Construction of eukaryotic recombinant plasmid pCDNA3.1-Flag-PTEN and prokaryotic recombinant plasmid pGEX-6P-1-GST-PTEN

真核表达载体pCDNA3.1、原核表达载体6P-1-pGEX、HEK 293细胞均为江苏大学附属医院中心实验室惠赠。E.coliDMT和BL-21细菌株(TRAN公司)；限制性内切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶(Thermo公司)；T4 DNA连接酶(TaKaRa公司)；BCA蛋白定量试剂盒、质粒小提试剂盒、PCR回收试剂盒、RIPA细胞裂解液、DAB试剂盒(Beyotime公司)；PTEN的兔多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗免IgG(Solarbio公司)；根据基因库中人PTEN基因编码多肽氨基酸序列(AF067844.1)设计多条引物用于基因拼接，由上海生物工程公司合成；其余试剂均为进口或国产分析纯。

检索NCBI网站上PTEN编码区基因序列，设计PTEN特异性引物(primer 5软件)(见表 1)。真核融合质粒选择的PTEN基因片段长1 209 bp，原核融合质粒选择的PTEN基因片段长162 bp。通过PCR大量扩增目的片段。PCR反应条件为94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，共38个循环，72 ℃延伸5 min，扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。

用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ分别双酶切载体pCDNA3.1-Flag和PTEN基因片段、载体6P-1-pGEX和PTEN基因片段，于37 ℃孵箱中反应12 h；使用PCR产物纯化试剂盒纯化回收后，用T4 DNA连接酶于37 ℃反应16 h；连接产物转化至E.coli DMT感受态中，冰浴30 min，42 ℃热激90 s，再次冰浴3~5 min，加入0.5 mL LB培养基(不含抗生素)，放入37 ℃ 200 r/min摇床中震动1 h后，将菌液涂布到LB固体培养基(Amp+)上，于37 ℃ 5%CO₂培养箱中孵育过夜；挑选3~5个单克隆菌落分别接种到7 mL LB液体培养基(Amp+)中，37 ℃ 200 r/min摇床中振荡过夜。第2天提取质粒，双酶切后产物，琼脂糖凝胶电泳阳性者送上海生物工程公司测序。

293细胞中的表达与蛋白纯化在含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养HEK 293细胞，并置于37 ℃ 5%CO₂恒温培养箱中，待其生长融合度至80%，将适量HEK 293细胞接种到6孔板，待其生长融合度至50%~80%时，采用LipoHigh脂质体高效转染试剂体系将pCDNA3.1-Flag和pCDNA3.1-Flag-PTEN分别转染HEK 293细胞，并于37 ℃ 5%CO₂恒温培养箱中培养24 h。

将pGEX-6P-1-GST-PTEN重组质粒转化至E.coliBL-21感受态中，挑选3~5个挑取单菌接种到LB液体培养基(Amp+)中，37 ℃ 200 r/min摇床中振荡培养过夜，第2天取1 mL细菌悬液转接到新鲜的20 mL LB液体培养基(Amp+)，37 ℃ 200 r/min摇床中振荡培养2 h，使得菌液吸光度值(600 nm)≈0.6，然后加入21 μL IPTG(诱导E.coli BL-21表达目的蛋白)至终浓度为0.1 mmol/L，16 ℃ 200 r/min继续振荡培养8 h后收集菌体，用6 mL PBS重悬菌液，冰上超声裂解细菌，超声功率200~300 W，每次超声处理1 s，间隔1 s，共处理约15 min至菌液清亮。将破碎的菌液4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，取上清液于离心管中并置于冰水浴。取40 μL GST磁珠悬液，用1 mL PBS于4 ℃，2 000 r/min，离心10s, 液体，重复漂洗2次。将4 mL细菌裂解上清液与漂洗过后GST磁珠混合，4 ℃侧摆摇床过夜。第2天将混合液4℃ 1 500 r/min离心5 min收集沉淀，用PBS漂洗3遍。加入事先配制好的200 μL GST磁珠洗脱液，4 ℃侧摆摇床振荡10 min，离心取上清后再洗脱1遍。

在HEK 293细胞转染24 h后，弃去旧培养基，用PBS漂洗，加入100 μL RIPA(含1%蛋白酶抑制剂)，冰上裂解20~30 min，用细胞刮板在冰上轻轻刮起细胞，吸至1.5 mL离心管内，冰上静置30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清。用BCA试剂盒测蛋白浓度，每孔取含有400 μg蛋白的细胞裂解上清液，用RIPA将两者的体积补成一致，继续加入总体积1/4量的4×SDS上样缓冲液，金属浴100 ℃煮10 min后，4 ℃, 3 000 r/min离心5 s。取相同体积量的上清液进行SDS-PAGE，再电转移至硝酸纤维素膜上；用5%脱脂奶粉于4 ℃封闭1 h；用1×TBST按1:1 000比例稀释Rabbit PTEN Polyclonal Antibody，4 ℃孵育过夜；1×TBST洗膜3次，10 min/次；再用1×TBST按1:10 000比例稀释Goat anti-Rabbit，室温摇床孵育1 h，1×TBST洗膜3次，每次10 min；化学发光法显色2 min，压片显影。

重组蛋白GST-PTEN按比例加4×蛋白质上样缓冲液(含DTT)，100 ℃金属浴10 min；经SDS-PAGE凝胶电泳后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，确保充分覆盖凝胶，置于水平摇床缓慢摇动，室温染色4 h；倒出染色液，加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，确保充分覆盖凝胶；置于水平摇床缓慢摇动，室温脱色4~24 h，期间更换脱色液2~4次，直至蓝色背景基本上全部被脱去，并且蛋白条带染色效果达到预期。

构建PTEN-C原核表达载体(162 bp)和PTEN(1 209 bp)真核表达载体。重组质粒经过菌落PCR验证，均扩增出特异DNA片段(见图 1、2)。与测序结果的BLAST进行比对，结果进一步确定插入片段碱基无缺失、无突变、无移位，正确率达100%，说明目的载体构建成功(见图 3、4)。

将构建的真核重组质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN和空载质粒pCDNA3.1分别转染至HEK 293细胞中，24 h后提蛋白进行Western blot检测PTEN蛋白的表达，结果显示pCDNA3.1-Flag-PTEN高表达PTEN目的基因；用GAPDH做内参基因，且灰度基本一致，说明蛋白样本的蛋白总量一致，结果真实可靠(见图 5)。

重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN-C(AA350-403)转化E.coli BL-21, 经IPTG诱导6 h后，离心收集细菌，PBST重悬，超声粉碎仪处理，得到的上清液含有GST标记的目的蛋白。使用GST磁珠进行选择性吸附，并用GST蛋白洗脱液进行洗脱。经过考马斯亮蓝染色，验证蛋白表达成功(见图 6、7)。

PD是一种以中脑黑质纹状体通路的退变、黑质致密区多巴胺能神经元进行性变性、丢失和胞内内涵体路易氏小体生成为主要特征的神经系统退行性疾病。目前PD的发病机制尚不明确，线粒体自噬是近年来研究的热点，而PI3K/AKT/mTOR是线粒体自噬机制中至关重要的信号通路。研究^[3]表明，抑癌基因PTEN正常表达可以通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路而干扰正常线粒体自噬功能，直接影响多巴胺神经元的活性。有研究^[4-5]发现Parkin、PINK 1、α-synuclein、LRRK 2等基因与PD的致病存在一定的相关性，其中Parkin、PINK 1功能活性均受PTEN调节^[6-7]。因此，我们可以得出PTEN参与PD发病过程中多条信号通路的结论，但其具体发病机制尚不清晰，需进一步探索。

PTEN蛋白的相对分子质量约56 000，属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族，在胞内表现出蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶的双重活性。目前为止，学术界公认PTEN的主要功能是特异性地在PIP3第3位磷酸基团去磷酸化为PIP2而拮抗磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase, PI3K)的功能, 进而抑制PI3K下游特别是PI3K-AKT通路的信号转导, 发挥抑制细胞生长、侵袭、增殖和迁移等多种生物学效应^{[1, 8]}。近年来研究^[9]发现，PTEN在成人中枢神经系统的神经元中高度表达，但仅限于神经元的胞核和胶质细胞的胞质中。PTEN在中枢神经系统神经元的发育、增殖、分化、轴突的生长和突触可塑性等方面发挥着重要的调控作用，尤其与PD的多巴胺能神经元通路^[10-11]、α-突触核蛋白毒性^[12]、线粒体损伤^[13]等机制均有关联，这对PD发病机制的研究具有重大意义，所以PTEN可能成为PD潜在治疗靶点。

鉴于PTEN蛋白有如此重要的功能，并且与PD多种发病机制之间有紧密联系，所以我们有必要构建其多种重组质粒，进而得到相关融合蛋白，为进一步研究PTEN蛋白生物学功能以及与PD相关信号通路之间的相互作用提供了便利工具。本研究根据基因库中PTEN序列，设计PTEN基因相关引物，用基因重组技术成功构建出真核表达载体pCDNA3.1-Flag-PTEN与原核表达载体pGEX-6P-1-GST-PTEN，并分别转染到HEK 293细胞和E.coli BL-21中正确表达出相应的PTEN重组蛋白，为后续研究PTEN的磷酸化位点以及降解方式等多种生物学功能奠定了基础，为PD发病机制中研究和进一步开展临床检测研究创造有利条件。