Expression of UQCRC1 in colorectal cancer tissue and its correlation with serum CEA

随机选取2017-2018年蚌埠医学院第一附属医院初诊CRC手术切除得到的组织标本52例，并收集所选病例术前血清CEA值。其中男28例，女24例，年龄20~80岁。肿瘤大小：≤5 cm者27例，>5 cm者25例；组织学分型：腺癌49例，黏液癌3例；组织学分级：中分化及高分化共36例，低分化16例；TMN分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期22例，Ⅲ期20例，Ⅳ期8例；并从其中选取37例临近癌旁组织作对照分析。纳入标准：所有病人均已完善相关检查(肠镜活检、临床病理切片等)确诊为原发性CRC，且为初诊；术前未接受化疗、放疗、靶向及其他特殊抗肿瘤治疗；所有病人均已在术前完善血清学CEA检测。排除标准：合并其他系统肿瘤；合并急慢性严重炎症、自身免疫性病；临床资料不全者。诊断及分期标准：参照《中国CRC诊疗规范(2017年版)》^[7]中提到的诊断标准及TNM分期、组织学分级等。

本研究已通过本院伦理委员会批准。抗体UQCRC1购自美国Abcam有限公司(产品编号ab125882)，免疫组织化学采用SP法染色。按照试剂盒说明书进行染色程序，主要步骤包括：石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水；自来水、蒸馏水各冲洗3遍；高压抗原修复2 min；过氧化物酶阻断10~15 min；蒸馏水冲洗3遍，PBS冲洗；加一抗温箱孵育1 h，PBS冲洗3遍；滴加二抗，温箱孵育30 min，PBS冲洗3遍；滴加DAB显色3~5 min，自来水冲洗；苏木精复染，水洗返蓝；常规脱水透明，中性树胶固定封片。

以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性。显微镜下观察免疫组织化学染色结果，每张切片由本院2名病理科医生采用下述方法评定^[8]：标志物根据显色深浅得到染色强度：0分(阴性)、1分(弱)、2分(中)、3分(强)；根据阳性染色区域相对于整个癌区百分比得到染色程度： < 5%为0分、5%~25%为1分、>25%~50%为2分、>50%~75%为3分、>75%为4分。其结果为两项得分乘积：最终得分≤2分为阴性，最终得分≥3分为阳性。血清CEA值参考值范围为0~5 ng/mL, ≥5 ng/mL即为阳性。

采用χ²检验、Spearman等级相关性分析。

UQCRC1主要表达于细胞质(见图 1)。本次研究结果显示，52例癌组织中有16例(30.8%)UQCRC1低表达；37例癌旁正常组织中UQCRC1呈低表达的有4例(10.8%)，在α < 0.05的水准上，两者差异具有统计学意义(χ²=4.94，P < 0.05)。Spearman等级相关性分析结果提示UQCRC1的表达与组织性质显著相关(r=-0.236, P < 0.05)。CRC病人术前血清CEA阳性率为40.4%(21/52)。

CRC组织中UQCRC1的表达与淋巴结转移情况有关(P < 0.05)，在病人不同性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、临床分期上的表达差异均无统计学意义(P>0.05) (见表 1)。

52例结肠癌组织中，UQCRC1表达阴性同时CEA表达阳性者占62.5%(10/16)。运用Spearman等级相关分析得知，在α < 0.05的检验水准上，CRC病人癌组织中UQCRC1表达水平与术前血清CEA值呈显著负相关(r=-0.300)(P < 0.05)(见表 2)。

CRC是全世界绝大多数国家的一个健康问题。据报道，全世界每年有超过100万人罹患CRC，遗传和环境因素是CRC发生的重要条件^[9]。在我国，CRC发病率逐年上升，且随着一些危险因素如人口老龄化、不良饮食习惯等蔓延，其死亡率也处于明显的上升趋势^[10]，居民生命健康受到严重威胁。尽早诊断和判断癌变组织恶性程度对提高CRC病人的生存质量至关重要。

UQCRC1是一种核DNA编码蛋白，是参与合成线粒体呼吸链复合体Ⅲ的11个重要亚基之一。UQCRC1在胚胎存活和发育中起着关键作用，SHAN等^[11]的实验发现敲除杂合子小鼠中的UQCRC1导致胚胎致死。而关于UQCRC1的表达与恶性肿瘤中的关系，KULAWIEC等^[12]发现74%的乳腺癌病人UQCRC1阳性，仅34%的卵巢腺癌病人UQCRC1表达。后陆续有关于其在食管癌、胰腺导管腺癌中上调，在贲门癌、胃癌中表达下调的报道^[13-14]。从目前考虑的机制上看，不可忽视的是UQCRC1表达与线粒体的关系。研究^[11]证实UQCRC1对维持酵母中复合体Ⅲ的完整性至关重要。有关实验^[15-16]显示，上皮来源的细胞和小鼠精母细胞中UQCRC1的缺失可导致线粒体功能障碍。YI等^[17]的研究指出，UQCRC1有助于在心肌损伤期间维持H9c2细胞的线粒体功能。根据这些证据可推测，UQCRC1的异常表达可影响到人类线粒体功能正常状态的维持。正常线粒体功能中断会导致多种人类疾病的发生，其中就包括肿瘤的发生^[18]。近年来，线粒体出现在癌症研究中的次数大大增多。线粒体可调节生物代谢，是癌细胞代谢变化的关键调节物^[19]。目前线粒体功能障碍在多种癌症的转移进展中皆有报道发现^[20]，如结肠癌、前列腺癌、胃癌等。线粒体障碍常产生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，促进DNA损伤和遗传不稳定性^[21]。ROS是线粒体呼吸链产生的主要来源于复合体Ⅲ的具有损伤作用的副产物^[22]，ROS失衡是线粒体功能障碍主要机制之一，其在癌症的发生、发展和生存表型中皆发挥重要作用^{[19, 23-24]}。SHAN等^[11]实验还发现，UQCRC1缺乏致使小鼠线粒体膜电位和ATP产量下降，而ROS产量增加，可能原因在于UQCRC1的缺乏导致复合物Ⅲ活性的降低。

本实验研究结果显示，UQCRC1在癌组织中的表达下调率(30.8%)高于癌旁正常组织(10.8%)，差异有统计学意义(P < 0.05)。UQCRC1参与组成线粒体氧化呼吸链，推测在结直肠细胞中UQCRC1的下调表达使细胞中的线粒体出现功能障碍，细胞能量代谢发生改变，进而导致肿瘤的发生发展。进一步分析该蛋白表达水平与肿瘤的大小、分化程度、临床分期以及淋巴结转移的关系，发现CRC组织中UQCRC1的下调表达与肿瘤淋巴结转移有关，进一步提示UQCRC1的存在与CRC侵袭有着密切联系。LI等^[25]通过研究证实UQCRC1表达下调与血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)表达升高之间存在正向相关关系，提出UQCRC1的下调可诱导VEGF-C的表达进而促进淋巴转移。这一考虑基于有关VEGF-C通过诱导淋巴管的生成促使淋巴结转移事件发生的相关报道^[26]。

CEA是一种高分子糖蛋白，在人类的结肠、胃、汗腺等组织器官中存在。CEA在细胞的聚集、黏附、凋亡等过程中发挥作用，其与肿瘤的恶性程度密切相关。CEA增高可发生在多种恶性肿瘤中如胃肠道癌、乳腺癌、胰腺癌等，其中以结肠癌显著^[27-28]。研究^[29]显示CEA在CRC病人中的阳性率在40%~50%之间。此次研究结果显示，CRC病人术前CEA阳性率为40.4%，UQCRC1表达与血清CEA表达存在负相关性。这种负向关系考虑原因为：在结肠细胞中UQCRC1的表达下调或缺失，使得细胞线粒体失去正常功能，细胞代谢环境改变使得组织器官更易受到损伤，从而导致肠道细胞癌变。随着CRC的发生，CEA含量增多，充分发挥了其在肿瘤细胞免疫逃避及细胞聚集、黏附中的重要作用，使肿瘤细胞更易向周围组织器官扩散和转移^[30]，进一步促进了癌症的发展，使得UQCRC1的表达进一步下调。CEA作为标志物在肿瘤的检测中应用广泛，但因独立检测缺乏特异性，增加指标可使阳性可信度增加。本实验结果显示，CRC组织中UQCRC1表达阴性者其血清CEA阳性率明显高于UQCRC1表达阳性者，表明联合两种指标检测有助于评估结直肠肿瘤的状态。

综上所述，CRC中UQCRC1的表达下调与CRC的发生发展有密切关系，联合UQCRC1和CEA两个指标检测可为CRC的诊治及病情评估提供一定理论依据。