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Volume 44 Issue 12
Dec.  2019
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Effect of coptisine on endoplasmic reticulum stress in human umbilical vein endothelial cells

  • Corresponding author: CHEN Feng-ling, cfl1993@126.com
  • Received Date: 2019-04-11
    Accepted Date: 2019-10-28
  • Objective To endoplasmic reticulum stress cell model of human umbilical vein endothelial cells(HUVECs), to estoblish observe the effects of coptisine on the growth activity of HUVECs cells, and expression levels of CHOP and GRP78 gene and protein.Methods HUVECs were induced by tunicamycin(TM) at a concentration of 10 μg/mL for 18 h, and then treated with coptisine at different concentrations for 24 h.The CCK8 was used to detect the effects of different concentrations of coptisine on the activity of HUVECs and activity of HUVECs induced by TM.The mRNA expression levels of CHOP and GRP78 in each group were detected using RT-PCR.The protein expression levels of CHOP and GRP78 in each group were detected using Western blotting and cellular immunofluorescence.>Results With the concentration of coptisine increasing, the coptisine in the range of 1-20 μmol/L had no effect on the activity of HUVECs.After 24 hours, the concentration of coptisine in the range of 20 μmol/L played a protective effect on the activity of HUVECs induced by TM(P < 0.01).The mRNA expression levels of CHOP and GRP78 in HUVECS increased after 18 hours of TM induction(P < 0.01), after 24 hours of continuous induction with coptisine, it was found that coptisine could inhibit the mRNA expressions of CHOP and GRP78 in TM-induced HUVECs(P < 0.01).The protein expression levels of CHOP and GRP78 in HUVECs increased after 18 hours of TM induction(P < 0.01), and after 24 hours of continuous induction with coptisine, it was found that coptisine could inhibit the protein expression levels of CHOP and GRP78 in TM-induced HUVECs(P < 0.01).The results of cellular immunofluorescence staining were similar to those of Western blotting.Conclusions Coptisine can alleviate the excessive ER stress induced by TM in HUVECs, and improve the activity of damaged cells.Coptisine can improve the excessive ER stress response of HUVECs by down-regulating the expressions of CHOP and GRP78.
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通讯作者: 陈斌, bchen63@163.com
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    沈阳化工大学材料科学与工程学院 沈阳 110142

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Effect of coptisine on endoplasmic reticulum stress in human umbilical vein endothelial cells

    Corresponding author: CHEN Feng-ling, cfl1993@126.com
  • 1. School of Graduate, Bengbu Medical College, Bengbu Anhui 233030
  • 2. Department of Endocrinology, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200001, China

Abstract: Objective To endoplasmic reticulum stress cell model of human umbilical vein endothelial cells(HUVECs), to estoblish observe the effects of coptisine on the growth activity of HUVECs cells, and expression levels of CHOP and GRP78 gene and protein.Methods HUVECs were induced by tunicamycin(TM) at a concentration of 10 μg/mL for 18 h, and then treated with coptisine at different concentrations for 24 h.The CCK8 was used to detect the effects of different concentrations of coptisine on the activity of HUVECs and activity of HUVECs induced by TM.The mRNA expression levels of CHOP and GRP78 in each group were detected using RT-PCR.The protein expression levels of CHOP and GRP78 in each group were detected using Western blotting and cellular immunofluorescence.>Results With the concentration of coptisine increasing, the coptisine in the range of 1-20 μmol/L had no effect on the activity of HUVECs.After 24 hours, the concentration of coptisine in the range of 20 μmol/L played a protective effect on the activity of HUVECs induced by TM(P < 0.01).The mRNA expression levels of CHOP and GRP78 in HUVECS increased after 18 hours of TM induction(P < 0.01), after 24 hours of continuous induction with coptisine, it was found that coptisine could inhibit the mRNA expressions of CHOP and GRP78 in TM-induced HUVECs(P < 0.01).The protein expression levels of CHOP and GRP78 in HUVECs increased after 18 hours of TM induction(P < 0.01), and after 24 hours of continuous induction with coptisine, it was found that coptisine could inhibit the protein expression levels of CHOP and GRP78 in TM-induced HUVECs(P < 0.01).The results of cellular immunofluorescence staining were similar to those of Western blotting.Conclusions Coptisine can alleviate the excessive ER stress induced by TM in HUVECs, and improve the activity of damaged cells.Coptisine can improve the excessive ER stress response of HUVECs by down-regulating the expressions of CHOP and GRP78.

  • 动脉粥样硬化是导致心血管疾病的主要原因之一,涉及代谢紊乱、遗传易感性、环境、细胞功能紊乱等多因素的慢性炎症。大动脉脂质沉积、发生纤维化以及巨噬细胞源性泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化的主要病理特点[1]。其中血管壁内皮细胞下的脂质沉积发生内质网应激(ERS)也是导致动脉粥样硬化发生的重要因素之一[2]。内质网(ER)广泛存在于真核细胞当中,是细胞内信号转导的重要调节位点,在蛋白质的成熟、正确折叠、维持钙离子稳态等方面起着重要的作用[3]。遗传或者环境损伤会引起的细胞内钙稳态失衡、氧化应激、营养缺乏、蛋白质的异常累积和蛋白质的错误折叠等均会造成ER功能的破坏,从而诱发ERS。ERS持续时间过久或者程度过强,则最终引起细胞的凋亡与死亡[4]。黄连碱是传统中药黄连的有效成分之一,具有调节血脂[5]、抗缺血再灌注损伤[6]、抑制血管平滑肌增殖[7]、抗粥样动脉硬化[6]等药理作用,有广泛的临床研究价值。研究[8]表明黄连碱可以通过降低低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)等抑制粥样动脉硬化,但未见其在ERS方面的相关研究,本文就黄连碱对HUVECs的作用进行探讨。

1.   材料与方法
  • HUVECs来源于上海交通大学医学院附属第九人民医院中心实验室;DMEM培养基、胎牛血清、胰酶、PBS溶液均购于Gibco公司;CCK8试剂盒、黄连碱购于MCE公司;衣霉素(TM)、二甲基亚砜购于美国Sigma公司;Trizol购于美国赛默飞公司。

  • HUVECs培养于10 mL含有10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养液的10 cm培养皿中,将培养皿置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。当细胞生长融合至80%时,加入0.25%的胰酶进行消化,离心后,按1: 3的比例进行传代培养。

  • 在使用浓度为10 μg/mL的TM诱导HUVECs18 h后,加入不同浓度的黄连碱再处理24 h。分为4组:(1)对照组(不加药物);(2)TM诱导组;(3)TM+不同浓度黄连碱组;(4)不同浓度黄连碱组。

  • 取对数生长期的HUVECs,按每孔5 000个铺种于96孔板中,每孔加入100 μL培养液。待细胞生长至80%时,将培养液吸出,用PBS溶液清洗3遍,加入100 μL无血清培养液培养24 h,之后再将其吸出,加入含有TM的无血清培养液100 μL诱导18 h后,再次将其吸出,最后加入含有不同浓度的黄连碱无血清培养液继续培养24 h,对照组加入相应体积的DMSO溶液。在培养结束前4 h,加入10 μL的CCK8试剂,再放入培养箱中,继续培养4 h。最后将96孔板置于酶标仪中检测每孔450 nm处的吸光度。细胞活性用450 nm处的吸光度表示。

  • 取对数生长期的HUVECs,按每孔1×105个铺种于6孔板中,每孔加入2 mL培养液,待细胞生长至80%时,按照上述方法进行给药。吸出培养液后,加入PBS溶液清洗3次,再向每孔加入1 mL Trizol试剂,按照试剂盒说明进行RNA的提取。最后在核酸定量仪中测量其浓度,按照反转录试剂盒说明,将RNA最终反转录为1 μg cDNA进行后续实验。按照荧光定量PCR的要求配置总管,每个3个复孔。每孔包含5μL Mix、2μL DEPC水、1 μL cDNA、1 μL引物正义链、1 μLcDNA引物反义链。CHOP上游引物为:5′-AAG ACC AGC AGA GGC ATA AGG-3′,下游引物为:5′-TGT AGG GGT CAA AGC ACG AG -3′,产物长度为106 bp;GRP78上游引物为:5′-AAG GAG ATG CTG GTC CTC CA-3′,下游引物为:5′-GAG TCC ATT GCG TCC AGG AT-3’,产物长度为186 bp;GAPDH上游引物为:5′-CGA GAT CCC TCC AAA ATC AA-3′,下游引物为:5′- GTC TTC TGG GTG GCA GTG AT -3′,产物长度为168 bp。

  • 取对数生长期的HUVECs,按每孔1×105个铺种于6孔板中,每孔加入2 mL培养液,待细胞生长至80%时,按照上述方法进行给药。吸出培养液后,加入PBS溶液清洗3次,再向每孔加入200 μL蛋白裂解液,按照试剂盒说明进行细胞总蛋白的提取,再根据BCA法对蛋白进行定量。取20 μg蛋白与5 μL上样缓冲液进行混匀,再放在95~100 ℃的金属浴中加热5 min后,开始电泳,80 V,30 min,120 V 40 min后再进行根据蛋白大小进行转膜,结束后将PVDF膜泡在5%BSA中封闭2 h,一抗(CHOP、GRP78均购买于美国赛默飞公司,按1: 1 000比例稀释)4 ℃孵育过夜,次日用TBST溶液洗3次,每次10 min,二抗(GAPDH购买于美国赛默飞公司,按1: 2 000稀释)室温孵育2 h,TBST溶液洗3次,每次10 min。ECL发光液孵育1 min后,放入扫膜机器中扫膜,最后利用imagej软件进行灰度值分析。

  • 首先在24孔板中放置爬片,然后取对数生长期的HUVECs,按每孔4×104个铺种于24孔板中,每孔加入1 mL培养液,待细胞生长至80%时,按照1.3所述方法进行给药。吸出培养液后,加入PBS溶液清洗3次,加入4%多聚甲醛室温固定30 min;吸去4%多聚甲醛,加入PBS溶液清洗3次;加入封闭液,室温封闭1 h;加入一抗(按1: 200稀释),4 ℃过夜;次日,回收一抗,加入PBS溶液清洗3次;再加入荧光二抗(购买于美国赛默飞公司,按1: 400稀释),4 ℃孵育1 h;回收抗体,加入PBS溶液清洗3次,加入DAPI进行封片。最后置于荧光显微镜下观察拍照,随机选取3个高倍镜视野计算阳性表达的细胞占总细胞数的百分比。

  • 采用方差分析和q检验。

2.   结果
  • 浓度在1~20 μmol/L范围内的黄连碱干预24 h,HUVECs的活性差异无统计学意义(P>0.05),而>25 μmol/L显著降低HUVECs的活性(P < 0.01)(后续实验黄连碱的浓度均采用20 μmol/L)(见表 1)。浓度为20 μmol/L黄连碱作用24 h后,对TM诱导的HUVECs活性具有保护作用(见表 2)。

    浓度/(μmol/L) n 细胞存活率/% F P MS组内
    0 4 99.97±2.07
    10 4 98.78±1.87
    20 4 98.23±0.87 168.87 < 0.01 5.500
    25 4 80.72±3.82**##▲▲
    30 4 65.34±2.09**##▲▲■■
        q检验:与0 μmol/L组比较**P < 0.01;与10 μmol/L组比较##P < 0.01;与20 μmol/L组比较▲▲P < 0.01;与25 μmol/L组比较■■P < 0.01
    分组 n 细胞存活率/% F P MS组内
    对照组 3 99.98±0.34
    TM 3 64.33±1.77** 607.33 < 0.01 1.433
    TM+Cop 3 82.57±1.34**##
    Cop 3 99.99±0.83##▲▲
        q检验:与对照组比较**P<0.01;与TM组比较##P < 0.01;与TM+Cop组比较▲▲P < 0.01
  • 加入TM诱导18 h后,HUVECs中CHOP、GRP78 mRNA水平表达较对照组相比明显升高(P < 0.01)(见表 34),表明HUVECsERS模型构建成功。Wesrern blotting结果与RT-PCR结果相符合,相同处理条件下,TM可以显著升高HUVECs中CHOP、GRP78蛋白表达水平(P < 0.01)(见表 56)。另外通过细胞免疫荧光检测,结果与Wesrern blotting结果相一致(P < 0.01)(见表 78)。

    分组 n 相对表达量 F P MS组内
    对照组 3 1.02±0.12
    TM 3 1.63±0.01** 55.55 < 0.01 0.005
    TM+Cop 3 1.15±0.03##
    Cop 3 0.99±0.06##
        q检验:与对照组比较**P<0.01;与TM组比较##P<0.01,##P < 0.01
    分组 n 相对表达量 F P MS组内
    对照组 3 1.05±0.07
    TM 3 1.59±0.04** 84.35 < 0.01 0.004
    TM+Cop 3 1.25±0.04##
    Cop 3 0.79±0.09*## ▲▲
           q检验:与对照组比较*P<0.05,**P<0.01;与TM组比较##P < 0.01;与TM+Cop组比较▲▲P < 0.01
    分组 n 相对表达量 F P MS组内
    对照组 3 0.45±0.017
    TM 3 1.04±0.033** 174.18 < 0.01 0.001
    TM+Cop 3 0.48±0.013##
    Cop 3 0.55±0.061##
           q检验:与对照组比较**P < 0.01;与TM组比较##P < 0.01
    分组 n 相对表达量 F P MS组内
    对照组 3 0.45±0.015
    TM 3 0.65±0.018** 101.99 < 0.01 0.001
    TM+Cop 3 0.56±0.016**##
    Cop 3 0.49±0.010##▲
           q检验:与对照组比较**P < 0.01;与TM组比较##P < 0.01;与TM+Cop组比较▲P < 0.05
    分组 n 阳性率/% F P MS组内
    对照组 3 39.92±1.20
    TM 3 71.85±1.11** 190.18 < 0.01 3.496
    TM+Cop 3 42.15±1.50##
    Cop 3 45.06±3.01##
           q检验:与对照组比较**P < 0.01;与TM组比较##P < 0.01
    分组 n 阳性率/% F P MS组内
    对照组 3 24.55±3.26
    TM 3 68.41±2.31** 187.89 < 0.01 6.626
    TM+Cop 3 28.99±1.46##
    Cop 3 30.37±2.90##
           q检验:与对照组比较**P < 0.01;与TM组比较##P < 0.01
  • 加入TM诱导18 h,再加入黄连碱继续诱导24 h后,发现黄连碱可以显著抑制TM所诱导的HUVECs中CHOP、GRP78 mRNA水平的表达增高(P < 0.01)(见表 34)。

    Wesrern blotting和细胞免疫荧光结果与RT-PCR结果相吻合,黄连碱可以抑制TM所诱导的HUVECs中CHOP、GRP78蛋白水平表达的升高(P < 0.01)(见表 5~8)。

3.   讨论
  • 本研究证明了黄连碱在体外对TM诱导的HUVECs的ERS反应具有调节和保护的作用,黄连碱通过抑制HUVEC细胞的ERS反应在内皮细胞保护中发挥重要作用。

    ER是真核细胞的主要细胞器,在蛋白的合成、折叠和成熟过程中起着关键作用,并储存着细胞内大部分的Ca2+[9-10]。然而,各种各样的病理因素,如葡萄糖缺乏、氧化应激、钙稳态的破坏以及病毒和细菌的感染,都可能导致新合成的肽链发生错误折叠,这种情况称为ERS[11]。新出现的证据表明血浆Hcy水平升高被认为是ER应力诱导因子的一个独立危险因素。

    本研究发现,TM可以激活ERS通路这与之前报道相同[12],并以剂量依赖的方式诱导HUVECs功能障碍。之前的研究表明ER压力与不同的疾病有关,包括癌症、2型糖尿病和肥胖症[9-10, 13]。重要的是,即使不是全部,至少也是大部分的病理是否与血管病变有关,如扭曲的血管生成或内皮功能障碍[14-15]。ER应激通过影响上皮细胞生理,导致糖尿病血管功能障碍视网膜病变、癌症、肥胖、动脉粥样硬化和缺血。内皮细胞ERS和UPR通路的慢性激活导致氧化应激和炎症反应的增加,并常常导致细胞死亡。由于内皮细胞在维持血管稳态中起着关键作用,各种干扰血管稳态的病理状态,包括同型半胱氨酸血症、高脂血症、高血糖、胰岛素抵抗、血流紊乱和氧化应激均可导致血管内皮功能障碍部分通过激活ER应激[16]。我们的研究结果进一步证实衣霉素(TM)诱导后可以导致HUVECs发生ERS反应。

    GRP78又称为免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein,Bip),是ER中的分子伴侣,也是细胞产生ERS的重要标志性蛋白。ER转导URP信号通过ER膜的蛋白主要有3种:转录激活因子6(activating transcription 6,ATF6)、肌醇需求酶1(inositolrequiringenzyme 1,IRE1)、蛋白激酶样ER激酶(protein kinase-1ike ER kinase,PERK)。在非ERS状态时,以上3种蛋白均与GRP78相结合,形成复合物,从而抑制它们的活性。在ERS状态时,错误折叠的蛋白结构在ER腔内的堆积可致三种蛋白与GRP78解离而激活,进而诱导UPR,从而发生ERS反应。持续时间过长或较强的ERS还会引起细胞的凋亡,激活相关的细胞凋亡通路,如IRE1α/TRAF2/ASK1通路、PERK/Eif2α/CHOP等通路[16]

    CHOP是一种细胞应激的相关蛋白,也是ERS过程中的重要中间信号。CHOP表达水平的增加是ERS的标志,也是细胞凋亡的启动信号。PERK、ATF6和IRE1这3种蛋白均都能诱导激活CHOP,使细胞内的信号向促细胞凋亡转换,引起细胞损伤。在非ERS的情况下,细胞内的CHOP几乎不表达或呈低水平表达;在细胞发生ERS时,CHOP表达水平升高,促进细胞的凋亡。故CHOP表达量的增加也是ERS引起细胞凋亡的重要原因[11]

    在本实验研究中,我们利用ERS的经典诱导剂TM对HUVEC细胞进行诱导,建立起血管内皮细胞ERS模型。TM是一种蛋白质N-糖链抑制剂,它主要通过干扰细胞内蛋白质N-链的糖基化,阻碍新合成的蛋白质结构的糖基化修饰,使蛋白质的合成与修饰发生异常,大量的异常折叠的蛋白结构积聚从而发生ERS。在细胞活性对比实验中,与对照组相比较,经过TM诱导后的TM组、TM+黄连碱组的细胞活力显著下降;与TM组相比较,TM+黄连碱组的细胞活力显著提高,说明黄连碱对HUVEC有保护作用,有效降低TM对HUVEC造成的损伤,从而保护HUVEC。细胞免疫荧光实验结果表明,与对照组相比较,经TM诱导后,HUVEC的GRP78及CHOP蛋白荧光强度均显著增强,说明细胞产生了强烈的ERS反应。与TM组相比,TM+黄连碱组的GRP78及CHOP蛋白荧光强度均显著减弱,说明黄连碱同时抑制了GRP78及CHOP的蛋白表达。RT-PCR及Western blooting的结果显示,与对照组相比较,TM组GRP78及CHOP蛋白表达及mRNA相对表达量均升高;与TM组相比较,TM+黄连碱组的GRP78 mRNA相对表达量均降低。在RT-PCR实验中表现出对GRP78、CHOP mRNA的相对表达量有下调作用,但差异无统计学意义。

    我们的结果表明,衣霉素具有损伤HUVECs的作用, 但黄连碱能抑制衣霉素诱导的内皮细胞损伤。其机制可能与黄连碱的具有改善ERS的作用有关。这些结果表明,黄连碱可能有助于预防动脉粥样硬化和心血管疾病。

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