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人-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达

房兵 孙淼 李友建 武晓茜 耿家珍 邵先安

引用本文:
Citation:

人-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达

    作者简介: 房兵(1978 - ),男,硕士研究生
    通讯作者: 邵先安, XAsliaol@126.com
  • 基金项目:

    南京军区医学课题资助项目(07M035)

Cloning and prokaryotic expression of d-EGF and -defensin-3 fusion protein

    Corresponding author: SHAO Xian-an, XAsliaol@126.com
  • 摘要: 目的:克隆融合蛋白d-EGF成熟链基因,构建原核表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)表达体系中进行有效表达、分离纯化并鉴定其特异性。方法:以蛋白基因序列为基础,RT-PCR扩增人防御素-和表皮生长因子基因,分别构建-防御素-3(-defensin-3)、EGF重组质粒,应用重组PCR方法,将EGF的DNA序列拼接到-defensin-3DNA序列的3端,将基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建重组质粒pET-SUMO-d-EGF。采用PCR、测序等方法鉴定后转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni-trap柱纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果,最后以Westernblot对其进行特异性鉴定。结果:成功构建-defensin-3、EGF重组质粒,经重组PCR成功扩增出294bp的目的片段,重组体PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导经SDS-PAGE分析得到28kDa左右的目的蛋白条带。Westernblot鉴定出融合蛋白含有抗EGF、-防御素-3两种抗原特异性的蛋白。结论:成功构建原核表达载体pET-SUMO-d-EGF,并获得纯化的融合蛋白,为进一步的活性分析奠定了实验基础。
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出版历程
  • 收稿日期:  2011-10-25
  • 刊出日期:  2012-05-15

人-防御素-3与人表皮生长因子融合蛋白的克隆及原核表达

    通讯作者: 邵先安, XAsliaol@126.com
    作者简介: 房兵(1978 - ),男,硕士研究生
  • 1. 1. 蚌埠医学院, 安徽蚌埠233030;
  • 2.  2. 解放军第123医院检验病理科, 安徽蚌埠233015
基金项目:  南京军区医学课题资助项目(07M035)

摘要: 目的:克隆融合蛋白d-EGF成熟链基因,构建原核表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)表达体系中进行有效表达、分离纯化并鉴定其特异性。方法:以蛋白基因序列为基础,RT-PCR扩增人防御素-和表皮生长因子基因,分别构建-防御素-3(-defensin-3)、EGF重组质粒,应用重组PCR方法,将EGF的DNA序列拼接到-defensin-3DNA序列的3端,将基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建重组质粒pET-SUMO-d-EGF。采用PCR、测序等方法鉴定后转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达,Ni-trap柱纯化,SDS-PAGE检测表达及纯化结果,最后以Westernblot对其进行特异性鉴定。结果:成功构建-defensin-3、EGF重组质粒,经重组PCR成功扩增出294bp的目的片段,重组体PCR结果与预期结果一致,测序正确。转入重组质粒的E.coliBL21(DE3)经IPTG诱导经SDS-PAGE分析得到28kDa左右的目的蛋白条带。Westernblot鉴定出融合蛋白含有抗EGF、-防御素-3两种抗原特异性的蛋白。结论:成功构建原核表达载体pET-SUMO-d-EGF,并获得纯化的融合蛋白,为进一步的活性分析奠定了实验基础。

English Abstract

参考文献 (5)

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