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脐带间充质干细胞无血清培养体系的筛选

肖琼 黄象艳 刘宣 曲伟红

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脐带间充质干细胞无血清培养体系的筛选

    作者简介: 肖琼(1979-), 女, 硕士, 主管技师
    通讯作者: 黄象艳, xiangyan73@aliyun.com
  • 中图分类号: R329.2

Screening of serum-free culture system for umbilical cord mesenchymal stem cells

    Corresponding author: HUANG Xiang-yan, xiangyan73@aliyun.com ;
  • CLC number: R329.2

  • 摘要: 目的筛选培养脐带间充质干细胞的无血清培养基。方法采集新生儿脐带标本,将脐带剪成组织碎块,随机分为A组、B组、C组,分别加入MesenCult、Ultraculture和AM-V 3种不同的无血清培养基进行培养。观察3组脐带原代细胞游出时间和细胞形态,检测细胞的增殖能力、分化能力和表面抗原的表达。结果A组、B组、C组原代细胞从组织块长出的平均时间分别是17 d、6 d、7 d。显微镜下观察可见,从组织块游出的细胞散在分布,呈短梭形或多角形,形态饱满,折光性好,生长融合时A组和B组细胞呈旋涡状生长,细胞折光性好,大小均一,C组细胞细长,折光性稍差,无明显的旋涡状生长的特征。3组均表达CD105、CD90、CD73抗原,不表达CD34、CD45、HLA-DR抗原;3组各标志物的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。3组间充质干细胞均具有向成脂细胞、成骨细胞分化的能力,C组分化能力弱于A组和B组。结论B组培养体系用时较短,干细胞特性保持较好,价格适宜,可以作为大规模培养人间充质干细胞的首选培养基。
  • 图 1  A组原代脐带MSCs形态观察

    图 2  B组原代脐带MSCs形态观察

    图 3  C组原代脐带MSCs形态观察

    图 4  脐带MSCs表面抗原表达率

    图 5  3组脐带MSCs成骨分化染色结果

    图 6  3组脐带MSCs脂肪分化染色结果

    表 1  3组脐带MSCs传代培养OD值比较(x±s)

    分组 n OD值 F P MS组内
    第3天 第5天 第7天
    A组 6 0.36±0.03 0.66±0.10* 0.80±0.02*# 80.50 < 0.01 0.004
    B组 6 0.50±0.01 0.75±0.01*▲ 0.80±0.03*# 422.73 < 0.01 0.000
    C组 6 0.50±0.01 0.76±0.02*▲ 0.78±0.02*# 488.00 < 0.01 0.000
    F 106.91 5.20 1.42
    P < 0.01 < 0.05 >0.05
    MS组内 0.000 0.004 0.001
    q检验: 与第3天比较*P < 0.05;与第5天比较#P < 0.05;与A组比较▲P < 0.05
    下载: 导出CSV

    表 2  3组脐带MSCs表面抗原表达率比较(x±s)

    分组 n CD105/% CD90/% CD73/% CD34/% CD45/% HLA-DR/%
    A组 6 99.67±0.27 99.75±0.39 99.17±1.12 0.32±0.36 0.43±0.63 0.03±0.05
    B组 6 99.73±0.24 99.73±0.38 99.92±0.15 0.17±0.33 0.12±0.11 0.02±0.04
    C组 6 99.7±0.22 99.9±0.06 99.93±0.07 0.12±0.07 0.47±0.40 0.03±0.05
    F 0.09 0.42 2.23 0.80 1.16 0.24
    P >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05
    MS组内 0.060 0.119 0.516 0.081 0.190 0.002
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-08-05
  • 录用日期:  2021-12-18
  • 刊出日期:  2023-11-15

脐带间充质干细胞无血清培养体系的筛选

    通讯作者: 黄象艳, xiangyan73@aliyun.com
    作者简介: 肖琼(1979-), 女, 硕士, 主管技师
  • 中国人民解放军联勤保障部队第九六〇医院 输血科, 山东 济南 250031

摘要: 目的筛选培养脐带间充质干细胞的无血清培养基。方法采集新生儿脐带标本,将脐带剪成组织碎块,随机分为A组、B组、C组,分别加入MesenCult、Ultraculture和AM-V 3种不同的无血清培养基进行培养。观察3组脐带原代细胞游出时间和细胞形态,检测细胞的增殖能力、分化能力和表面抗原的表达。结果A组、B组、C组原代细胞从组织块长出的平均时间分别是17 d、6 d、7 d。显微镜下观察可见,从组织块游出的细胞散在分布,呈短梭形或多角形,形态饱满,折光性好,生长融合时A组和B组细胞呈旋涡状生长,细胞折光性好,大小均一,C组细胞细长,折光性稍差,无明显的旋涡状生长的特征。3组均表达CD105、CD90、CD73抗原,不表达CD34、CD45、HLA-DR抗原;3组各标志物的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。3组间充质干细胞均具有向成脂细胞、成骨细胞分化的能力,C组分化能力弱于A组和B组。结论B组培养体系用时较短,干细胞特性保持较好,价格适宜,可以作为大规模培养人间充质干细胞的首选培养基。

English Abstract

  • 间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是起源于胚胎发育早期中胚层的干细胞,也是机体含量最丰富的干细胞类型,具有支持造血、多向分化、低免疫原性和免疫调节等作用[1],正是因为它的分化能力和再生潜力使其大量应用于干细胞研究和再生医学中,用来治疗一些疑难杂症和组织器官修复或重建、抗衰老以及美容等。

    MSCs属于成体干细胞,可从骨髓、脐带、脐血、胎盘、脂肪等组织中分离,但从这些组织中获取的MSCs的原始数量较少,而临床应用时必须移植足够数量的干细胞才有疗效,所以体外培养扩增MSCs尤为重要,不仅要满足临床需要的数量,还要保证细胞产品的安全性。但目前关于MSCs的培养没有标准的培养体系,常用的MSCs的培养体系分为: 含有胎牛血清的培养基、无胎牛血清培养基。含胎牛血清培养基培养的MSCs应用于临床有一定局限性[2],无血清培养基越来越受到重视。目前,市面上无血清培养基品种多,质量存在较大的差异,导致MSCs的质量不可控,且培养过程中培养基添加物的理化性质对MSCs的生物学特性有一定影响,因而选择合适的培养基是MSCs发挥治疗效应的前提。本研究采用不同的商品化无血清培养基培养脐带MSCs,以筛选建立安全稳定、快速高效且经济的体外扩增培养体系,在满足MSCs数量的同时,又能够维持其分化能力。

    • 选用健康新生儿脐带样本,解放军联勤保障部队九六〇医院妇产科提供,产妇均签署知情同意书,实验获得该医院伦理委员会批准。MSCs无血清培养基(STEMCELL Technologies,TBD,Lonza), 成骨分化诱导培养基、成软骨分化诱导培养基(stemcell), CD105单克隆抗体(Beckman),CD90单克隆抗体、CD73单克隆抗体、CD34单克隆抗体、CD45单克隆抗体(美国BD公司), HLA-DR单克隆抗体(美国eBiosience公司), CCK-8(上海碧云天生物技术),油红O、茜素红(北京索莱宝生物科技)。

    • 无菌条件下剥离脐带外膜,并将脐动脉和静脉去除,用PBS充分冲洗后将其剪碎至约1 mm3大小组织块,再用PBS多次冲洗,将剪碎的脐带组织块随机分为9份接种至9个培养瓶,再将9个培养瓶随机分为A组、B组、C组,每组3瓶。A组、B组、C组分别加MesenCult、Ultraculture、AM-V无血清培养基,置于37 ℃、5% CO2浓度的培养箱中培养,每3~5 d更换培养基1次,并记录细胞爬出的时间,观察细胞的生长状态。待细胞密度达到约80%后移除组织块,进行传代培养。

    • 3组脐带MSCs用0.25%胰蛋白酶消化,培养基重悬计数后,每孔约2×104个细胞接种于7个96孔培养板中,每组设3个复孔,置于37 ℃、5% CO2浓度的培养箱中培养。于24 h后取第一块培养板,每孔避光加入10 μL CCK8溶液,2.5 h后用酶标仪在450 nm波长条件下检测吸光度(OD)值,48 h后取第二块培养板,以此类推,每24 h按以上步骤检测OD值。

    • 3组脐带MSCs,用0.25%胰蛋白酶消化并离心,PBS清洗3遍,用PBS重悬细胞调整密度为1×106个/mL,分别吸取100 μL加入10 mL的流式检测管中,然后加入适量PE和FITC标记的CD105、CD90、CD73、CD34、CD45、HLA-DR的抗体,同时设阴性对照。常温下避光孵育20 min,PBS冲洗2次,每管加入500 μL PBS重悬细胞,用流式细胞仪进行检测。

    • 3组均取第1代至第5代的脐带MSCs,以1×105/mL的密度接种24孔板,每孔接种0.5 mL,于细胞融合度达到60%时去掉原培养基,PBS洗涤2次,分别用成脂诱导培养基和成骨诱导培养基诱导分化,每3~4 d更换培养液1次,前者在诱导培养第14天用油红-O染色,后者在28 d用茜素红染色,倒置显微镜观察拍照。

    • 采用方差分析和q检验。

    • 组织块接种第6~7天,倒置相差显微镜下观察可见B、C组有少量短梭形细胞从组织块边缘游出,散在分布。第10天时已有大量细胞爬出,并呈单层梭型不规则样生长,放射状排列,组织块之间亦可见大量细胞。B组组织块边缘的MSCs于第14天长至融合状态,成旋涡状生长,细胞折光性好,大小均一,而C组细胞细长,折光性稍差,无明显的旋涡状生长的特征。A组在培养第17天时仅见少量短梭形或不规则形细胞从组织块边缘游出,折光性好。培养第28天后组织块边缘的MSCs成旋涡状生长至融合状态。3组原代MSCs形态和融合状态见图 1~3

      图  1  A组原代脐带MSCs形态观察

      图  2  B组原代脐带MSCs形态观察

      图  3  C组原代脐带MSCs形态观察

    • 3组脐带MSCs在传代后第1~2天增殖不明显,为细胞适应期;第3~6天进入对数生长期,之后进入平台期。第3代MSCs OD值显示,培养第3天、第5天,B组和C组OD值均高于A组(P < 0.05);培养第7天,3组OD值差异无统计学意义(P>0.05);每组内细胞和第7天的OD值差异有统计学意义(P < 0.01);各组MSCs培养第5天OD值高于第3天(P < 0.05),培养第7天OD值高于第3天和第5天(P < 0.05)(见表 1)。

      分组 n OD值 F P MS组内
      第3天 第5天 第7天
      A组 6 0.36±0.03 0.66±0.10* 0.80±0.02*# 80.50 < 0.01 0.004
      B组 6 0.50±0.01 0.75±0.01*▲ 0.80±0.03*# 422.73 < 0.01 0.000
      C组 6 0.50±0.01 0.76±0.02*▲ 0.78±0.02*# 488.00 < 0.01 0.000
      F 106.91 5.20 1.42
      P < 0.01 < 0.05 >0.05
      MS组内 0.000 0.004 0.001
      q检验: 与第3天比较*P < 0.05;与第5天比较#P < 0.05;与A组比较▲P < 0.05

      表 1  3组脐带MSCs传代培养OD值比较(x±s)

    • 3组第3代脐带MSCs均表达CD105、CD90和CD73,表达率均在95%以上,CD34、CD45和HLA-DR未表达或弱表达,表达率均在2%以下;3组各标志物的表达差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 2), 图 4为A组MSCs表面抗原表达情况的代表图。

      分组 n CD105/% CD90/% CD73/% CD34/% CD45/% HLA-DR/%
      A组 6 99.67±0.27 99.75±0.39 99.17±1.12 0.32±0.36 0.43±0.63 0.03±0.05
      B组 6 99.73±0.24 99.73±0.38 99.92±0.15 0.17±0.33 0.12±0.11 0.02±0.04
      C组 6 99.7±0.22 99.9±0.06 99.93±0.07 0.12±0.07 0.47±0.40 0.03±0.05
      F 0.09 0.42 2.23 0.80 1.16 0.24
      P >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 >0.05
      MS组内 0.060 0.119 0.516 0.081 0.190 0.002

      表 2  3组脐带MSCs表面抗原表达率比较(x±s)

      图  4  脐带MSCs表面抗原表达率

    • 3组MSCs经成骨诱导体系诱导2周后,细胞基质可见粗糙的颗粒样沉积,诱导4周后进行茜素红染色,可见红色的矿化结节沉积,A、B组钙盐沉淀较C组多(见图 5)。经成脂诱导体系诱导7~10 d后,在光镜下可看见微小明亮的脂肪滴,诱导至14 d,融合的脂肪滴充满整个细胞,油红-O染色呈明亮的橙红色,A、B组脂滴分布较C组密集(见图 6)。

      图  5  3组脐带MSCs成骨分化染色结果

      图  6  3组脐带MSCs脂肪分化染色结果

    • MSCs是近年来细胞治疗和再生医学的研究热点,研究已证实MSCs存在于人体多种组织中,不同组织来源的MSCs均具有相似的生物学特性[3]。特定的环境下,MSCs能够向骨、软骨、脂肪、肌肉、神经等多种组织细胞进行分化,可以作为细胞替代治疗的种子细胞,以替换或再生受损的组织。MSCs治疗缺损性疾病时通过旁分泌作用或细胞分化发挥作用[4-5]。研究[6-9]显示,MSCs对心肌梗死、糖尿病足、脑损伤、脊髓损伤等疾病的修复显示出良好的效果。由于其强大的修复潜力,MSCs应用于不断扩大的临床适应证,特别是骨、软骨和关节损伤的修复,已有研究[10-11]证实MSCs作为组织工程的种子细胞治疗骨和软骨缺损是安全和有效的,治疗骨折后不愈合及骨不连病人已能达到临床愈合的标准[12-13]。在脂肪组织工程领域MSCs也有巨大的研究价值,很多学者将MSCs和自体脂肪共移植用于医学整形和美容,相比于单独的脂肪细胞移植,MSCs和自体脂肪共移植使得移植的脂肪细胞存活率升高,减少了脂肪细胞的液化和重吸收,提高了塑形效果,减少了手术次数,减轻了病人的痛苦。

      随着研究的深入,MSCs产品最终会用于人体治疗多种疾病,因此,必须建立可控的培养体系,确保MSCs产品的安全性、有效性及稳定性。当前,MSCs的培养体系分为: 含胎牛血清的培养基、无胎牛血清的培养基。添加胎牛血清的培养基被认为是体外扩增MSCs最有效的培养基[14],因为胎牛血清中含有许多对细胞生长有利的成分,提供丰富的营养物质,促进细胞生长,另一方面,血清中异种蛋白的免疫原性,潜在的病原体等使其生物安全性受到人们普遍质疑[15],在生产临床级别的人用细胞产品时, 理论上会导致这些病原体的传播。此外,细胞的吞噬作用使牛血清中的蛋白分子细胞内在化,当进行细胞移植时将导致宿主产生免疫反应,限制了脐带MSCs在临床的应用。

      无血清培养基是合成培养基的一种,不含任何动物血清成分,只添加细胞生长所需的营养成分和生长因子的培养基,这种培养基成分均为已知, 因而能够避免异种血清所带来的异源性污染[16],但是不同商品的无血清培养基养份含量不同,则会导致细胞生长效果不同,或蛋白表达不同,有实验数据显示细胞在无血清培养体系中随传代次数递增扩增效率下降,细胞生长缓慢,难以维持干细胞的特性,因而影响治疗功能[17]。因此,选择适合MSCs培养的无血清培养体系,仍是目前工作的重心所在。

      本研究中选用了国内外3种不同的无血清培养基,其中2种为国外干细胞领域知名公司生产的,一种为国内知名企业生产的,3种培养基中未添加其他任何生长因子。采用组织块贴壁法培养脐带MSCs,A组培养基培养原代脐带MSCs时,细胞从组织块游出时间较B组和C组长,而C组从组织块游出的细胞形态不如A组和B组,尤其是融合后未呈现典型的MSCs的形态。3组获得的原代细胞能够连续传代,传代后细胞能够大量增殖。经流式细胞仪检测,3组MSCs在表型方面无显著性差异,不表达造血细胞标志CD34、CD45,表明MSCs是区别于造血细胞的另一种处于未分化状态的非定向干/祖细胞,不表达HLA-DR,说明MSCs的免疫原性低,表达CD105、CD90和CD44, 说明MSCs的干性保持良好。3组MSCs经成骨和成脂肪诱导后,茜素红和油红-O染色均呈阳性,表明无血清培养基扩增后的脐带MSCs具有分化成骨和脂肪细胞的能力。A组和B组染色阳性的细胞多于C组,说明A组和B组细胞分化能力高于C组。这些结果证明3组无血清培养基能够在体外进行脐带MSCs的原代和传代培养,培养的细胞仍能保持其多向分化的潜能。但是三种培养基培养原代细胞时间长短不一,分化能力亦不同,这种差异可能是培养基中的因子种类和浓度导致的。MSCs分化功能和所处的微环境有关,不同的外源基因激活和不同的细胞因子作用,均可导致其向不同的细胞系分化。本研究中的结果提示不同的培养基培养的细胞分化方向和分化能力不同,这为临床细胞治疗提供了思路,因为不同的组织工程应用不同分化的细胞,选择利于向某种细胞分化的培养基能大大提高细胞的分化率,从而提高治疗效果。

      本研究中的3种培养基,培养原代脐带MSCs用时较短的是B组和C组,分化潜能较大的是A组和B组,因此,B组培养基培养脐带MSCs用时短,细胞干性维持好,分化率高,价格适中,在目前阶段可以作为临床级人脐带MSCs培养体系的理想选择。用此培养基培养脐带MSCs的安全性和有效性如何,还需要进一步研究。

参考文献 (17)

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