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桥本甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis,HT)以自身甲状腺组织为抗原产生特异性抗体,甲状腺内淋巴细胞浸润,从而损伤甲状腺组织结构,在疾病初期表现为甲状腺毒症,随着病情进展最终大多发展为甲状腺功能减退症,多见于30~50岁的女性[1-2]。HT作为最常见的自身免疫性疾病之一已被证实与调节性T细胞(Treg细胞)亚群失衡有关,且Treg细胞的主要转录因子叉头框蛋白p3(Foxp3)表达减少[3]。Treg细胞通过抑制机体对自身和外来抗原的免疫应答来调节免疫耐受,维持免疫稳态。
糖蛋白A重复序列为主的蛋白(glycoprotein-A repetitions predominant protein,GARP)表达于活化Treg细胞表面,可与整合素αVβ8结合促进转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)的分泌及活化,从而维持Treg细胞的免疫调节功能和稳态[4]。来自Treg细胞的TGF-β对维持Treg细胞的功能和稳态至关重要。GARP与Foxp3之间的关系仍不明确,研究[5]表明下调GARP的表达可以部分损害Treg细胞的功能并下调Foxp3的表达,但也有研究[6]显示沉默GARP并不影响Foxp3的表达。因此,在HT病人中,Treg细胞的GARP表达情况有待深入研究。本研究探讨GARP、Foxp3、TGF-β在HT病人中的表达水平及意义。现作报道。
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选取2020年12月至2021年6月我院内分泌门诊就诊初次诊断、未使用甲状腺相关药物的HT病人32例作为观察组,符合2008年中华医学会内分泌学会《中国甲状腺疾病诊治指南》中HT的诊断标准:(1)超声检查示甲状腺质地不均匀改变,回声不均,可有低回声或甲状腺结节;(2)甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibody,TgAb)或甲状腺微粒体抗体(thyroid microsomal antibody,TmAb)阳性。排除标准:(1)合并其他甲状腺疾病, 甲状腺彩超排除其他甲状腺增生性疾病;(2)合并其他自身免疫性疾病或恶性肿瘤;(3)合并有急慢性传染性疾病或肝、肾疾病及低蛋白血症;(4)处于感染、创伤等应激状态;(5)妊娠期及哺乳期妇女。选取同期健康体检者32名作为对照组,入选标准:(1)甲状腺彩超及甲状腺功能正常,TgAb和TmAb均在正常范围内;(2)无甲状腺疾病病史;(3)无自身免疫性疾病病史;(4)无急慢性传染性疾病及肝肾功能、血脂正常。观察组男2例,女30例,年龄24~70岁;对照组男3名,女29名,年龄24~66岁,2组性别、年龄均有可比性。本研究经我院伦理委员会批准,受试者均已签署知情同意书。
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收集所有受试者的晨起空腹静脉血5 mL于EDTA抗凝试管,1 000 g离心15 min分离血清,用以检测甲状腺功能指标。另采集外周静脉血5 mL,EDTA抗凝,取对应数量的15 mL离心管标号,加入淋巴分离液5 μL,用滴管吸取血样沿管壁缓慢加入到淋巴分离液液面上,然后梯度离心分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),放于-80 ℃冰箱保存待检。
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使用PHILIPS HD3彩超诊断系统对HT病人行甲状腺超声检查,HT主要表现为甲状腺体积增大,回声不均,颗粒增粗,可伴低回声区域或甲状腺结节。排除甲状腺恶性肿瘤、甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿。
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采用化学发光免疫法进行测定2组血清促甲状腺激素(TSH)、总三碘甲状腺原氨酸(TT3)、总甲状腺素(TT4)。采用放射免疫法检测甲状腺抗体TmAb、TgAb水平,利用定量的标记抗原测定血清中的抗体滴度,采用二抗分离法,结果采用B/T的比值,正常参考值TmAb<20%、TgAb<30%。
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(1) 总RNA提取:采用过柱吸附法,依据EZ-10 Total RNA Mini-Preps Kit试剂盒(上海生工生物工程有限公司)操作说明提取样本总RNA,分光光度计检测提取的RNA浓度。(2)cDNA模板合成:根据NovoScript® Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix(gDNA Purge)试剂盒(苏州近岸蛋白质科技股份有限公司)[7]操作说明将RNA逆转录为cDNA模板。(3)实时荧光定量PCR:采用IQ5实时荧光定量PCR检测系统(美国Bio-rad公司),根据SYBR Green Fast qPCR Mix试剂盒(武汉爱博泰克生物科技有限公司)[8]操作说明检测GARP、Foxp3、TGF-βmRNA表达水平,引物序列见表 1,各分子相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。
分子 序列(5′-3′) GARP F CCC TGT AAG ATG GTG GAC AAG AA GARP R CAG ATA GAT CAA GGG TCT CAG TGT CT Foxp3 F GTG GCC CGG ATG TGA GAA G Foxp3 R GGA GCC CTT GTC GGA TGA TG TGF-β F GGC CAG ATC CTG TCC AAG C TGF-β R GTG GGT TTC CAC CAT TAG CAC β-actin F CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC β-actin R CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT -
采用t检验、秩和检验、χ2检验和Pearson相关分析。
1.1. 一般资料
1.2. 方法
1.2.1. 样本采集
1.2.2. 甲状腺彩超
1.2.3. 甲状腺功能指标检测
1.2.4. PBMC GARP、Foxp3、TGF-β mRNA表达测定
1.3. 统计学方法
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2组TT3、TT4、TSH水平差异均无统计学意义(P>0.05),观察组TgAb和TmAb水平均明显高于对照组(P<0.01)(见表 1)。
分组 n TT3/(nmol/L) TT4/(nmol/L) TSH/(mIU/L) TgAb/% TmAb/% 观察组 32 1.51±0.31 93.60±28.70 2.44(1.82, 3.63) 32.59(15.76, 45.98) 24.15(11.44, 32.53) 对照组 32 1.61±0.23 88.10±19.53 2.37(1.40, 3.56) 2.28(0.43, 4.33) 1.69(0.38, 3.85) t — 1.41 0.90 0.72△ 5.64△ 5.83△ P — >0.05 >0.05 >0.05 <0.01 <0.01 △示uc值 -
观察组GARP、Foxp3、TGF-βmRNA表达水平均明显低于对照组(P<0.01)(见表 2)。
分组 n GARP Foxp3 TGF-β 观察组 32 0.27(0.16, 0.62) 0.21(0.11, 0.32) 0.45(0.29, 0.62) 对照组 32 0.74(0.58, 1.20) 0.66(0.48, 1.16) 1.01(0.88, 1.18) uc — 4.78 4.81 4.96 P — <0.01 <0.01 <0.01 -
Pearson相关分析显示,HT病人PBMC中GARP mRNA表达水平与TgAb水平呈负相关关系(P<0.05), 与TT3水平呈明显正相关关系(P<0.01);其他分子间无明显相关关系(P>0.05)(见表 3)。
项目 GARP mRNA Foxp3 mRNA TGF-β mRNA TgAb -0.421* -0.020 -0.100 TmAb -0.322 0.015 -0.125 TT3 0.453** 0.283 0.101 TT4 0.243 0.088 0.011 TSH -0.103 -0.310 0.328 *P<0.05, **P<0.01