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动脉粥样硬化是导致心血管疾病的主要原因之一,涉及代谢紊乱、遗传易感性、环境、细胞功能紊乱等多因素的慢性炎症。大动脉脂质沉积、发生纤维化以及巨噬细胞源性泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化的主要病理特点[1]。其中血管壁内皮细胞下的脂质沉积发生内质网应激(ERS)也是导致动脉粥样硬化发生的重要因素之一[2]。内质网(ER)广泛存在于真核细胞当中,是细胞内信号转导的重要调节位点,在蛋白质的成熟、正确折叠、维持钙离子稳态等方面起着重要的作用[3]。遗传或者环境损伤会引起的细胞内钙稳态失衡、氧化应激、营养缺乏、蛋白质的异常累积和蛋白质的错误折叠等均会造成ER功能的破坏,从而诱发ERS。ERS持续时间过久或者程度过强,则最终引起细胞的凋亡与死亡[4]。黄连碱是传统中药黄连的有效成分之一,具有调节血脂[5]、抗缺血再灌注损伤[6]、抑制血管平滑肌增殖[7]、抗粥样动脉硬化[6]等药理作用,有广泛的临床研究价值。研究[8]表明黄连碱可以通过降低低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)等抑制粥样动脉硬化,但未见其在ERS方面的相关研究,本文就黄连碱对HUVECs的作用进行探讨。
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浓度在1~20 μmol/L范围内的黄连碱干预24 h,HUVECs的活性差异无统计学意义(P>0.05),而>25 μmol/L显著降低HUVECs的活性(P < 0.01)(后续实验黄连碱的浓度均采用20 μmol/L)(见表 1)。浓度为20 μmol/L黄连碱作用24 h后,对TM诱导的HUVECs活性具有保护作用(见表 2)。
浓度/(μmol/L) n 细胞存活率/% F P MS组内 0 4 99.97±2.07 10 4 98.78±1.87 20 4 98.23±0.87 168.87 < 0.01 5.500 25 4 80.72±3.82**##▲▲ 30 4 65.34±2.09**##▲▲■■ q检验:与0 μmol/L组比较**P < 0.01;与10 μmol/L组比较##P < 0.01;与20 μmol/L组比较▲▲P < 0.01;与25 μmol/L组比较■■P < 0.01 分组 n 细胞存活率/% F P MS组内 对照组 3 99.98±0.34 TM 3 64.33±1.77** 607.33 < 0.01 1.433 TM+Cop 3 82.57±1.34**## Cop 3 99.99±0.83##▲▲ q检验:与对照组比较**P<0.01;与TM组比较##P < 0.01;与TM+Cop组比较▲▲P < 0.01 -
加入TM诱导18 h后,HUVECs中CHOP、GRP78 mRNA水平表达较对照组相比明显升高(P < 0.01)(见表 3、4),表明HUVECsERS模型构建成功。Wesrern blotting结果与RT-PCR结果相符合,相同处理条件下,TM可以显著升高HUVECs中CHOP、GRP78蛋白表达水平(P < 0.01)(见表 5、6)。另外通过细胞免疫荧光检测,结果与Wesrern blotting结果相一致(P < 0.01)(见表 7、8)。
分组 n 相对表达量 F P MS组内 对照组 3 1.02±0.12 TM 3 1.63±0.01** 55.55 < 0.01 0.005 TM+Cop 3 1.15±0.03## Cop 3 0.99±0.06## q检验:与对照组比较**P<0.01;与TM组比较##P<0.01,##P < 0.01 分组 n 相对表达量 F P MS组内 对照组 3 1.05±0.07 TM 3 1.59±0.04** 84.35 < 0.01 0.004 TM+Cop 3 1.25±0.04## Cop 3 0.79±0.09*## ▲▲ q检验:与对照组比较*P<0.05,**P<0.01;与TM组比较##P < 0.01;与TM+Cop组比较▲▲P < 0.01 分组 n 相对表达量 F P MS组内 对照组 3 0.45±0.017 TM 3 1.04±0.033** 174.18 < 0.01 0.001 TM+Cop 3 0.48±0.013## Cop 3 0.55±0.061## q检验:与对照组比较**P < 0.01;与TM组比较##P < 0.01 分组 n 相对表达量 F P MS组内 对照组 3 0.45±0.015 TM 3 0.65±0.018** 101.99 < 0.01 0.001 TM+Cop 3 0.56±0.016**## Cop 3 0.49±0.010##▲ q检验:与对照组比较**P < 0.01;与TM组比较##P < 0.01;与TM+Cop组比较▲P < 0.05 分组 n 阳性率/% F P MS组内 对照组 3 39.92±1.20 TM 3 71.85±1.11** 190.18 < 0.01 3.496 TM+Cop 3 42.15±1.50## Cop 3 45.06±3.01## q检验:与对照组比较**P < 0.01;与TM组比较##P < 0.01 分组 n 阳性率/% F P MS组内 对照组 3 24.55±3.26 TM 3 68.41±2.31** 187.89 < 0.01 6.626 TM+Cop 3 28.99±1.46## Cop 3 30.37±2.90## q检验:与对照组比较**P < 0.01;与TM组比较##P < 0.01 -
加入TM诱导18 h,再加入黄连碱继续诱导24 h后,发现黄连碱可以显著抑制TM所诱导的HUVECs中CHOP、GRP78 mRNA水平的表达增高(P < 0.01)(见表 3、4)。
Wesrern blotting和细胞免疫荧光结果与RT-PCR结果相吻合,黄连碱可以抑制TM所诱导的HUVECs中CHOP、GRP78蛋白水平表达的升高(P < 0.01)(见表 5~8)。