Grb7蛋白SH2结构域的表达及其纯化的方法

张丹; 赵敏迪; 高友鹤

Grb7蛋白SH2结构域的表达及其纯化的方法

1.
1.中国医学科学院基础医学研究所;
2.
2.北京协和医学院基础医学院生理与病理生理学系;
3.
3.国家医学分子生物学重点实验室

作者简介: 张丹(1979-)，男，博士．高友鹤，博士，博士研究生导师，教授;张丹(1979-)，男，博士．高友鹤，博士，博士研究生导师，教授

基金项目:
国家杰出青年科学基金资助项目(30725009)

国家自然科学基金资助项目(30870502)

卫生部行业基金资助项目(20082007)

北京市自然科学基金资助项目(5072037)

高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(20070023021,20070023071)

111工程(B08007)

长江学者和创新团队发展计划资助项目(IRT0909)

The expression and purification of Grb7 SH2 domain

1.
National Key Laboratory of Medical Molecular Biology;
2.
Department of Physiology and Pathophysiology，Institute of Basic Medical Sciences;
3.
Chinese Academy of Medical Sciences/School of Basic Medicine，Peking Union Medical College，Beijing 100005，China

摘要: 目的:探讨Grb7蛋白SH2结构域的表达及其纯化的方法。方法:将Grb7蛋白SH2结构域编码基因与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)标签编码基因构建为融合基因，插入原核表达载体pGEX-4T-1的多克隆酶切位点EcoRⅠ与XhoⅠ之间，挑选测序正确的质粒将其转染至BL 21感受态细胞内，感受态细胞于37℃摇培至其OD值达到0.6～0.8后，经0.2 mmol/L IPTG 25℃过夜诱导表达融合蛋白，MALDI-TOF质谱检测蛋白纯化产物，SPR生物传感器(Biacore 3000)检测纯化蛋白与天然配体磷酸化肽段的相互作用。结果:GST-Grb7 SH2结构域融合蛋白在裂解菌液的上清液中存在，500 ml LB/Amp菌液可纯化得到415g GST-Grb7 SH2结构域融合蛋白，MALDI-TOF质谱图上可见明显目的蛋白峰，Biacore 3000检测到纯化蛋白可结合不同浓度的磷酸化肽段配体。结论:运用改进的GST融合蛋白纯化方法可得到具有一定纯度及生物学活性的GST-Grb7 SH2结构域融合蛋白，为该蛋白结构域后续功能研究奠定了基础。
- 生长因子受体结合蛋白质7 /
- SH2结构域 /
- 谷胱甘肽巯基转移酶 /
- 基因表达 /
- 纯化
Abstract: Objective：To explore the method which to express and purify the bioactive Grb7 SH2 domain.Methods：The fusion gene of GST-Grb7 SH2,which was constructed into the site between EcoRⅠ and XhoⅠ in the pEGX-4T-1,was induced by the 0.2 mmol/L IPTG to express in the BL 21 competent cells,at 25 ℃ for overnight,and the MALDI-TOF and Biacore3000 were used to identify the purity and bioactivity of the recombinant protein.Results：GST-Grb7 SH2 domain fusion protein(415 g) was purified from 500 ml LB bacterial liquid,and protein peaks were observed on the map of MALDI-TOF,and interactions between GST-Grb7 SH2 domain and phosphorylated peptide pY(1180) from the ErbB3,with concentrations of 10 nmol/L and 100 nmol/L,were measured by Biacore 3000.Conclusions：The recombinant GST-Grb7 SH2 domain can be obtained through a improved method,which may help to furtherly investigate the functions of Grb7 SH2 domain.
- growth factor receptor-bound protein 7 /
- SH2 domain /
- glutathione sulfhydryl transferase /
- gene expression /
- purification

[1]	《牛血清白蛋白脂质体包封率的测定方法研究》[J].药学学报,2007(5).
[2]
[2] Daly RJ,Sanderson GM,Janes PW,et al.Cloning and characterizationof GRB14,a novel member of the GRB7 gene family[J].J BiolChem,1996,271(21):12502-12510.
[4]
[3] Ramsey B,Bai T,Hanlon Newell A,et al.GRB7 protein over-expression and clinical outcome in breast cancer[J].BreastCancer Res Treat,2010,127(3):659-669.
[6]
[4] Tsai NP,Ho PC,Wei LN,et al.Regulation of stress granuledynamics by Grb7 and FAK signalling pathway[J].EMBO J,2008,27(5):715-726.＜br＞
[5] Luzy JP,Chen H,Gril B,et al.Development of binding assays forthe SH2 domain of Grb7 and Grb2 using fluorescence polarization[J].J Biomol Screen,2008,13(2):112-119.
[9]
[6] Lucas-Fernandez E,Garcia-Palmero I,Villalobo A.Genomicorganization and control of the grb7 gene family[J].CurrGenomics,2008,9(1):60-68.
[11]
[7] Tanaka S,Pero SC,Taguchi K,et al.Specific peptide ligand forGrb7 signal transduction protein and pancreatic cancer metastasis[J].J Natl Cancer Inst,2006,98(7):491-498.
[13]
[8] Han DC,Shen TL,Guan JL.The Grb7 family proteins:structure,interactions with other signaling molecules and potential cellularfunctions[J].Oncogene,2001,20(44):6315-6321.
[15]
[9] Junker H,Venz S,Zimmermann U,et al.Stage-related alterationsin renal cell carcinoma-comprehensive quantitative analysis by2D-DIGE and protein network analysis[J].PloS ONE,2011,6(7):e21867.
[17]
[10] Ivancic M,Spuches AM,Guth EC,et al.Backbone nuclearrelaxation characteristics and calorimetric investigation of thehuman Grb7-SH2/erbB2 peptide complex[J].Protein Sci,2005,14(6):1556-1569.
[19]
[11] Stein D,Wu J,Fuqua SA,et al.The SH2 domain protein GRB-7is co-amplified,overexpressed and in a tight complex with HER2in breast cancer[J].EMBO J,1994,13(6):1331-1340.
[21]
[12] Janes PW,Lackmann M,Church WB,et al.Structuraldeterminants of the interaction between the erbB2 receptor andthe Src homology 2 domain of Grb7[J].J Biol Chem,1997,272(13):8490-8497.
[23]
[13] Alessio N,Michele C,Anna G,et al.Grb7 upregulaion is amolecular adaptation to HER2 signaling inhibition due to removalof akt-mediated gene repression[J].PloS ONE,2010,5(2):e9024.
[25]
[14] Ambaye ND,Gunzburg MJ,Lim RC,et al.Benzopyrazinederivatives:a novel class of growth factor receptor bound protein7 antagonists[J].Bioorg Med Chem,2011,19(1):693-701.
[27]
[15] Mee YK,Sunjoo J.In vitro selection of RNA aptamer and specifictargeting of ErbB2 in breast cancer cells[J].Nucl Acid Ther,2011,21(3):173-178.
[29]
[16] Jan Cl,Yu CC,Hung MC,et al.Tid1,CHIP and ErbB2interactions and their prognostic implications for breast cancerpatients[J].J Pathol,2011,225(3):424-437.
[31]
[17] Glynn RW,Miller N,Kerin MJ.17q12-21-the pursuit of targetedtherapy in breast cancer[J].Cancer Treat Rev,2010,36(3):224-229.＜br＞
[18] Pero SC,Shukla GS,Cookson MM,et al.Combination treatmentwith Grb7 peptide and Doxorubicin or Trastuzumab(Herceptin)results in cooperative cell growth inhibition in breast cancer cells[J].Br J Cancer,2007,96(10):1520-1525.
[34]
[19] Chu PY,Huang LY,Hsu CH,et al.Tyrosine phosphorylation ofgrowth factor receptor-bound protein-7 by focal adhesion kinase inthe regulation of cell migration,proliferation,and tumorigenesis[J].J Biol Chem,2009,284(30):20215-20226.
[36]
[20] Itoh S,Taketomi A,Tanaka S,et al.Role of growth factor-receptorbound protein 7 in hepatocellular carcinoma[J].Mol CancerRes,2007,5(7):667-673.

[1]	李卫鹏 , 郑佐娅 , 王红 , 王从珠 , 杭勤 , 赵卫国 . B型钠尿肽基因的克隆和原核表达载体构建及纯化. 蚌埠医学院学报, 2007, 32(1): 14-17.
[2]	闵宏林 , 沈继龙 , 陈勇 , 李柏青 . GST-颗粒溶解素融合蛋白的纯化及其抗菌活性分析. 蚌埠医学院学报, 2007, 32(3): 265-267.
[3]	张晓静 , 刘先富 , 陈延松 , 郭伟 . DNA2基因表达与乳腺癌恶性程度及雌激素受体表达的关系. 蚌埠医学院学报, 2017, 42(11): 1469-1471,1475. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2017.11.011
[4]	高迎 , 陶志勇 , 夏惠 , 陈勇 , 王雪梅 , 方强 . 间日疟原虫醛缩酶的克隆、表达与初步鉴定. 蚌埠医学院学报, 2013, 37(7): 777-780.
[5]	潘庆春 , 余永胜 , 汤正好 , 张韡 , 韩进超 , 臧国庆 . Tat_47-57-HBcAg融合基因表达载体的构建及融合蛋白的表达鉴定. 蚌埠医学院学报, 2008, 33(6): 640-643.
[6]	胡建国 , 王凤超 , 钟政荣 , 陆佩华 . 大鼠GAP-43基因的克隆及其在COS-7细胞的表达. 蚌埠医学院学报, 2007, 32(3): 253-255.
[7]	于影 , 胡杰 , 关宿东 . 阿霉素中毒大鼠肺组织中β-防御素-2的基因表达. 蚌埠医学院学报, 2009, 34(5): 376-378.
[8]	马黎丽 , 陈昌杰 , 杨清玲 , 章尧 . 人端粒酶逆转录酶基因启动子调控表达载体的构建和鉴定. 蚌埠医学院学报, 2008, 33(6): 665-668.
[9]	房兵 , 孙淼 , 李友建 , 武晓茜 , 耿家珍 , 邵先安 . 人-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达. 蚌埠医学院学报, 2012, 36(5): 500-504.
[10]	周继红 , 章尧 . Sp1对HL-60细胞人端粒酶逆转录酶表达的调控. 蚌埠医学院学报, 2012, 36(7): 756-758.
[11]	蒋秀琴 , 胡圳圳 , 花荣 , 郭文文 , 郑大同 . Max作用蛋白1-0缺失突变体的构建、表达及细胞内定位的研究. 蚌埠医学院学报, 2015, 40(11): 1465-1468. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2015.11.002
[12]	徐成岭 , 吴俊英 , 吕合作 . Bhlha15转录因子的研究进展. 蚌埠医学院学报, 2011, 36(11): 1281-1283.
[13]	张鼎 , 孙西美 , 邵正仁 , 陈传好 . SPRR1A基因真核荧光表达载体的构建. 蚌埠医学院学报, 2009, 34(2): 97-99.
[14]	李光友 , 陈勇 , 夏惠 , 方强 , 刘丹 , 买月琴 , 贺文欣 . 间日疟原虫MSP1-19基因的克隆与表达. 蚌埠医学院学报, 2011, 36(9): 935-937.
[15]	李见 , 王露 , 李玉云 . 重组表达人IDO基因慢病毒载体的构建及鉴定. 蚌埠医学院学报, 2014, 39(7): 841-845.
[16]	陈丽 , 周浩 , 何宏天 , 管政 . 人HNA-3a基因的克隆及其在HEK-293细胞的表达. 蚌埠医学院学报, 2019, 44(1): 6-8,13. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2019.01.002
[17]	唐洁 , 申林 , 李柏青 , 赵皓 , 余晾 , 郑洪波 . SYBR Green实时定量PCR检测急性髓系白血病患者BAALC基因表达. 蚌埠医学院学报, 2010, 35(7): 656-659.
[18]	朱晓骏 , 孙学华 , 刘顺庆 , 高月求 . 人自噬相关基因LC3B真核表达载体的构建及鉴定. 蚌埠医学院学报, 2012, 36(2): 145-148.
[19]	胡圳圳 , 李璐 , 吴小芸 , 郑大同 , 吴伟玲 . pEGFP-N1-Mxi1-0重组质粒的构建与表达. 蚌埠医学院学报, 2015, 40(3): 318-321. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2015.03.008
[20]	常睿 , 李庆文 , 关超 , 周文生 . FEZ1/LZTS1基因在膀胱移行细胞癌中的表达及意义. 蚌埠医学院学报, 2010, 35(7): 678-681.

点击查看大图

计量

文章访问数: 3808
HTML全文浏览量: 501
PDF下载量: 139
被引次数: 0

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

留言板

Grb7蛋白SH2结构域的表达及其纯化的方法

作者简介: 张丹(1979-)，男，博士．高友鹤，博士，博士研究生导师，教授;张丹(1979-)，男，博士．高友鹤，博士，博士研究生导师，教授

The expression and purification of Grb7 SH2 domain

计量

Grb7蛋白SH2结构域的表达及其纯化的方法

作者简介: 张丹(1979-)，男，博士．高友鹤，博士，博士研究生导师，教授;张丹(1979-)，男，博士．高友鹤，博士，博士研究生导师，教授

English Abstract

The expression and purification of Grb7 SH2 domain

全文HTML

目录

留言板

Grb7蛋白SH2结构域的表达及其纯化的方法

作者简介: 张丹(1979-)，男，博士． 高友鹤，博士，博士研究生导师，教授;张丹(1979-)，男，博士． 高友鹤，博士，博士研究生导师，教授

The expression and purification of Grb7 SH2 domain

计量

出版历程

Grb7蛋白SH2结构域的表达及其纯化的方法

作者简介: 张丹(1979-)，男，博士． 高友鹤，博士，博士研究生导师，教授;张丹(1979-)，男，博士． 高友鹤，博士，博士研究生导师，教授

English Abstract

The expression and purification of Grb7 SH2 domain

全文HTML

目录

作者简介: 张丹(1979-)，男，博士．高友鹤，博士，博士研究生导师，教授;张丹(1979-)，男，博士．高友鹤，博士，博士研究生导师，教授

作者简介: 张丹(1979-)，男，博士．高友鹤，博士，博士研究生导师，教授;张丹(1979-)，男，博士．高友鹤，博士，博士研究生导师，教授