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lncRNA Zeb1-AS1调控JAK2/STAT3信号通路影响骨关节炎软骨细胞的增殖和凋亡

刘旋 张磊 张凤军

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lncRNA Zeb1-AS1调控JAK2/STAT3信号通路影响骨关节炎软骨细胞的增殖和凋亡

    作者简介: 刘旋(1979-), 男, 主治医师
    通讯作者: 张凤军, off708@163.com
  • 中图分类号: R684

lncRNA Zeb1-AS1 affects the proliferation and apoptosis of osteoarthritis chondrocytes via regulating JAK2/STAT3 signaling pathway

    Corresponding author: ZHANG Feng-jun, off708@163.com
  • CLC number: R684

  • 摘要: 目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)E盒结合锌指蛋白1反义1(Zeb1-AS1)对骨关节炎软骨细胞的增殖和凋亡的影响,并探讨其机制是否与调控蛋白酪氨酸激酶2/信号转导和转录激活因子3(JAK2/STAT3)信号通路有关。方法将骨关节炎软骨细胞分为si-NC组、si-Zeb1-AS1组、si-Zeb1-AS1+JAK2/STAT3信号通路抑制剂(AG490)组。运用细胞计数试剂盒、流式细胞术检测细胞活力和凋亡率。Western blotting分析B细胞淋巴瘤(Bcl-2)、Bcl相关X蛋白(Bax)、p-JAK2和p-STAT3表达水平。结果与si-NC组比较,si-Zeb1-AS1组骨关节炎软骨细胞增殖(48、72 h)、Bcl-2、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达明显升高(P < 0.01),凋亡率、Bax蛋白表达明显降低(P < 0.01)。与si-Zeb1-AS1组比较,si-Zeb1-AS1+AG490组骨关节炎软骨细胞增殖(48、72 h)、Bcl-2、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达明显降低(P < 0.01),凋亡率、Bax蛋白表达明显升高(P < 0.01)。结论干扰lncRNA Zeb1-AS1通过激活JAK2/STAT3信号通路能够促进骨关节炎软骨细胞增殖、抑制细胞凋亡。
  • 图 1  干扰Zeb1-AS1对OA软骨细胞凋亡蛋白表达的影响

    图 2  干扰Zeb1-AS1对OA软骨细胞JAK2/STAT3通路相关蛋白表达的影响

    图 3  JAK2/STAT3通路抑制剂对干扰Zeb1-AS1处理的OA软骨细胞凋亡蛋白表达的影响

    表 1  干扰Zeb1-AS1对OA软骨细胞细胞增殖的影响(ni=3;x±s)

    分组 Zeb1-AS1 OD值
    24 h 48 h 72 h
    si-NC组 0.96±0.04 0.55±0.03 0.67±0.03 0.78±0.04
    si-Zeb1-AS1组 0.18±0.01 0.51±0.03 1.00±0.05 1.49±0.07
    t 32.77 1.63 9.80 15.25
    P < 0.01 >0.05 < 0.01 < 0.01
    下载: 导出CSV

    表 2  干扰Zeb1-AS1对OA软骨细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)

    分组 凋亡率/% Bax Bcl-2
    si-NC组 24.83±0.71 0.79±0.05 0.14±0.01
    si-Zeb1-AS1组 11.43±0.37 0.22±0.02 0.60±0.04
    t 28.99 18.33 19.32
    P < 0.01 < 0.01 < 0.01
    下载: 导出CSV

    表 3  干扰Zeb1-AS1对OA软骨细胞中JAK2/STAT3信号通路的影响(ni=3;x±s)

    分组 p-JAK2 p-STAT3
    si-NC组 0.21±0.01 0.26±0.02
    si-Zeb1-AS1组 0.82±0.05 0.69±0.05
    t 20.72 13.83
    P < 0.01 < 0.01
    下载: 导出CSV

    表 4  JAK2/STAT3信号通路抑制剂逆转干扰Zeb1-AS1对OA软骨细胞增殖的影响(ni=3;x±s)

    分组 OD值
    24 h 48 h 72 h
    si-Zeb1-AS1组 0.50±0.03 1.00±0.05 1.51±0.07
    si-Zeb1-AS1+AG490组 0.54±0.03 0.81±0.04 1.12±0.05
    t 1.63 5.14 7.85
    P >0.05 < 0.01 < 0.01
    下载: 导出CSV

    表 5  JAK2/STAT3信号通路抑制剂对干扰Zeb1-AS1处理的OA软骨细胞凋亡的影响(ni=3;x±s)

    分组 凋亡率/% Bax Bcl-2
    si-Zeb1-AS1组 11.47±0.30 0.21±0.02 0.61±0.04
    si-Zeb1-AS1+AG490组 21.70±0.52 0.57±0.04 0.24±0.02
    t 29.52 13.94 14.33
    P < 0.01 < 0.01 < 0.01
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2021-03-30
  • 录用日期:  2022-05-10
  • 刊出日期:  2023-11-15

lncRNA Zeb1-AS1调控JAK2/STAT3信号通路影响骨关节炎软骨细胞的增殖和凋亡

    通讯作者: 张凤军, off708@163.com
    作者简介: 刘旋(1979-), 男, 主治医师
  • 1. 山东省滨州市第二人民医院 脊柱关节外科, 256800
  • 2. 山东省滨州市第二人民医院 手足外科, 256800

摘要: 目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)E盒结合锌指蛋白1反义1(Zeb1-AS1)对骨关节炎软骨细胞的增殖和凋亡的影响,并探讨其机制是否与调控蛋白酪氨酸激酶2/信号转导和转录激活因子3(JAK2/STAT3)信号通路有关。方法将骨关节炎软骨细胞分为si-NC组、si-Zeb1-AS1组、si-Zeb1-AS1+JAK2/STAT3信号通路抑制剂(AG490)组。运用细胞计数试剂盒、流式细胞术检测细胞活力和凋亡率。Western blotting分析B细胞淋巴瘤(Bcl-2)、Bcl相关X蛋白(Bax)、p-JAK2和p-STAT3表达水平。结果与si-NC组比较,si-Zeb1-AS1组骨关节炎软骨细胞增殖(48、72 h)、Bcl-2、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达明显升高(P < 0.01),凋亡率、Bax蛋白表达明显降低(P < 0.01)。与si-Zeb1-AS1组比较,si-Zeb1-AS1+AG490组骨关节炎软骨细胞增殖(48、72 h)、Bcl-2、p-JAK2和p-STAT3蛋白表达明显降低(P < 0.01),凋亡率、Bax蛋白表达明显升高(P < 0.01)。结论干扰lncRNA Zeb1-AS1通过激活JAK2/STAT3信号通路能够促进骨关节炎软骨细胞增殖、抑制细胞凋亡。

English Abstract

  • 骨关节炎(OA)是常见的关节疾病,以关节软骨退化和骨赘形成为特征,是世界范围内引起成人疼痛、残疾的主要原因[1]。临床主要采用药物、干细胞治疗等手段来减轻疼痛和控制症状,但不能有效阻止疾病进展[2]。多项研究表明,长链非编码RNA(lncRNA)参与细胞增殖、凋亡和分化等病理生理学过程,其表达改变与OA发生有关[3-5]。如OA病人软骨组织中lncRNA母系表达基因3(MEG3)表达降低,过表达MEG3促进软骨细胞增殖,抑制细胞凋亡、软骨基质降解[5]。软骨伤害有关lncRNA(lncRNA-CIR)通过调节自噬促进骨关节炎关节软骨变性[4]。lncRNA E盒结合锌指蛋白1反义1(Zeb1-AS1)已被证实在骨性关节炎软骨细胞中表达上调[4],但lncRNA Zeb1-AS1在OA中的潜在作用机制尚不清楚。最近研究表明蛋白酪氨酸激酶2/信号转导和转录激活因子3(JAK2/STAT3)信号通路与OA软骨退变的病理过程密切相关,姜黄素通过激活JAK2/STAT3信号通路可增加软骨细胞抗氧化应激能力,缓解关节软骨蜕变[6]。丹参可激活JAK2/STAT3途径在体内和体外水平对OA的软骨损伤具有抑制作用[7]。本研究探讨lncRNA Zeb1-AS1对OA软骨细胞增殖和凋亡的影响,及是否与调控JAK2/STAT3信号通路有关。

    • DMEM培养基、胎牛血清、LipofectamineTM2000购于美国Invitrogen公司;Zeb1-AS1小干扰RNA(si-Zeb1-AS1)及其阴性对照(si-NC)购于广州复能基因;JAK2/STAT3信号通路抑制剂AG490、兔抗B细胞淋巴瘤(Bcl-2)抗体、兔抗Bcl相关X蛋白(Bax)抗体、兔抗p-JAK2抗体、兔抗p-STAT3抗体、兔抗磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)抗体购于美国Abcam公司;逆转录试剂盒、SYBR Green Super mix购于美国Bio-rad公司;细胞计数试剂盒(CCK-8)购于日本同仁公司;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)试剂盒购于上海凯基生物。

    • 收集2017年1月至2018年1月我院行膝关节置换手术的5例OA病人的组织标本,年龄52~72岁。参照赵晓燕[8]实验方法分离OA软骨细胞。磷酸盐缓冲液洗涤关节软骨片后,剪碎组织块,加入胰酶在含5%CO2、37 ℃、湿度饱和的培养箱中消化30 min,吸出消化夜后,采用Ⅱ型胶原酶于培养箱震荡消化18 h,每隔8 h收集一次细胞。200目滤网过滤,离心弃去上清液,用含20%胎牛血清的培养液重悬细胞,接种新的培养瓶培养。细胞80%融合时按照1∶2比例进行传代,采用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养,选用第3代对数期细胞进行后续实验。

    • 按照2×105个/孔的密度将对数期OA软骨细胞接种6孔板,当细胞50%融合时按照LipofectamineTM2000使用说明将si-NC、si-Zeb1-AS1分别转染OA软骨细胞,依次记为si-NC组、si-Zeb1-AS1组。转染48 h时收集细胞,RT-qPCR检测Zeb1-AS1表达水平,转染合格后进行后续分析。用AG490处理转染si-Zeb1-AS1细胞48 h,记为si-Zeb1-AS1+ AG490组,随后分析细胞增殖和凋亡情况。

    • Trizol试剂提取各组OA软骨细胞的总RNA,取40 ng进行逆转录反应获得cDNA,利用SYBR Green Super mix进行RT-qPCR反应,2-ΔΔCt法分析Zeb1-AS1相对表达量。ZEB1-AS1上游引物5′-TCC CTG CTA AGC TTC CTT CAG TG T-3′,下游引物5′-GAC AGT GAT CAC TTT CAT ATC C-3′;内参GAPDH上游引物5′-GGA GCG AGA TCC CTC CAA AAT-3′,下游引物5′-GGC TGT TGT CAT ACT TCT CAT GG-3′。

    • 每组取100 μL细胞悬液接种96孔板,培养24、48、72 h时每孔加入10 μL的CCK-8试剂,再培养4 h后,分光光度计检测450 nm处光密度(OD)值。

    • 取500 μL结合缓冲液重悬各组细胞,按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书进行细胞染色,黑暗环境孵育15 min后,流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

    • 裂解各组细胞提取总蛋白,将等量蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移到硝化纤维素膜上。用5%脱脂牛奶封闭莫后,在4℃下用Bax抗体、Bcl-2抗体、p-JAK2抗体、p-STAT3抗体以及GAPDH抗体孵育膜过夜;室温下用二抗孵育膜2 h。用增强的化学发光试剂进行显影,以GAPDH为内参,通过Image J软件分析目的蛋白相对表达量。

    • 采用t检验。

    • 与si-NC组比较,si-Zeb1-AS1组OA软骨细胞Zeb1-AS1表达水平明显降低(P < 0.01),48、72 h OD值均明显升高(P < 0.01)(见表 1)。

      分组 Zeb1-AS1 OD值
      24 h 48 h 72 h
      si-NC组 0.96±0.04 0.55±0.03 0.67±0.03 0.78±0.04
      si-Zeb1-AS1组 0.18±0.01 0.51±0.03 1.00±0.05 1.49±0.07
      t 32.77 1.63 9.80 15.25
      P < 0.01 >0.05 < 0.01 < 0.01

      表 1  干扰Zeb1-AS1对OA软骨细胞细胞增殖的影响(ni=3;x±s)

    • 与si-NC组比较,si-Zeb1-AS1组OA软骨细胞Bax蛋白表达、凋亡率明显降低(P < 0.01),Bcl-2蛋白表达明显升高(P < 0.01)(见表 2图 1)。

      分组 凋亡率/% Bax Bcl-2
      si-NC组 24.83±0.71 0.79±0.05 0.14±0.01
      si-Zeb1-AS1组 11.43±0.37 0.22±0.02 0.60±0.04
      t 28.99 18.33 19.32
      P < 0.01 < 0.01 < 0.01

      表 2  干扰Zeb1-AS1对OA软骨细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响(ni=3;x±s)

      图  1  干扰Zeb1-AS1对OA软骨细胞凋亡蛋白表达的影响

    • 与si-NC组比较,si-Zeb1-AS1组OA软骨细胞p-JAK2和p-STAT3表达水平明显升高(P < 0.01)(见表 3图 2)。

      分组 p-JAK2 p-STAT3
      si-NC组 0.21±0.01 0.26±0.02
      si-Zeb1-AS1组 0.82±0.05 0.69±0.05
      t 20.72 13.83
      P < 0.01 < 0.01

      表 3  干扰Zeb1-AS1对OA软骨细胞中JAK2/STAT3信号通路的影响(ni=3;x±s)

      图  2  干扰Zeb1-AS1对OA软骨细胞JAK2/STAT3通路相关蛋白表达的影响

    • 与si-Zeb1-AS1组比较,si-Zeb1-AS1+AG490组OA软骨细胞48、72 h OD值明显降低(P < 0.01)(见表 4)。

      分组 OD值
      24 h 48 h 72 h
      si-Zeb1-AS1组 0.50±0.03 1.00±0.05 1.51±0.07
      si-Zeb1-AS1+AG490组 0.54±0.03 0.81±0.04 1.12±0.05
      t 1.63 5.14 7.85
      P >0.05 < 0.01 < 0.01

      表 4  JAK2/STAT3信号通路抑制剂逆转干扰Zeb1-AS1对OA软骨细胞增殖的影响(ni=3;x±s)

    • 与si-Zeb1-AS1组比较,si-Zeb1-AS1+AG490组OA软骨细胞Bax蛋白表达、凋亡率明显升高(P < 0.01),Bcl-2蛋白表达明显降低(P < 0.01)(见表 5图 3)。

      分组 凋亡率/% Bax Bcl-2
      si-Zeb1-AS1组 11.47±0.30 0.21±0.02 0.61±0.04
      si-Zeb1-AS1+AG490组 21.70±0.52 0.57±0.04 0.24±0.02
      t 29.52 13.94 14.33
      P < 0.01 < 0.01 < 0.01

      表 5  JAK2/STAT3信号通路抑制剂对干扰Zeb1-AS1处理的OA软骨细胞凋亡的影响(ni=3;x±s)

      图  3  JAK2/STAT3通路抑制剂对干扰Zeb1-AS1处理的OA软骨细胞凋亡蛋白表达的影响

    • OA是关节软骨的退行性疾病,其主要病理特征是软骨破坏。由于OA进展分子机制并未完全阐明,目前OA仍缺乏有效的治疗策略。近年来,lncRNA人类疾病中进展中的作用引起人们重视,多项研究证实lncRNA具有疾病诊断标志物和治疗靶点潜力。目前,包括PART-1[9]、X染色体失活特异转录物(XIST)[10]、浆细胞瘤变异易位1(PVT1)[11]在内的多种lncRNA均被证实参与OA进展。Zeb1-AS1是一种致癌lncRNA,其高表达与肿瘤分化程度、浸润深度、临床分期、器官转移、淋巴结转移呈正相关,具有癌症预后标志物作用[12]。干扰Zeb1-AS1表达显著降低食管癌细胞的增殖和侵袭能力,抑制裸鼠异种移植瘤形成[13]。此外,干扰Zeb1-AS1还可抑制上皮—间质转化抑制肺纤维化[14]。本研究探讨其在OA进展中作用显示,转染si-Zeb1-AS1干扰Zeb1-AS1表达可显著提高OA软骨细胞活力,抑制细胞凋亡。众所周知,Bcl-2家族在软骨细胞的存活和凋亡中发挥重要作用,促凋亡蛋白Bax通过激活半胱天冬酶9(Caspase9)途径诱导细胞凋亡,而抗凋亡蛋白Bcl-2通过阻止Bax移位和构象改变具有相反作用[15]。研究显示,OA软骨组织中Bcl-2表达水平降低,杜仲苷通过调控Bcl-2、Bax等关键介质抑制软骨细胞发凋亡对关节软骨具有保护作用[16]。本研究显示,干扰Zeb1-AS1表达显著抑制Bax蛋白表达,促进Bcl-2表达,与其抗凋亡作用一致。提示,Zeb1-AS1通过调控软骨细胞增殖和凋亡在OA进展中具有重要作用。

      JAK2/STAT3途径已被证实与OA的多个病理过程有关。如染料木素通过激活JAK2/STAT3信号通路可抑制OA炎症反应,抑制软骨细胞凋亡,缓解关节软骨退变,进而抑制OA进展[17]。抑制miR-375可提高软骨细胞抗氧化能力,维持细胞外基质代谢稳态,其机制也与激活JAK2/STAT3途径有关[18]。本研究中,干扰si-Zeb1-AS1表达显著提高OA软骨细胞中JAK2和STAT3的磷酸化水平,提示干扰si-Zeb1-AS1表达可能提高激活JAK2/STAT3途径进而在OA中发挥保护作用。进一步研究显示,采用AG490抑制JAK2/STAT3信号通路显著逆转干扰si-Zeb1-AS1表达对OA软骨细胞的促增殖和抗凋亡作用,恢复OA软骨细胞的增殖能力和凋亡水平,这进一步说明JAK2/STAT3途径介导Zeb1-AS1在OA进展中的作用。

      综上所述,干扰lncRNA Zeb1-AS1通过激活JAK2/STAT3信号通路能够促进OA软骨细胞增殖、抑制细胞凋亡,进而抑制OA进展。因此,lncRNA Zeb1-AS1有望成为OA治疗的有效靶点。

参考文献 (18)

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