固定30 min,加入1∶8稀释的结晶紫染液,染色30 min,PBS冲洗3~4遍,拍照计数。

    • 取处理好的细胞悬浮液,密度为40×104个/毫升,种植于6孔板中,培养24 h后换液,换取不含血清的培养基并按照处理要求转染质粒后培养48 h,采用不含EDTA的胰酶消化,并离心(2 500 r/min),收集细胞用PBS重悬后,继续离心(2 500 r/min),随后按照凋亡试剂盒操作指南依次加入试剂,上机检测。

    • 收集细胞,用RIPA裂解液提取总蛋白裂解物,用于蛋白印迹实验。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。将等量配置好的蛋白质(40 μg)加载到凝胶上,在10%凝胶上电泳分离,然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用TBST洗膜5 min,共3次,用5%脱脂牛奶溶液封闭1 h,然后与一抗孵化,4 ℃孵育过夜。第二天用TBST溶液清洗膜3次,再与二抗在37 ℃下孵育1 h。用TBST溶液清洗膜3次,曝光。

    • 采用χ2检验、t检验、方差分析和q检验。

    • 免疫组织化学检测结果显示,KRT81蛋白在癌组织中阳性表达明显低于癌旁正常组织(P < 0.01)(见表 1图 1)。临床资料结合免疫组织化学结果分析显示,Her2为阳性时KRT81表达升高;TNM分期越大,KRT81的表达越低;当病人有远处转移时,KRT81的表达越低;组织分级越高,KRT81的表达越低,差异均有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01)(见表 2)。

      分组 n KRT81阴性 KRT81阳性 χ2 P
      癌组织 100 70 30 32.00 < 0.01
      癌旁组织 100 30 70

      表 1  KRT81在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达(n)

      图  1  KRT81在乳腺癌组织及癌旁组织中的表达

      特征 n KRT81水平 χ2 P
      年龄/岁
          <60 44 33 11 0.94 >0.05
          ≥60 56 37 19
      肿瘤大小/cm
          ≤2 19 10 9 3.37 >0.05
          >2 81 60 21
      ER
          阴性 60 41 19 0.20 >0.05
          阳性 40 29 11
      PR
          阴性 72 48 24 1.36 >0.05
          阳性 28 22 6
      Her2
          阴性 53 47 6 18.74 < 0.01
          阳性 47 23 24
      TNM分期
          Ⅰ~Ⅱ 51 31 20 4.21 < 0.05
          Ⅲ~Ⅳ 49 39 10
      淋巴结转移
          无 47 35 12 0.84 >0.05
          有 53 35 18
      远处转移
          有 36 33 3 12.57 < 0.01
          无 64 37 27
      组织分级
          G1 24 6 19 35.13 < 0.01
          G2 57 47 10
          G3 19 18 1

      表 2  乳腺癌病人KRT81表达与临床资料的关系(n)

    • 相比于乳腺上皮细胞MCF-10A,KRT81在乳腺癌细胞株中表达下降(P < 0.05)(见表 3图 2A)。采用oeKRT81质粒及si-KRT81质粒转染乳腺癌细胞MCF-7,蛋白印迹实验检测转染效率,结果显示,过表达KRT81后,KRT81蛋白表达升高;敲低KRT81后,KRT81蛋白表达降低(P < 0.05)(见图 2B2C表 4)。MCF-7细胞中KRT81表达水平最低,因此选用其作为后续实验细胞株。

      分组 KRT81蛋白相对表达量 F P MS组内
      MCF-10A细胞 0.86±0.10 20.39 < 0.01 0.010
      MDA-MB-231细胞 0.55±0.11*
      MCF-7细胞 0.34±0.09*#
      q检验:与MCF-10A细胞比较*P < 0.05;与MDA-MB-231细胞比较#P < 0.05

      表 3  KRT81在乳腺癌细胞株中的表达水平比较(ni=3;x±s)

      图  2  KRT81在乳腺癌细胞株中的表达水平及转染效率

      分组 KRT81蛋白相对表达量 F P MS组内
      NC组 0.31±0.06 140.60 < 0.01 0.004
      oeKRT81组 0.96±0.08*
      Control组 0.98 ±0.04*
      si-KRT81组 0.18±0.06*#▲
      q检验:与NC组比较*P < 0.05;与oeKRT81组比较#P < 0.05; 与Control组比较▲P < 0.05

      表 4  KRT81在乳腺癌细胞株中的转染效率(ni=3;x±s)

    • 细胞集落克隆形成实验结果显示,oeKRT81组MCF-7细胞集落克隆数明显低于NC组[(31.0±8.9)个vs(85.0±16.2)个,t=4.78,P < 0.01)];siKRT81组MCF-7细胞集落克隆数明显高于Control组[(241.0±23.1)个vs(113.0±8.6)个,t=8.99,P < 0.01)](见图 3)。

      图  3  KRT81对MCF-7细胞集落克隆形成能力的影响

    • 与NC组相比,oeKRT81组MCF-7细胞凋亡率明显增加(P < 0.01);与Control组相比,si-KRT81组MCF-7细胞凋亡率明显减少(P < 0.01)(见表 5表 6图 4A)。蛋白印迹实验结果显示,oeKRT81组MCF-7细胞中Bax蛋白水平明显高于NC组,si-KRT81组Bax蛋白水平明显低于Control组(P < 0.01);oeKRT81组MCF-7细胞中Bcl2蛋白水平明显低于NC组,si-KRT81组Bcl2蛋白水平明显高于Control组(P < 0.01)(见图 4B图 4C表 5~6)。

      分组 Bax蛋白相对表达量 Bcl2蛋白相对表达量 细胞凋亡率/%
      NC组 0.48±0.14 1.37±0.14 5.38±1.02
      oeKRT81组 1.26±0.03 0.55±0.10 15.06±3.21
      t 9.44 8.43 4.978
      P < 0.01 < 0.01 < 0.01

      表 5  过表达KRT81对MCF-7细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)

      分组 BAX蛋白相对表达量 Bcl2蛋白相对表达量 细胞凋亡率/%
      Control组 0.89±0.10 0.36±0.08 7.12±0.68
      si-KRT81组 0.22±0.09 1.52±0.15 4.11±0.11
      t 8.15 11.56 7.58
      P < 0.01 < 0.01 < 0.01

      表 6  敲低KRT81对MCF-7细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)

      图  4  KRT81对MCF-7细胞凋亡的影响

    • oeKRT81组MCF-7细胞中GLUT1、LDH水平均明显低于NC组(P < 0.01),si-KRT81组GLUT1、LDH水平均明显高于Control组(P < 0.01)(见图 5表 7~8)。

      图  5  KRT81对MCF-7细胞糖代谢相关蛋白表达的影响

      分组 GLUT1 LDH
      Control 0.69±0.12 0.66±0.10
      si-KRT81 1.35±0.10 1.31±0.11
      t 7.48 7.63
      P < 0.01 < 0.01

      表 7  敲低KRT81对MCF-7细胞糖代谢相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)

      分组 GLUT1 LDH
      NC组 1.13±0.21 1.31±0.11
      oeKRT81组 0.31±0.09 0.25±0.19
      t 6.99 9.77
      P < 0.01 < 0.01

      表 8  过表达KRT81对MCF-7细胞糖代谢相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)

    • 蛋白印迹实验结果显示,与NC组比较,oeKRT81组MCF-7细胞中p-AKT、p-mTOR蛋白水平均明显下降(P < 0.01),而AKT、mTOR蛋白水平差异均无统计学意义(P>0.05);与Control组比较,si-KRT81组p-AKT、p-mTOR蛋白水平均明显升高(P < 0.01),而AKT、mTOR蛋白水平差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 9~10图 6)。

      分组 p-AKT p-mTOR
      Control 0.45±0.10 0.46±0.11
      si-KRT81 1.00±0.12 1.13±0.10
      t 6.15 8.38
      P < 0.01 < 0.01

      表 9  敲低KRT81对MCF-7细胞AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)

      分组 p-AKT p-mTOR
      NC组 0.77±0.11 0.89±0.11
      oeKRT81组 0.33±0.10 0.25±0.09
      t 5.27 7.12
      P < 0.01 < 0.01

      表 10  过表达KRT81对MCF-7细胞AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)

      图  6  KRT81对MCF-7细胞AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响

    • 乳腺癌是中国最常见的妇科肿瘤类型[10]。根据全球癌症项目(GLOBOCAN, 2020),2020年全球约有684 996例乳腺癌死亡[11]。尽管努力集中在诊断技术和病人管理上,但在提高乳腺癌病人的总体生存率方面进展甚微[12]。此外,据报道[13],乳腺癌的发病率和死亡率有明显上升的趋势。目前,乳腺癌治疗包括手术在内的综合治疗、放射疗法、化学疗法、内分泌疗法和生物靶向剂[14-15]。随着诊断技术和治疗方法的改进,乳腺癌相关死亡率随着生存率的总体上升而下降。然而,晚期乳腺癌目前几乎无法治愈,治疗的主要目标是姑息治疗,重点是控制疾病的快速进展、提高生活质量和延长生存期[16]。尽管已经开发出多种新的靶向药物来治疗乳腺癌病人;然而,特效药物尚未出现。因此,有必要研究乳腺癌的发生发展机制,寻找新的治疗靶点。本研究细胞集落克隆形成实验结果显示,过表达KRT81可抑制乳腺癌细胞增殖,敲低KRT81促进乳腺癌增殖,提示KRT81的表达水平可影响乳腺癌细胞增殖。流式细胞术细胞凋亡实验及凋亡蛋白表达检测结果显示,过表达KRT81可促进乳腺癌细胞凋亡,敲低KRT81抑制乳腺癌细胞凋亡。

      KRT81是一种Ⅱ型头发角蛋白,是头发皮质中表达的主要头发蛋白质之一。其已经被证实在多种疾病中发挥重要作用[17-18]。然而,其在乳腺癌中的作用尚不清楚。本研究收集了100例乳腺癌病人病例资料,进行免疫组织化学实验,结果显示,乳腺癌组织蜡块和与其相匹配的癌旁正常组织中,KRT81在癌组织中阳性表达明显低于癌旁正常组织。并且KRT81表达水平与Her2、TNM分期、远处转移和组织分级相关。这些结果均提示KRT81对乳腺癌的预后具有影响。

      癌细胞糖代谢的重要性主要体现在能量供应维持其生命活动;生物合成为癌细胞的生长和分裂提供原料;调节信号通路参与调节细胞生长、分化、凋亡等重要生物学过程;免疫逃避逃避免疫系统的攻击。这种代谢重编程的特点是,即使在存在足够氧气的情况下,癌细胞或其他高度增殖的细胞也倾向于将葡萄糖代谢成乳酸,而不是丙酮酸(有氧糖酵解)[19]。糖代谢与肿瘤微环境的变化、癌基因和肿瘤抑制基因的转录、线粒体功能的调节以及糖代谢酶的异常表达密切相关。这种现象为癌细胞提供了生长优势,帮助它们逃避凋亡并促进肿瘤转移[20]。本研究通过蛋白印迹实验检测糖代谢相关蛋白水平,相较于NC组,oeKRT81组MCF-7细胞中GLUT1、LDH蛋白表达均明显下降;然而,相较于Control组,si-KRT81组GLUT1、LDH蛋白表达均明显升高。结果说明改变KRT81的表达水平,可影响细胞糖代谢过程。AKT/mTOR信号通路与乳腺癌进展相关[21-22]。在乳腺癌中,新型锰络合物PdpaMn通过下调Akt/mTOR信号通路抑制糖酵解[23]。本研究中,敲低KRT81可上调Akt/mTOR信号通路的关键蛋白p-AKT和p-mTOR表达,同时,糖代谢相关蛋白GLUT1、LDH的表达量升高;过表达KRT81可抑制Akt/mTOR信号通路的关键蛋白p-AKT和p-mTOR表达,糖代谢相关蛋白GLUT1、LDH的表达量降低。

      综上所述,KRT81在乳腺癌组织中低表达,且与乳腺癌病人的预后相关。同时,KRT81可能通过抑制AKT/mTOR通路影响糖代谢抑制乳腺癌细胞增殖,将为乳腺癌靶向治疗提供基础依据。

参考文献 (23)

目录

    /

    返回文章
    返回