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RIPK1-RIPK3-MLKL通路是近年来热度较高的细胞程序性坏死(Necroptosis)的经典通路。Necroptosis兼具有程序性调控以及细胞坏死的病理学特征[1-2],且依赖于RIPK3和p-MLKL的活性,这有别于既往我们所熟知的细胞死亡方式,如坏死、凋亡、自噬等。Necroptosis是一种重要的致死性信号通路,参与了各种疾病的发展,包括缺血性损伤、病毒感染、肝脏疾病、肿瘤等[3]。在应激条件下,RIPK3可以迁移到内质网上,增加活性氧(ROS)的生成,最终导致心肌细胞因能量不足而膨胀和破裂[4]。糖尿病心肌病(DCM)是指有糖尿病基础,在心脏微血管病变及代谢紊乱基础上引发心肌广泛缺血坏死,其主要病理过程涉及心肌细胞膜钙通道转运、心肌间质纤维化、冠状动脉微血管病变、RAS系统激活等多方面[5]。有研究表明PKCβ/p66氧化应激途径[6]、caspase-1炎症通路[7]等与糖尿病心肌损伤关系密切。RIPK3-CaMKII通路也被证实参与心肌损伤过程[8]。因此为了更好地理解Necroptosis在DCM发生发展中的作用和调节机制,本实验通过复制糖尿病模型,观测Necroptosis通路中主要因子及丙二醛的含量变化,观察糖尿病心肌损伤中Necroptosis如何变化及其可能的调控机制。
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选取SD大鼠24只,体质量(BW)210~245 g,平均BW(229.78±22.41)g,均来自蚌埠医学院实验动物中心同一批次大鼠,每笼4~5只,饮食自由,室温恒定,昼夜规律,空气湿度为40%~60%。适应性喂养1周后,随机选取6只为CON组。其余18只予以高脂高糖饮食(HC组+DM组),饲料配方为:64.75%基础饲料+10%猪油+20%白砂糖+5%蛋白粉+0.05%维生素+0.2%矿物质。3周后随机选取12只大鼠为DM组,禁食12 h后腹腔注射链脲佐菌素(STZ)40 mg/kg造模,72 h后检测空腹血糖,连续3 d,空腹血糖≥16.7 mmol/L,尿糖3+~4+,说明造模成功。每组留取6只,其余备用。此后每3 d检测尿糖和血糖,剔除不达标大鼠。死亡大鼠由同批次大鼠代替。10周后统一处理大鼠。主要试剂:STZ(美国Sigma公司),兔抗大鼠RIP1、RIP3、MLKL抗体(美国Abcam公司),MDA试剂盒(南京建成公司),DMSO(美国Sigma公司),Trizol Reagent(美国Invitrogen公司),SDS-PAGE缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司),高速离心机(上海卢湘离心机仪器有限公司)。
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大鼠称BW后采用4%水合氯醛按照8 mL/kg进行腹腔注射,麻醉满意后,仰卧固定于手术台上,沿前正中线切开,打开心腔,剥离心脏,0.9%氯化钠溶液冲净血液,剪除周围纤维组织及大血管,滤纸吸干后天平称全心质量(HW),心体比为HW/BW。
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大鼠处死前统一麻醉后行小动物超声,在左心长轴切面上测量左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD);通过M型超声获得左心室射血分数(LVEF),每只测量3次取平均值,为减少大鼠个体差异所造成的误差,采用体表面积进行校正,体表面积(m2)=0.09×[BW(kg)]2/3。
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打开心腔后,从腹主动脉抽取1~2 mL血液,4 ℃ 2 000 r/min离心10 min后取血浆,-80 ℃保存。用时水浴溶解,按照试剂盒说明书,加样、洗板、封闭、加检测抗体、洗板、加酶、洗板、显色、终止反应、读板、获取标准曲线。
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心脏称重后取0.1 g×2份心尖部心肌组织,其中1份裂解匀浆,4 ℃ 10 000 r/min 5 min后取上清液分别分成2份至新的EP管中。TRIzol法提取总RNA,酶标仪Take3测RNA纯度及浓度;按照说明书,冰上进行RNA逆转录,得到逆转录产物cDNA;溶解引物后分装,引物的信息见表 1;加样,设计反应程序,以CON组作为对照,计算得到2-ΔΔCt值,进行数据分析。
基因 引物 序列 产物/bp RIPK1 正向 5′-AGG TAC AGG AGT TTG GTA TGG GC-3′ 123 反向 5′-GGT GGT GCC AAG GAG ATG TAT G-3′ RIPK3 正向 5′-TAGT TTA TGA AAT GCT GGA CCG C-3′ 145 反向 5′-GCC AAG GTG TCA GAT GAT GTC C-3′ MLKL 正向 5′- GCC ACT GGA AAG ATC CCG TT-3′ 108 反向 5′-CAA CAA CTC GGG GCA ATC CT-3′ β-actin 正向 5′- AGA CCT TCA ACA CCC CAG-3′ 156 反向 5′-CAC GAT TTC CCT CTC AGC-3′ 表 1 RIPK1、RIPK3、MLKL的上、下游引物序列表
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取每组心肌细胞上清液1份,BCA法蛋白定量后于-20℃保存;凝胶制备,SDS PAGE电泳;并将胶用半干转膜法转移至激活后的PVDF膜;配置封闭液,封闭,加入稀释的一抗,孵育,加入稀释的二抗,孵育,TBST洗膜;化学发光剂显色1 min,BIO-RAD凝胶成像系统曝光并获取图像;经凝胶成像系统测量条带灰度值,计算实验蛋白的相对表达量。
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取备用心尖组织1份,4%多聚甲醛立即固定,包埋切片,行Masson染色。Masson染色主要的步骤为:石蜡切片脱蜡至水;自来水和蒸馏水反复冲洗;Regaud苏木精染液染核5~10 min;充分水洗;用Masson丽春红酸性复红液5~10 min;以2%冰醋酸水溶液浸洗15 min;1%磷钼酸水溶液分化3~5 min;苯胺蓝或光绿液染5 min;0.2%冰醋酸水溶液浸洗15 min。95%乙醇、无水乙醇、二甲苯透明、中性树胶封固。
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采用方差分析和q检验。
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CON组及HC组均未出现大鼠死亡,CON组大鼠毛色光泽,行动敏捷,较为活泼,HC组大鼠外形略显肥胖。DM组死亡4只,出现明显的“三多一少”症状,外形瘦小,蜷卧时间增加,尿中骚味明显,更换敷料频率增加。
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与CON组比较,HC组HW明显增加(P < 0.01),BW和HW/BW无明显变化(P>0.05);与HC组比较,DM组HW减轻,BW下降,HW/BW明显增加(P < 0.05~P < 0.01)(见表 2)。
分组 HW/mg BW/g (HW/BW)/(mg/g) CON组 973.55±71.52 495.67±25.53 1.98±0.21 HC组 1201.43±63.04** 527.98±41.74 2.22±0.36 DM组 1105.23±77.30** 366.60±31.64**## 2.99±0.42**## F 15.64 38.65 14.07 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 5021.971 1131.760 0.117 q检验:与CON组比较**P < 0.01;与HC组比较#P < 0.05,##P < 0.01 表 2 大鼠HW、BW、HW/BW比较(x±s;ni=6)
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与CON组比较,HC组的LVESD、LVEF无明显差异(P>0.05),未见明显心功能不全;DM组较CON组及HC组,LVEDD及LVESD均扩大,LVEF降低(P < 0.01),心功能明显下降(见图 1、表 3)。
分组 LVEDD/mm LVESD/mm LVEF/% CON组 7.15±0.21 3.31±0.21 78.37±1.41 HC组 7.38±0.19** 3.50±0.19 76.26±1.91 DM组 7.90±0.26**## 3.97±0.19**## 67.42±2.38**## F 17.66 17.10 53.81 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.051 0.040 3.763 q检验:与CON组比较**P < 0.01;与HC组比较##P < 0.01 表 3 大鼠LVEDD、LVESD及LVEF比较(x±s;ni=6)
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HC组TNF-α、IL-6及MDA水平均高于CON组(P < 0.05~0.01);DM组的TNF-α、IL-6及MDA水平均高于CON组和HC组(P < 0.01)(见表 4)。
分组 TNF-α/(ng/mL) IL-6/(ng/mL) MDA/(nmol/mL) CON组 265.53±53.86 64.33±6.95 6.18±1.54 HC组 476.84±54.58** 77.80±8.62* 10.67±1.83** DM组 697.49±65.86**## 99.63±11.28**## 16.61±2.17**## F 82.19 22.84 47.22 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 3 405.716 83.324 3.476 q检验:与CON组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与HC组比较##P < 0.01 表 4 大鼠血浆TNF-α、IL-6及MDA表达量比较(x±s; ni=6)
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与CON组比较,HC组的RIPK1及RIPK3的mRNA水平上调(P < 0.05~P < 0.01),MLKL无明显差异(P>0.05);DM组的RIPK1、RIPK3和MLKL的mRNA水平均高于CON组和HC组(P < 0.01)(见表 5)。
分组 RIPK1 RIPK3 MLKL CON组 1 1 1 HC组 1.19±0.13** 1.14±0.13* 1.12±0.15 DM组 1.70±0.15**## 1.51±0.13**## 1.90±0.19**## F 65.06 36.98 76.37 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.012 0.011 0.019 q检验:与CON组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与HC组比较##P < 0.01 表 5 大鼠心肌组织RIPK1、RIPK3、MLKL的mRNA水平比较(x±s; ni=6)
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HC组和DM组的RIPK1、RIPK3、MLKL的蛋白水平均较CON组上调(P < 0.01);与HC组比较,DM组RIPK1、RIPK3、MLKL的蛋白水平均上调(P < 0.01)(见图 2、表 6)。
分组 RIPK1 RIPK3 MLKL CON组 0.21±0.03 0.27±0.02 0.29±0.03 HC组 0.41±0.02** 0.46±0.01** 0.41±0.03** DM组 0.83±0.04**## 0.88±0.03**## 1.38±0.03**## F 587.06 1 645.65 2 445.08 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.001 0.000 0.001 q检验:与CON组比较**P < 0.01;与HC组比较##P < 0.01 表 6 大鼠心肌组织RIPK1、RIPK3、MLKL比较(x±s; ni=6)
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对各组大鼠心肌组织Masson染色结果显示,CON组大鼠心肌组织结构清晰,心肌细胞排列规则;DM组大鼠心肌组织纤维及细胞排列杂乱无序,细胞核散乱,细胞质淡染呈水样变,细胞间质内可见大量胶原纤维增生;而HC组则介于两者之间(见图 3)。
糖尿病大鼠心肌损伤中程序性坏死通路相关蛋白的表达
Expression of proteins associated with necroptosis pathways in myocardial injury in diabetic rats
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摘要:
目的 探讨程序性坏死(Necroptosis)通路相关蛋白在糖尿病心肌中的表达及其可能机制。 方法 在大鼠高糖高脂饮食喂养基础上腹腔注射链脲佐菌素40 mg/kg制备糖尿病模型大鼠,其中正常组(CON组,n=6)、高脂高糖组(HC组,n=6)和糖尿病组(DM组,n=6);10周后超声检测左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)及左心室射血分数(LVEF);处死大鼠后测量心质量(HW)、体质量(BW)、心体比(HW/BW);ELISA法检测血液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)及丙二醇(MDA)水平;心尖部组织行Masson染色;RT-PCR及Western blotting检测心肌组织中RIPK1、RIPK3、MLKL的含量变化。 结果 与CON组比,HC组HW、TNF-α、IL-6、MDA水平增加,RIPK1、RIPK3和MLKL的蛋白表达量增加(P < 0.05~P < 0.01),但MLKL的mRNA表达量无明显变化(P>0.05);与HC组比较,DM组HW/BW升高,LVEF下降,TNF-α、IL-6及MDA水平增加,RIPK1、RIPK3、MLKL的mRNA及蛋白含量增加(P < 0.01),Masson染色蓝染加重。 结论 高糖状态可诱导心肌损伤,增加心肌纤维化及氧化水平,可能与上调Necroptosis通路有关。 Abstract:Objective To investigate the expression of necroptosis pathway related protienin diabetic myocardium, and its possible mechanism. Methods The diabetic model of rats was prepared by intraperitoneal injection of 40mg/kg of streptozotocin on the basis of highcalories diet feeding, and divided into the normal group(CON group, n=6), highcalories group(HC group, n=6) and diabetes group(DM group, n=6).After 10 weeks, the left ventricular end diastolic diameter(LVEDD), left ventricular end systolic diameter(LVESD) and left ventricular ejection fraction(LVEF) were detected using ultrasound.The heart weight(HW), body weight(BW), and heart-body ratio(HW/BW) in three groups were measured after the rats were sacrificed.In three groups, the serum levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α), interleukin-6(IL-6) and maleic dialdehyde(MDA) were detected using ELISA method, the apical tissue were stained using Masson, and the changes of RIPK1, RIPK3 and MLKL in myocardial tissue were detected using RT-PCR and Western blotting. Results Compared with the CON group, the expression levels of HW, TNF-α, IL-6 and MDA increased, and the protein expression levels of RIPK1, RIPK3, and MLKL increased(P < 0.05 to P < 0.01), but the changes of the mRNA expression levels of MLKL were not obvious in HC group(P>0.05).Compared with the HC group, the HW/BW increased, the LVEF decreased, the levels of TNF-α, IL-6 and MDA expression increased, the mRNA and protein levels of RIPK1, RIPK3, and MLKL increased(P < 0.01), and the blue staining of Masson aggravated in DM group. Conclusions High glucose status can induce the myocardial injury, increase the myocardial fibrosis and oxidation level, which may be related to the upregulation of the necroptosis pathway. -
Key words:
- diabetes mellitus /
- necroptosis /
- myocardial injury /
- rats
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表 1 RIPK1、RIPK3、MLKL的上、下游引物序列表
基因 引物 序列 产物/bp RIPK1 正向 5′-AGG TAC AGG AGT TTG GTA TGG GC-3′ 123 反向 5′-GGT GGT GCC AAG GAG ATG TAT G-3′ RIPK3 正向 5′-TAGT TTA TGA AAT GCT GGA CCG C-3′ 145 反向 5′-GCC AAG GTG TCA GAT GAT GTC C-3′ MLKL 正向 5′- GCC ACT GGA AAG ATC CCG TT-3′ 108 反向 5′-CAA CAA CTC GGG GCA ATC CT-3′ β-actin 正向 5′- AGA CCT TCA ACA CCC CAG-3′ 156 反向 5′-CAC GAT TTC CCT CTC AGC-3′ 表 2 大鼠HW、BW、HW/BW比较(x±s;ni=6)
分组 HW/mg BW/g (HW/BW)/(mg/g) CON组 973.55±71.52 495.67±25.53 1.98±0.21 HC组 1201.43±63.04** 527.98±41.74 2.22±0.36 DM组 1105.23±77.30** 366.60±31.64**## 2.99±0.42**## F 15.64 38.65 14.07 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 5021.971 1131.760 0.117 q检验:与CON组比较**P < 0.01;与HC组比较#P < 0.05,##P < 0.01 表 3 大鼠LVEDD、LVESD及LVEF比较(x±s;ni=6)
分组 LVEDD/mm LVESD/mm LVEF/% CON组 7.15±0.21 3.31±0.21 78.37±1.41 HC组 7.38±0.19** 3.50±0.19 76.26±1.91 DM组 7.90±0.26**## 3.97±0.19**## 67.42±2.38**## F 17.66 17.10 53.81 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.051 0.040 3.763 q检验:与CON组比较**P < 0.01;与HC组比较##P < 0.01 表 4 大鼠血浆TNF-α、IL-6及MDA表达量比较(x±s; ni=6)
分组 TNF-α/(ng/mL) IL-6/(ng/mL) MDA/(nmol/mL) CON组 265.53±53.86 64.33±6.95 6.18±1.54 HC组 476.84±54.58** 77.80±8.62* 10.67±1.83** DM组 697.49±65.86**## 99.63±11.28**## 16.61±2.17**## F 82.19 22.84 47.22 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 3 405.716 83.324 3.476 q检验:与CON组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与HC组比较##P < 0.01 表 5 大鼠心肌组织RIPK1、RIPK3、MLKL的mRNA水平比较(x±s; ni=6)
分组 RIPK1 RIPK3 MLKL CON组 1 1 1 HC组 1.19±0.13** 1.14±0.13* 1.12±0.15 DM组 1.70±0.15**## 1.51±0.13**## 1.90±0.19**## F 65.06 36.98 76.37 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.012 0.011 0.019 q检验:与CON组比较*P < 0.05,**P < 0.01;与HC组比较##P < 0.01 表 6 大鼠心肌组织RIPK1、RIPK3、MLKL比较(x±s; ni=6)
分组 RIPK1 RIPK3 MLKL CON组 0.21±0.03 0.27±0.02 0.29±0.03 HC组 0.41±0.02** 0.46±0.01** 0.41±0.03** DM组 0.83±0.04**## 0.88±0.03**## 1.38±0.03**## F 587.06 1 645.65 2 445.08 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.001 0.000 0.001 q检验:与CON组比较**P < 0.01;与HC组比较##P < 0.01 -
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