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宫颈癌是一种发生率较高的妇科恶性肿瘤疾病[1],新辅助化疗(neoadjuvant chemotherapy, NACT)则是在实施外科手术切除或放疗前进行的适当疗程化疗,可明显提高后续外科手术切除或放疗的治疗效果[2]。虽然NACT治疗宫颈癌病人疗效显著,但病人死亡率仍较高,分析原因可能与部分病人化疗敏感性差有一定关系[3]。因此在宫颈癌病人实施NACT治疗前应准确筛查出这部分病人,有助于医务人员制定个体化的治疗方案,但目前尚缺乏有效的预测性指标[4]。骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种机体内广泛存在的糖蛋白分子,在细胞早期免疫应答反应、恶性肿瘤细胞远处转移等起着关键性作用。有研究[5]发现,OPN表达与肺癌、恶性胶质瘤周围组织侵袭、远处转移现象及放化疗敏感性之间存在密切的联系,OPN表达水平较高的病人出现放化疗抵抗现象的概率更高。环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)则是一种限速酶,其具有促进肿瘤新生血管组织形成、调控细胞增殖凋亡现象、增强肿瘤细胞侵袭和迁移等多种生物学功能,在肿瘤发生及周围组织侵袭、远处脏器组织转移过程中起着关键性作用[6-7]。目前OPN、COX-2与宫颈癌化疗敏感性的相关性研究较少,因此本研究拟观察OPN、COX-2在宫颈癌肿瘤病灶组织中的表达水平,并分析两者与NACT化疗敏感性的相关性关系。
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选择本院肿瘤科2017年2月至2019年2月住院期间行NACT治疗的157例宫颈癌病人作为研究对象,根据相关肿瘤疗效评价标准分为化疗敏感组(112例)和化疗不敏感组(45例),2组病人临床资料比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表 1),具有可比性。本课题已获得医院伦理委员会审核及批准。
分组 n 年龄/岁 病灶直径/cm 病理类型 分期 鳞状细胞癌 腺癌 腺鳞癌 ⅡB ⅢA ⅢB 化疗敏感组 112 45.1±8.2 4.2±0.5 80 30 12 34 37 41 化疗不敏感组 45 43.9±7.7 4.4±0.6 30 10 5 14 15 16 t — 0.84 1.93 0.14* 0.02* P — >0.05 >0.05 >0.05 >0.05 *示χ2值 -
纳入标准:(1)病人入院前未实施外科手术切除或放化疗治疗;(2)所有病人实施NACT治疗前经病理组织检查均已确诊为宫颈癌;(3)病人治疗前已知晓研究内容,并签署自愿参加研究的同意书。排除标准:(1)合并心肝肾等重要脏器功能障碍而无法实施NACT治疗的病人;(2)合并有血液、神经等其他系统,或者其他脏器组织恶性肿瘤疾病的病人。
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所有病人入院后均实施相同的NACT治疗方案(紫杉醇+顺铂,全身静脉滴注化疗),紫杉醇药物治疗剂量为135 mg/m2,顺铂药物治疗剂量为60 mg/m2,2组病人均治疗2个周期,每个治疗周期间隔时间为3周,治疗期间对出现的各种化疗药物不良反应予以对症支持治疗,密切监测病人的生命体征变化。
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根据相关肿瘤疗效评价标准对病人的化疗敏感性予以评估[8],疗效分为完全缓解(CR):肿瘤病灶组织完全消失,而且淋巴结直径明显减小,且减少幅度≤10 mm;部分缓解(PR):肿瘤病灶组织最长径之和减少≥30%;疾病进展(PD):肿瘤病灶组织最长径之和增大≥20%,而且肿瘤病灶组织须绝对增大>5 mm,或者出现一个以上新肿瘤病灶组织;病情稳定(SD):肿瘤病灶组织最长径之和减少 < 30%,或者肿瘤病灶组织最长径之和增大 < 20%。CR和PR病人归为化疗敏感组,PD和SD病人归为化疗不敏感组。
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分别在2组病人NACT治疗前及治疗结束后3周采用宫颈活检钳各取200 mg肿瘤病灶组织。
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采用Western blotting法检测2组病人NACT治疗前后OPN、COX-2蛋白表达水平,将100 mg宫颈癌肿瘤病灶组织置于1 mL RIPA裂解液中,提取总蛋白并计算蛋白浓度。在99 ℃温度条件下煮沸作用10 min变性蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳后转入PVDF膜后,使用5%浓度的脱脂奶封闭液封闭处理1 h,稀释一抗4 ℃温度条件下孵育过夜作用,采用TBST溶液清洗处理PVDF膜3次,每次5 min,然后二抗室温条件下孵育处理2 h,采用TBST液清洗处理PVDF膜3次,每次5 min,ECL法显影处理后采用相应软件系统分析目的条带的灰度,以GAPDH为内参蛋白予以比对。
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所有病人NACT治疗前后肿瘤病灶组织采用Trizol试剂盒提取总RNA,并逆转录生成cDNA,采用RT-PCR法检测OPN、COX-2 mRNA表达水平,COX-2上游引物为:5′-AGT GAG CGT CAG GAG CA-3′,下游引物为:5′-GTG GGA ACA GCA AGG AT-3′,长度为187 bp,OPN上游引物为:5′-ATG CTA CAG ACG AGG ACA TCA C-3′,下游引物为:5′-CTC ATC ATT GGC TTT CCG CTT A-3′,长度为212 bp,β-actin上游引物为:5′-GGG CTG CTT TTA ACT CTG GTA A-3′,下游引物为:5′-GCT CCT GGA AGA TGG TGA TGG G-3′,长度为180 bp,均由上海生工生物工程股份有限公司合成。RT-PCR反应体系为:SYBR Green Ⅰ qPCR Master Mix 12.5 μL,上下游引物各1 μL,cDNA模板2.5 μL,ddH2O 8 μL,总体积为25 μL。RT-PCR反应程序为:95 ℃10 min,95 ℃ 15 s,48 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40个循环。整个RT-PCR反应结束后采集相关数据,计算OPN、COX-2 mRNA的相对表达量。
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采用三维彩色多普勒超声检测2组病人NACT治疗前后血管形成指数(vascularization index, VI)、血流指数(flow index, FI)、血管血流指数(vascularization flow index, VFI)等相关参数。
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采用t(或t′)检验、Spearman相关分析和logistic回归法分析。
1.1. 一般资料
1.2. 病例纳入及排除标准
1.3. NACT治疗方法
1.4. 化疗敏感评价标准
1.5. 研究方法
1.5.1. 组织样本采集方法
1.5.2. OPN、COX-2蛋白表达水平检测
1.5.3. OPN、COX-2 mRNA表达检测
1.5.4. 彩超检测方法
1.6. 统计学方法
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化疗不敏感组治疗前OPN、COX-2蛋白表达水平明显高于化疗敏感组(P < 0.01),化疗不敏感组治疗后OPN、COX-2蛋白表达水平未出现明显改变(P>0.05),而化疗敏感组治疗后OPN、COX-2蛋白表达水平明显降低(P < 0.01)(见表 2、图 1)。
分组 n OPN蛋白 COX-2蛋白 治疗前 化疗敏感组 112 0.732±0.112 1.153±0.187 化疗不敏感组 45 1.103±0.178 1.638±0.205 t — 12.99 14.29 P — < 0.01 < 0.01 治疗后 化疗敏感组 112 0.329±0.063** 0.443±0.097** 化疗不敏感组 45 1.027±0.151 1.577±0.183 t — 29.98 39.40 P — < 0.01 < 0.01 组内配对t检验:**P < 0.01 -
化疗不敏感组治疗前OPN、COX-2 mRNA表达水平明显高于化疗敏感组(P < 0.01),化疗不敏感组治疗后OPN、COX-2 mRNA表达水平未出现明显改变(P>0.05),而化疗敏感组治疗后OPN、COX-2 mRNA表达水平明显降低(P < 0.01)(见表 3)。
分组 n OPN mRNA COX-2 mRNA 治疗前 化疗敏感组 112 0.551±0.067 0.594±0.093 化疗不敏感组 45 0.694±0.123 0.784±0.141 t′ — 7.37 8.34 P — < 0.01 < 0.01 治疗后 化疗敏感组 112 0.240±0.042** 0.257±0.064** 化疗不敏感组 45 0.656±0.105 0.733±0.116 t′ — 25.76 25.98 P — < 0.01 < 0.01 组内配对t检验:**P < 0.01 -
治疗前宫颈癌组织OPN、COX-2 mRNA表达水平与VI、FI均呈正相关性关系(P < 0.05),而与VFI无明显相关性关系(P>0.05)(见表 4)。
指标 VI FI VFI OPN mRNA 0.481* 0.524* 0.221 COX-2 mRNA 0.571* 0.587* 0.235 注:*P < 0.05 -
以化疗前宫颈癌组织OPN、COX-2 mRNA表达水平及超声相关参数为自变量,以化疗敏感性为因变量进行logistic多因素分析,结果显示:化疗前宫颈癌组织OPN、COX-2 mRNA表达水平及VI、FI为化疗敏感性的独立危险因素(P < 0.05)(见表 5)。
影响因素 B SE Waldχ2 P OR 95%CI OPN mRNA 0.547 0.312 1.60 < 0.05 1.573(1.038~2.129) COX-2 mRNA 0.587 0.407 1.89 < 0.05 1.601(1.105~2.238) VI 0.605 0.427 0.98 < 0.05 1.875(1.289~2.463) FI 0.802 0.453 2.13 < 0.05 2.083(1.657~2.564) VFI 1.062 0.531 3.73 >0.05 2.812(2.162~3.603)