人-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达

房兵; 孙淼; 李友建; 武晓茜; 耿家珍; 邵先安

留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

人-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达

房兵 , 孙淼 , 李友建 , 武晓茜 , 耿家珍 , 邵先安

文章导航 > 蚌埠医学院学报 > 2012, 36 > 5: (500-504)

引用本文:

Citation:

人-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达

1.
1. 蚌埠医学院, 安徽蚌埠233030;
2.
2. 解放军第123医院检验病理科, 安徽蚌埠233015

作者简介: 房兵(1978 － )，男，硕士研究生

通讯作者: 邵先安, XAsliaol@126.com

基金项目:
南京军区医学课题资助项目(07M035)

Cloning and prokaryotic expression of d-EGF and -defensin-3 fusion protein

1.
1. Bengbu Medical College, Bengbu Anhui 233030;
2.
2. Department of Clinical Medical and Pathology, The 123 Hospital of PLA, Bengbu Anhui 233015, China

Corresponding author: SHAO Xian-an, XAsliaol@126.com

摘要: 目的：克隆融合蛋白d-EGF成熟链基因，构建原核表达载体，并在大肠埃希菌(E.coli)表达体系中进行有效表达、分离纯化并鉴定其特异性。方法：以蛋白基因序列为基础，RT-PCR扩增人防御素-和表皮生长因子基因，分别构建-防御素-3(-defensin-3)、EGF重组质粒，应用重组PCR方法，将EGF的DNA序列拼接到-defensin-3DNA序列的3端，将基因克隆入原核表达载体pET-SUMO，构建重组质粒pET-SUMO-d-EGF。采用PCR、测序等方法鉴定后转化E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导表达，Ni-trap柱纯化，SDS-PAGE检测表达及纯化结果，最后以Westernblot对其进行特异性鉴定。结果：成功构建-defensin-3、EGF重组质粒，经重组PCR成功扩增出294bp的目的片段，重组体PCR结果与预期结果一致，测序正确。转入重组质粒的E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导经SDS-PAGE分析得到28kDa左右的目的蛋白条带。Westernblot鉴定出融合蛋白含有抗EGF、-防御素-3两种抗原特异性的蛋白。结论：成功构建原核表达载体pET-SUMO-d-EGF，并获得纯化的融合蛋白，为进一步的活性分析奠定了实验基础。
- 基因表达 /
- -防御素 /
- 融合蛋白d-EGF /
- 巢氏PCR /
- 免疫应迹分析
Abstract: To recombine the dGF and(3lefensin 3 gene in prokaryotic expression vector express fusion protein inProkaryotic system and purify and identify its specific. Methods:On the basis of gene sequence(3lefensin 3 gene and epidermalgrowth factor(EGF)gene were amplified by RTCR. Recombinant plasmid ofplefensin 3 and dGF plasmid were constructed andthe DNA sequences of dGF andplefensin 3 gene was cloned into the pET SUMO prokaryotic expression vector. The pET SUMOd-EGF vector was identified by PCR and sequenced and transformed into E. coli BL21(DE3),which was induced by IPTG purified usingNIrap column and identified with westernlot. Results:plefensin 3 and dGF plasmid were constructed. The fragment of 294 bywas successfully amplified by the recombinant PCR in accordance with the expected results and sequencing was correct. TwentyightkDa protein was obtained through tranforming into E. coli BL21 DE3)and IPTG Inducing. The fusion protein containing dGF andp-defensin 3 two proteins were identified with westernlot. Conclusions:Prokaryotic expression vector pET SUMOGF was successfully. onstructed and fusion protein purified was obtained. It provides a basis for analysing its activity
- gene expression /
- lefensin /
- fusion protein dGF /
- nested PCR /
- immunoblot

[1]	.余兴邦, 郭锁链, 乌翠兰, 等.防御素研究进展.动物医学进展, 2006, 27(8): 4751;
[2]	.赵红艳, 幕玉, 赵宝华.抗菌肤在食品防腐剂中的研究应用.卫生研究, 2009, 38(4): 502504.3.肖贞良, 陈章, 田坤, 等.阴性菌的抗菌活性及其与细菌耐药性的关系.解放军医学杂志, 2010, 35(9): 11061109;
[3]	.度晓哗, 柴家科, 蒋伟, 等.对临床分离多药耐药菌的抗菌活性分析;
[4]	.鲍玉洲, 张立华, 张艳敏.人表皮生长因子基因真核表达载体的构建及其基因转染田.中国临床康复, 2006, 10(29): 87 -91.赵军, 朱咸艳, 刘祥, 等.重组PCR技术的应用及优化田.激光生物学报, 2008, 17(3): 355362;
[5]	.牛颜冰, 雷胃吃, 申林炎, 等.烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒双价RNA沉默抗病载体的快速构建田.中国生物工程杂志, 2009, 29(1): 7680.

[1]	于影 , 胡杰 , 关宿东 . 阿霉素中毒大鼠肺组织中β-防御素-2的基因表达. 蚌埠医学院学报, 2009, 34(5): 376-378.
[2]	潘庆春 , 余永胜 , 汤正好 , 张韡 , 韩进超 , 臧国庆 . Tat_47-57-HBcAg融合基因表达载体的构建及融合蛋白的表达鉴定. 蚌埠医学院学报, 2008, 33(6): 640-643.
[3]	唐洁 , 申林 , 李柏青 , 赵皓 , 余晾 , 郑洪波 . SYBR Green实时定量PCR检测急性髓系白血病患者BAALC基因表达. 蚌埠医学院学报, 2010, 35(7): 656-659.
[4]	张丹 , 赵敏迪 , 高友鹤 . Grb7蛋白SH2结构域的表达及其纯化的方法. 蚌埠医学院学报, 2012, 36(4): 376-379.
[5]	蒋秀琴 , 胡圳圳 , 花荣 , 郭文文 , 郑大同 . Max作用蛋白1-0缺失突变体的构建、表达及细胞内定位的研究. 蚌埠医学院学报, 2015, 40(11): 1465-1468. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2015.11.002
[6]	张晓静 , 刘先富 , 陈延松 , 郭伟 . DNA2基因表达与乳腺癌恶性程度及雌激素受体表达的关系. 蚌埠医学院学报, 2017, 42(11): 1469-1471,1475. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2017.11.011
[7]	胡建国 , 王凤超 , 钟政荣 , 陆佩华 . 大鼠GAP-43基因的克隆及其在COS-7细胞的表达. 蚌埠医学院学报, 2007, 32(3): 253-255.
[8]	张鼎 , 孙西美 , 邵正仁 , 陈传好 . SPRR1A基因真核荧光表达载体的构建. 蚌埠医学院学报, 2009, 34(2): 97-99.
[9]	李光友 , 陈勇 , 夏惠 , 方强 , 刘丹 , 买月琴 , 贺文欣 . 间日疟原虫MSP1-19基因的克隆与表达. 蚌埠医学院学报, 2011, 36(9): 935-937.
[10]	李见 , 王露 , 李玉云 . 重组表达人IDO基因慢病毒载体的构建及鉴定. 蚌埠医学院学报, 2014, 39(7): 841-845.
[11]	陈丽 , 周浩 , 何宏天 , 管政 . 人HNA-3a基因的克隆及其在HEK-293细胞的表达. 蚌埠医学院学报, 2019, 44(1): 6-8,13. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2019.01.002
[12]	马黎丽 , 陈昌杰 , 杨清玲 , 章尧 . 人端粒酶逆转录酶基因启动子调控表达载体的构建和鉴定. 蚌埠医学院学报, 2008, 33(6): 665-668.
[13]	朱晓骏 , 孙学华 , 刘顺庆 , 高月求 . 人自噬相关基因LC3B真核表达载体的构建及鉴定. 蚌埠医学院学报, 2012, 36(2): 145-148.
[14]	胡圳圳 , 李璐 , 吴小芸 , 郑大同 , 吴伟玲 . pEGFP-N1-Mxi1-0重组质粒的构建与表达. 蚌埠医学院学报, 2015, 40(3): 318-321. doi: 10.13898/j.cnki.issn.1000-2200.2015.03.008
[15]	常睿 , 李庆文 , 关超 , 周文生 . FEZ1/LZTS1基因在膀胱移行细胞癌中的表达及意义. 蚌埠医学院学报, 2010, 35(7): 678-681.
[16]	赵凌杰 , 焦东东 , 赵智明 , 商玮 , 董晓蕾 . 卡托普利对腹主动脉缩窄大鼠模型心肌Ⅰ和Ⅲ型胶原及其mRNA表达的影响. 蚌埠医学院学报, 2010, 35(11): 1081-1084.
[17]	周继红 , 章尧 . Sp1对HL-60细胞人端粒酶逆转录酶表达的调控. 蚌埠医学院学报, 2012, 36(7): 756-758.
[18]	武世伍 . MTAP基因的研究进展. 蚌埠医学院学报, 2006, 31(3): 326-329.
[19]	张帆 . 具有肌上皮分化特征的基底细胞样乳腺癌研究进展. 蚌埠医学院学报, 2008, 33(4): 500-503.
[20]	徐成岭 , 吴俊英 , 吕合作 . Bhlha15转录因子的研究进展. 蚌埠医学院学报, 2011, 36(11): 1281-1283.

点击查看大图

计量

文章访问数: 3531
HTML全文浏览量: 267
PDF下载量: 102
被引次数: 0

人-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达

通讯作者: 邵先安, XAsliaol@126.com

作者简介: 房兵(1978 － )，男，硕士研究生

1. 1. 蚌埠医学院, 安徽蚌埠233030;
2. 2. 解放军第123医院检验病理科, 安徽蚌埠233015

收稿日期: 2011-10-25
网络出版日期: 2012-05-15

基金项目: 南京军区医学课题资助项目(07M035)

关键词:

摘要: 目的：克隆融合蛋白d-EGF成熟链基因，构建原核表达载体，并在大肠埃希菌(E.coli)表达体系中进行有效表达、分离纯化并鉴定其特异性。方法：以蛋白基因序列为基础，RT-PCR扩增人防御素-和表皮生长因子基因，分别构建-防御素-3(-defensin-3)、EGF重组质粒，应用重组PCR方法，将EGF的DNA序列拼接到-defensin-3DNA序列的3端，将基因克隆入原核表达载体pET-SUMO，构建重组质粒pET-SUMO-d-EGF。采用PCR、测序等方法鉴定后转化E.coliBL21(DE3)，经IPTG诱导表达，Ni-trap柱纯化，SDS-PAGE检测表达及纯化结果，最后以Westernblot对其进行特异性鉴定。结果：成功构建-defensin-3、EGF重组质粒，经重组PCR成功扩增出294bp的目的片段，重组体PCR结果与预期结果一致，测序正确。转入重组质粒的E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导经SDS-PAGE分析得到28kDa左右的目的蛋白条带。Westernblot鉴定出融合蛋白含有抗EGF、-防御素-3两种抗原特异性的蛋白。结论：成功构建原核表达载体pET-SUMO-d-EGF，并获得纯化的融合蛋白，为进一步的活性分析奠定了实验基础。