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阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是老年人痴呆的最常见原因。它是一种中枢神经系统退行性疾病，主要病理特征为β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积和高度磷酸化的tau蛋白形成的神经纤维缠结[1-2]。由于该疾病的复杂性，其病理生理机制尚不完全清楚。尽管全球AD病人的数量在不断增加，但目前尚无针对AD的有效治疗方法。近年来人们发现非编码RNA可以通过多种不同机制控制基因表达程序来调节细胞功能。其中环状RNA (circRNA)是一类具有完整闭环结构的非编码RNA，在哺乳动物的神经元中非常丰富[3]。研究[4-5]表明，一些circRNA在神经炎症、氧化应激和自噬以及Aβ的产生和降解中发挥重要的调节作用。因此，进一步研究circRNA在基因调控中的作用有利于增进对AD发病机制的研究，并通过寻找潜在的治疗靶点为AD诊断和治疗提供新策略。本研究使用APP/PS1转基因小鼠模型，采用基因芯片技术筛选出差异表达的circRNA，预测并构建circRNA-miRNA-mRNA调控网络，探讨差异表达circRNA在AD发病机制中的潜在作用。
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选取3只10月龄APP/PS1转基因雄性小鼠，作为AD组，同窝10月龄C57BL小鼠3只作为空白对照组。实验动物均购自南京君科生物工程有限公司，动物许可证号：SCXK(苏)2020-0009。通过颈椎脱位法分别处死2组小鼠，将获得的脑组织保存在液氮中备用。实验过程中遵循实验动物伦理规定。
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NanoDrop ND-1000型分光光度仪购自美国NanoDrop公司，Agilent DNA微阵列扫描仪、Agilent Feature Extraction v11.0.1.1软件和GeiieSpring GX v12.1软件购自美国Agilent公司，9700型PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。Arraystar小鼠circRNA V4.0芯片、Arraystar表达谱芯片配套试剂盒及2×PCR master mix试剂盒购自美国Arraystar公司，Trizol试剂和SuperScriptTMⅢ RT master mix试剂盒购自美国Invitrogen公司，RNeasy Mini Kit试剂盒购自美国Qiagen公司。
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用RNA提取试剂盒Trizol从小鼠脑组织中提取总RNA。采用ND-1000紫外分光光度计测定RNA的浓度并评估纯度。RNA完整性通过标准变性凝胶电泳进行评估。使用Arraystar小鼠circRNA V4.0芯片和Arraystar表达谱芯片配套试剂盒进行基因芯片杂交，并应用Agilent Feature Extraction软件获得芯片信号强度图和原始数据，对杂交图像进行差异数据分析。
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在差异表达的circRNA中随机选择5个circRNA进行qRT-PCR验证。按照SuperscriptTMⅢ RT转录试剂盒说明书步骤，反转录为互补DNA (complementary DNA，cDNA)。反转录条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。引物由上海数谱生物科技有限公司合成，各引物序列见表 1。将所得cDNA按照2×PCR master mix试剂盒说明进行操作，反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，40个循环。以GAPDH作为内参，由反应曲线得出阈值循环参数，应用QuantStudioTM 5 real-time PCR仪分析荧光阈值(cycle threshold，Ct)。采用2-△△Ct法计算相对表达量。
目的基因 引物序列 长度/bp GAPDH F: 5′CAC TGA GCA AGA GAG GCC CTA T3′
R: 5′GCA GCG AAC TTT ATT GAT GGT ATT 3′144 mmu_circRNA_32182 F: 5′GTC TTT CAA CTC CTA TCG CAC TG3′
R: 5′CTC GTC GGG CTG GTC TAC AT3′65 mmu_circRNA_29978 F: 5′GAG GAG GTG GTC CGA GTT G3′
R: 5′ACG GTG TGC CAG TGA AGA TG3′119 mmu_circRNA_41461 F: 5′ATG GAC TGG TTC ATT GCT GT3′
R: 5′CCA ACT TGA TCT TGA CGC TT3′149 mmu_circRNA_24012 F: 5′AAC GAT ATT GAT GAG GAG ACC A3′
R: 5′TGG TGA TTT TCA CAT CTG GAG 3′124 mmu_circRNA_35922 F: 5′CAA TGG ACA TCA CAG GCT ACT C3′
R: 5′GCA GGG TTA GCA GAA GAA GG3′83 mmu_circRNA_40341 F: 5′GTC GCT CAG AAG ACA GTG GA3′
R: 5′CCT TAG TTT TGG AAC CTT GC3′93 -
将差异表达的circRNA母源基因通过GO数据库(
http://www.geneontology.org )进行GO功能富集分析，通过KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg )对差异表达的基因进行KEGG通路富集分析。 -
差异表达的circRNA通过错误发现率(FDR)≤0.001及差异倍数筛选，利用TargetScan数据库和miRanda的miRNA靶标预测软件预测circRNA-miRNA和miRNA-mRNA之间的结合关系，应用Cytoscape3.4.0构建circRNA-miRNA-mRNA调控网络，对circRNA竞争性网络靶向mRNA进行GO和KEGG通路富集分析。
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采用t检验。
1.1. 实验动物
1.2. 仪器和试剂
1.3. RNA提取和芯片杂交
1.4. 实时荧光定量PCR反应(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)
1.5. 基因本体(gene ontology，GO)功能分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析
1.6. circRNA-miRNA-mRNA网络的构建
1.7. 统计学方法
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AD组与对照组比较，通过circRNA芯片鉴定，定义差异倍数>1.5且P < 0.05的circRNA具有差异表达，共筛选出52个差异有统计学意义的circRNA，其中28个上调，24个下调。根据差异表达的circRNA绘制热图(见图 1)和火山图(见图 2)，差异表达前10位的circRNA基本信息见表 2。
circRNA名称 差异倍数 P 亲本基因 表达变化 mmu_circRNA_33199 2.463 161 < 0.05 Olfm1 上调 mmu_circRNA_24012 2.134 654 < 0.05 Trim37 上调 mmu_circRNA_41461 2.009 832 < 0.05 Gabra5 上调 mmu_circRNA_40341 1.986 496 < 0.05 Snca 上调 mmu_circRNA_30828 1.883 003 < 0.05 Dlgap1 上调 mmu_circRNA_44786 1.840 855 < 0.05 Rasgrf1 上调 mmu_circRNA_32182 1.817 803 < 0.05 Sptbn2 上调 mmu_circRNA_29008 1.793 764 < 0.05 Nell2 上调 mmu_circRNA_000787 1.778 503 < 0.05 Tns3 上调 mmu_circRNA_41462 1.761 532 < 0.05 Gabra5 上调 mmu_circRNA_012503 2.239 039 < 0.05 Pbx3 下调 mmu_circRNA_36555 2.178 456 < 0.05 Gm11892 下调 mmu_circRNA_25826 2.173 975 < 0.05 Meg3 下调 mmu_circRNA_35922 1.868 88 < 0.05 Syt6 下调 mmu_circRNA_44628 1.850 253 < 0.05 Unc13c 下调 mmu_circRNA_31872 1.844 997 < 0.05 Gnal 下调 mmu_circRNA_29357 1.788 899 < 0.01 Hic2 下调 mmu_circRNA_21495 1.781 826 < 0.05 Rab3gap2 下调 mmu_circRNA_28035 1.715 291 < 0.05 Uggt2 下调 mmu_circRNA_29978 1.691 906 < 0.05 App 下调 -
芯片结果存在假阳性，为保证研究可靠性，采用qRT-PCR验证基因芯片的结果。结果显示，选取的5个circRNA中，3个上调(mmu_circRNA_24012，mmu_circRNA_41461，mmu_circRNA_40341)，2个下调(mmu_circRNA_29978，mmu_circRNA_35922)。除了mmu_circRNA_41461有上调趋势但差异无统计学意义，其余4个circRNA变化趋势与基因芯片结果一致，差异有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01)(见表 3)。
分组 n mmu_circRNA_35922 mmu_circRNA_24012 mmu_circRNA_40341 mmu_circRNA_29978 mmu_circRNA_41461 AD组 3 4.56±2.11 1.22±0.25 0.73±0.14 0.66±0.14 0.91±0.31 对照组 3 1.00±0.05 1.02±0.13 1.00±0.07 1.00±0.13 1.01±0.11 t — 5.86 3.12 3.88 4.73 0.32 P — < 0.01 < 0.05 < 0.05 < 0.01 >0.05 -
对差异表达circRNA的母源基因进行GO功能富集分析，发现上调的差异表达circRNA主要富集的生物过程为定位和神经系统发育，细胞组成为细胞投射和神经元投射，分子功能为蛋白质结合和Rho GTPase蛋白结合；下调的差异表达circRNA主要富集的生物过程为细胞成分的组装和突触组织，细胞组成为质膜外侧的锚定成分和突触膜，分子功能为结合和蛋白质结合(见图 3A、3B)。KEGG通路富集分析结果提示，上调的差异表达的circRNA的亲本基因主要富集于调控干细胞多能性的信号通路和Hippo信号通路等；下调的差异表达的circRNA的亲本基因主要富集于RNA运输，肌醇磷酸盐代谢和催产素信号通路等(见图 4)。
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为了进一步阐明差异circRNA的生物学功能，使用miRanda和TargetScan数据库预测得到具有结合位点的circRNA-miRNA和miRNA-mRNA关系对，构建circRNA-miRNA-mRNA三元转录网(见图 5)。对ceRNA网络mRNA进行GO功能富集及KEGG通路富集分析发现，GO富集的分子功能主要为蛋白质结合、催化活性、小分子结合；细胞成分主要为浆膜、浆膜约束的细胞投射、神经元投射；生物过程主要为对运输的正向调节、定位、对定位的调节。根据KEGG通路富集分析提示其主要富集于cAMP信号通路、Rap1信号传导途径、C型凝集素受体信号通路、HIF-1信号传导途径等信号通路(见图 6、7)。
2.1. circRNA差异表达分析
2.2. 差异表达circRNA的qRT-PCR验证结果
2.3. 差异表达circRNA的GO功能富集分析
2.4. 竞争性内源RNA (competing endogenous RNA，ceRNA)网络构建及生物信息学分析
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AD是一种与年龄相关的破坏性神经退行性疾病，主要症状包括记忆力减退和学习能力下降。AD的发生发展涉及多种因素，其病理机制尚不完全清楚。作为非编码RNA，circRNA虽然不能直接编码翻译蛋白质，但是能够充当“miRNA海绵”，参与转录后调控。circRNA通过与miRNA反应原件结合，降低miRNA与下游靶向mRNA的结合，从而减少miRNA介导的基因抑制表达，影响靶基因的表达，即ceRNA调控机制[6-7]。许多研究已经证明circRNA可以参与多种疾病的病理过程，例如，XU等[8]发现circCCAC1通过靶向YY1的miR-514a-5p促进胆管癌肿瘤发生；张兵等[9]报道可通过干扰circPTPRA来上调miR-140-5p的表达而抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖和迁移。
circRNA是一类在神经系统中高度表达的非编码RNA，研究表明circRNA在神经元发育和衰老过程中是动态调节的，它们在突触水平上富集，并在突触可塑性中发挥重要作用，突触可塑性是学习和记忆的基础[10]，可能参与了AD和其他神经退行性疾病的发生发展。例如，散发型AD病人海马CA1区circRNA CDR1as/ciRS-7的表达被下调[11]。由于降低了ciRS-7“海绵”效应，miR-7活性增加，可以下调AD相关靶标，包括泛素蛋白连接酶UBE2A，这是AD中清除淀粉样肽所必需的蛋白。此外，在SH-SY5Y细胞中，最近发现ciRS-7以NF-κB依赖性方式促进APP和BACE1的降解[12]。WU等[13]报道circ-LPAR1在AD病人中高表达，通过靶向CHP-212和IMR-32细胞中的miR-212-3p，提高Aβ刺激的神经元凋亡、炎症和氧化应激。CHEN等[14]报道circ-NF1-419通过结合AD样小鼠的Adaptor protein 2b1和Dynamin-1来调节老年痴呆。LI等[15]报道circ-AXL可促进AD细胞模型神经元损伤和炎症反应，通过靶向miR-328介导BACE1加速AD的进展。
为了探讨circRNA在AD中的潜在作用，本研究利用circRNA的基因芯片分析AD小鼠模型存在的差异表达circRNA。结果表明，与对照组相比，AD小鼠模型脑组织中共筛查出52个差异表达的circRNA，其中表达上调有28个，表达下调有24个。我们对差异表达circRNA的母源基因进行了GO和KEGG分析。GO功能富集分析发现上调的差异表达circRNA主要富集的生物过程为定位和神经系统发育，细胞组成为细胞投射和神经元投射，分子功能为蛋白质结合和Rho GTPase蛋白结合；下调的差异表达circRNA主要富集的生物过程为细胞成分的组装和突触组织；细胞组成为质膜外侧的锚定成分和突出膜；分子功能为结合和蛋白质结合。在KEGG分析中发现差异表达的circRNA的亲本基因主要富集于调控干细胞多能性的信号通路、Hippo信号通路、RNA运输磷脂酰肌醇信号传导通路等。Hippo信号通路在细胞功能中发挥着重要作用。Hippo信号传导的激活诱导细胞死亡，而Hippo信号传导的失活则引发细胞增殖[16]。最近的研究[17]表明，Hippo途径在AD的发病机制中起着重要作用，Hippo信号的过度激活可以导致Aβ42毒性增强, 并影响Aβ42介导的神经退行性，而下调Hippo信号通路可以挽救Aβ42介导的神经退行性。提示差异circRNA可能参与AD的多个调控机制。
目前，circRNA-miRNA-mRNA竞争系统已被发现是AD中一个重要的表观遗传调控环[18]。为此，本研究通过miRanda等数据库预测与差异circRNA存在结合位点的miRNA和miRNA-mRNA关系对构建ceRNA调控网络。本研究中预测的mmu_circRNA_ 35922是通过靶向miR-346-3p调节钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ a(CaMKⅡa)。CaMKⅡa是一种多功能蛋白激酶，是钙信号传导的关键参与者，在记忆处理，学习和神经可塑性中起着至关重要的作用[19]。CaMKⅡa失调也是AD发展的关键和早期信号。淀粉样蛋白前体蛋白和tau蛋白可被过度活跃的CaMKⅡa磷酸化，导致Aβ和神经原纤维缠结形成[20-21]。这些结果表明差异表达的circRNA相关ceRNA网络可以为AD提供新的见解，从而为该疾病提出新的治疗方法。
综上所述，本研究筛选出AD小鼠脑组织中多种差异表达的circRNA，如表达上调的mmu_circRNA_24012、mmu_circRNA_40341，表达下调的mmu_circRNA_29978、mmu_circRNA_35922，这些差异基因可能通过circRNA-miRNA-mRNA调节网络参与AD发生的分子调控。本研究有望为AD的诊疗及发生发展提供新的研究靶点和方向。而关于circRNA如何通过ceRNA网络具体参与AD的发病机制尚不清楚，后续可通过细胞和动物实验作更深入的研究。
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