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膝关节是人体最大的关节，构造较为复杂，前交叉韧带(ACL)和后交叉韧带(PCL)是维持膝关节稳定的重要结构，任何一条韧带受损，膝关节的运动功能和稳定性都会受到影响[1]。随着人们对体育运动日渐重视，ACL与PCL损伤已成为常见的膝关节损伤[2]。目前，交叉韧带重建术是治疗这类损伤的主要方法，但由于ACL与PCL损伤后难以进行自我功能性修复，因此远期疗效并不理想[3]。既往的研究大多集中在ACL损伤，多数学者认为，ACL损伤后关节腔内炎性细胞因子[白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等]含量和基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)表达的大幅增加，引发细胞外基质过多降解，从而影响了ACL损伤后的修复[4-5]。而对于PCL损伤后关节腔内炎性细胞因子和MMPs的变化，则鲜见报道。本研究用新西兰大白兔模拟PCL损伤后的病理生理环境，通过检测PCL损伤后关节腔内炎性细胞因子含量和MMPs mRNA表达的变化，探讨PCL损伤后难以自我修复的原因。现作报道。
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新西兰大白兔80只，雌雄不限，6月龄，体质量1.80~2.23 kg，均由重庆医科大学动物实验中心饲养并提供。适应性喂养1周后，按照随机数字表法则将其分为假手术组(40只)和PCL损伤组(40只)。实验中对动物的处置过程符合国家科学技术部提出的《关于善待实验动物的指导性意见》。
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抗兔IL-1β多克隆抗体、兔IL-1β ELISA试剂盒、抗兔IL-6多克隆抗体、兔IL-6 ELISA试剂盒、抗兔IL-8多克隆抗体、兔IL-8 ELISA试剂盒、抗兔TNF-α多克隆抗体、兔TNF-α ELISA试剂盒均购自美国R & D公司。提取RNA的Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司，RT-PCR试剂盒购自美国genecopiea公司。
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配制3%(30 g/L)的戊巴比妥钠溶液，将实验兔称重后计算药物总量，沿耳缘静脉以1 mL/kg注入。麻醉成功后，将实验兔仰卧并固定于实验手术台，右后肢膝关节备皮、消毒铺巾。经髌旁内侧作2.5 cm纵行切口，逐层进入关节囊，向外牵拉髌骨至脱位，屈曲膝关节达90°暴露PCL。PCL损伤组以尖刀将PCL中段横行切断一半，之后缝合伤口；假手术组则只作髌旁内侧切口、显露PCL和缝合伤口。手术遵守无菌原则，术后常规给予青霉素40万单位肌内注射，每天1次，共3 d。
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分别选取造模术后第3、7、14和21天为标本采集的时间点，每次都采取空气栓塞的方法随机处死2组大白兔各10只，于无菌条件下在每只大白兔右后肢膝关节髌上囊处向关节腔注入0.9%氯化钠溶液1 mL，反复屈伸膝关节，抽取关节腔内的灌洗液，做上标记，-70 ℃冰箱中保存备用。同样，在无菌条件下打开大白兔右后肢膝关节囊，用眼科刀片切取关节内的滑膜组织和PCL组织，用0.9%氯化钠溶液润湿后保存备用。
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解冻关节腔内抽取的灌洗液，ELISA双抗体夹心法检测灌洗液中的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量。将标准品及待测样本加入到预先包被兔IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α抗体透明酶标反应板中，再加入酶标工作液，温育后洗涤。按ELISA试剂盒说明书依次加入底物A、B，辣根过氧化物酶催化显色后，用酶标仪于450 nm波长下测定吸光度值，再根据标准品和样本的吸光度值，计算样本中的含量。然后比较造模术后第3、7、14和21 d PCL损伤组和假手术组灌洗液中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量的变化情况。
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利用实时荧光定量PCR检测滑膜和PCL组织中MMP-1、MMP-2以及MMP-3的表达。(1)引物设计与合成：应用primer premier 5.0软件设计兔MMP-1、MMP-2以及MMP-3和内参照GAPDH的正反引物序列，并合成。(2)总RNA提取：将所取滑膜和PCL组织分别置于1 mL Trizol液中匀浆，采用TRIspin法提取总RNA，使用分光光度计将样品进行浓度检测并控制总RNA纯度。(3)反转录：将总RNA反转录为cDNA，加入1 μg总RNA和1 μL引物，DPEC去离子水将其补足至12 μL，70 ℃反应5 min，再加入4 μL反应缓冲液，1 μL RNAase抑制剂，2 μL dNTP和1 μL逆转录酶，混匀后42 ℃孵育60 min；70 ℃灭活逆转录酶10 min。(4)定量PCR扩增：SYBR Green 12.5 μL，正反引物各1 μL，cDNA 1 μL，DPEC去离子水9.5 μL，总反应体系为25 μL，用荧光实时定量PCR仪进行相应基因的扩增；解链94 ℃，15 s；退火58 ℃，15 s；延伸72 ℃，15 s；循环数控制在40个循环。反应结果以Ct值计算各基因的扩增数，GAPDH作为内参，得出目的基因的相对含量。比较造模术后第3、7、14和21天PCL损伤组和假手术组的滑膜和PCL组织中MMP-1 mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-3 mRNA表达的变化情况。
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采用t(或t′)检验。
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结果显示，造模术后，PCL损伤组灌洗液中的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量均较假手术组增高(P < 0.01)。其中，术后第3天，PCL损伤组灌洗液中的各炎性因子含量均达到高峰值，第7、14和21天，PCL损伤组灌洗液中的各炎性因子含量虽然有所下降，但仍高于假手术组，差异有统计学意义(P < 0.01)(见表 1)。
分组 n 术后第3天 术后第7天 术后第14天 术后第21天 IL-1β PCL损伤组 10 20.75±2.23 15.28±1.93 13.68±1.70 17.13±1.82 假手术组 10 5.88±1.20 5.23±0.92 4.97±0.85 5.03±1.10 t — 18.57 14.86* 14.49 17.99 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 IL-6 PCL损伤组 10 297.58±33.13 125.44±13.90 142.37±15.82 169.13±18.82 假手术组 10 67.28±9.95 59.15±9.22 62.51±9.44 64.17±9.80 t — 21.05* 12.57 13.71 15.64 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 IL-8 PCL损伤组 10 99.52±12.41 43.71±5.52 47.35±6.80 56.34±8.11 假手术组 10 22.38±2.79 19.73±2.81 20.51±2.93 21.23±3.02 t — 19.18* 12.24 11.46* 12.83* P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 TNF-α PCL损伤组 10 10.52±1.21 7.52±0.87 6.22±0.63 8.33±1.08 假手术组 10 2.31±0.47 1.57±0.26 1.36±0.21 1.44±0.28 t — 20.00* 20.72* 23.14* 19.53* P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 *示t′值 表 1 造模术后第3、7、14和21天PCL损伤组和假手术组灌洗液中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量的变化情况(x±s; pg/mL)
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结果显示，造模术后PCL损伤组滑膜组织中的MMP-1 mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-3 mRNA表达均较假手术组增高(P < 0.01)。其中，术后第3天，PCL损伤组滑膜组织中的MMPs mRNA表达均达到高峰值，第7、14和21天，PCL损伤组滑膜组织中的MMPs mRNA表达虽然有所下降，但仍高于假手术组，差异有统计学意义(P < 0.01)(见表 2)。
分组 n 术后第3天 术后第7天 术后第14天 术后第21天 MMP-1 mRNA PCL损伤组 10 4.37±0.93 2.16±0.66 2.83±0.78 3.72±0.87 假手术组 10 1.00±0.24 0.89±0.16 0.92±0.18 0.97±0.22 t′ — 11.10 5.91 7.55 9.69 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MMP-2 mRNA PCL损伤组 10 2.78±0.81 1.68±0.54 2.21±0.63 2.46±0.72 假手术组 10 1.00±0.24 0.92±0.18 0.95±0.18 0.98±0.16 t′ — 6.66 4.22 6.08 6.35 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MMP-3 mRNA PCL损伤组 10 5.37±1.26 3.12±0.96 3.87±1.05 4.24±1.14 假手术组 10 1.00±0.18 0.91±0.14 0.92±0.18 0.97±0.22 t′ — 10.86 7.20 8.76 8.91 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 表 2 造模术后第3、7、14和21天PCL损伤组和假手术组滑膜组织中MMPs mRNA表达的变化情况(x±s)
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结果显示，造模术后，PCL损伤组PCL组织中的MMP-1 mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-3 mRNA表达均较假手术组增高(P < 0.01)。其中，术后第3天，PCL损伤组PCL组织中的MMPs mRNA表达均达到高峰值，第7、14和21天，PCL损伤组PCL组织中的MMPs mRNA表达虽然有所下降，但仍高于假手术组，差异有统计学意义(P < 0.01)(见表 3)。
分组 n 术后第3天 术后第7天 术后第14天 术后第21天 MMP-1 mRNA PCL损伤组 10 3.32±0.78 1.97±0.54 2.54±0.63 3.06±0.75 假手术组 10 1.00±0.16 0.89±0.18 0.92±0.20 0.97±0.18 t′ — 9.21 6.00 7.75 8.57 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MMP-2 mRNA PCL损伤组 10 2.86±0.63 1.85±0.39 2.02±0.54 2.28±0.60 假手术组 10 1.00±0.22 0.90±0.16 0.93±0.18 0.95±0.21 t′ — 8.81 7.13 6.06 6.62 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MMP-3 mRNA PCL损伤组 10 4.61±1.05 2.88±0.81 3.24±0.94 3.82±0.96 假手术组 10 1.00±0.16 0.89±0.14 0.92±0.18 0.97±0.18 t′ — 10.75 7.66 7.67 9.23 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 表 3 造模术后第3、7、14和21天PCL损伤组和假手术组PCL组织中MMPs mRNA表达的变化情况(x±s)
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ACL与PCL损伤是临床常见的运动相关性疾病，其症状主要为关节不稳定、继发性关节内组织损伤等引发的骨性关节炎、关节疼痛、活动受限、行走困难等[6]。ACL与PCL损伤后自行修复能力较差，即便手术实施韧带修补，也不能达到持久的愈合。这与交叉韧带血供不好、断端之间的血肿机化困难以致于难以形成有效的瘢痕连接和损伤后关节腔内微环境异常变化等因素有关[7]。在关节腔内微环境的变化中，特别是由于级联反应引发炎症细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等)介导的MMPs过表达，起到了促进细胞外基质过度降解的作用，不利于韧带修复[8]。
本研究中，对大白兔行造模术后，PCL损伤组灌洗液中的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量均较假手术组增高，术后第3天，PCL损伤组灌洗液中的各炎性细胞因子含量均达到高峰值，第7、14和21天，PCL损伤组灌洗液中的各炎性因子含量虽然有所下降，但仍高于假手术组，说明PCL损伤后，关节腔内微环境中，的确存在炎症细胞因子的过表达。机体损伤之后通常伴有急性炎症反应，炎症因子在机体损伤的修复机制中特别是急性炎症反应期间具有重要调控作用[9]。有学者在研究ACL损伤后，发现炎症细胞因子(IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等)的含量呈时间依赖性增高[10]。一般来说，急性炎症反应的持续时间可至损伤后24~48 h，也有可能会到2~3周[11]，因此炎症细胞因子含量增高的持续时间也应与之相当，本研究的结果与之相同。
至于是否存在炎症细胞因子介导后的MMPs过表达，本研究在检测MMPs活性时主要以MMP-1、MMP-2和MMP-3为主，在对PCL损伤后滑膜和PCL组织中的MMPs mRNA进行提取后，希望通过检测MMPs mRNA的变化，反应出MMPs表达的改变。有研究[12]发现，ACL损伤后关节液中的MMPs表达明显增高。本研究的结果发现，造模术后，PCL损伤组滑膜组织中的MMP-1 mRNA、MMP-2 mRNA、MMP-3 mRNA表达均较假手术组增高，术后第3天，PCL损伤组滑膜组织中的MMPs mRNA表达均达到高峰值，第7、14和21天，PCL损伤组滑膜组织中的MMPs mRNA表达虽然有所下降，但仍高于假手术组。说明PCL损伤后，确实存在炎症细胞因子介导后的MMPs过表达，而且不仅PCL中MMPs的表达会增加，滑膜组织中MMPs的表达也会增加。机体所有组织损伤后，均会经历急性炎症反应期和瘢痕修复期等过程，ACL与PCL损伤也不例外。但是，如果ACL损伤后未得到及时治疗，关节液中持续高表达的炎症细胞因子引发MMPs的活性增加后，损伤的ACL和关节软骨等组织将被降解，最终难以自我修复[13]。而本研究的结果表明，PCL损伤后，其过程可能与之相似。
必须说明的是，本实验仅仅是对PCL损伤后膝关节变化的模拟，不能真实反映整个病理过程。PCL损伤后的急性炎症反应过程中，大量炎性细胞因子可能和损伤因素产生协同效应，共同调节包括MMP-1、MMP-2和MMP-3在内的MMPs家族所有成员的表达及激活。此外，本实验的另一个不足之处是研究时间短，仅检测了PCL损伤后3周内MMPs活性的变化，因此，仍然需要更加深入的研究来理解PCL损伤后关节内环境的变化过程和修复机制。综上所述，PCL损伤后，关节液中炎性因子增高、滑膜及PCL组织中MMPs活性增强引发的细胞外基质过度降解，可能是PCL损伤后自我修复困难的重要原因。
兔膝后交叉韧带断裂后关节内炎性细胞因子及MMPs表达的变化
Expression changes of inflammatory cytokines and MMPs in knee joint of rabbits after posterior cruciate ligament rupture
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摘要:
目的观察兔膝后交叉韧带（PCL）损伤后关节内炎性细胞因子含量和基质金属蛋白酶家族（MMPs）mRNA表达的变化，探讨PCL损伤后难以自我修复的机制。 方法将80只成年新西兰大白兔按照随机数字表法分为假手术组（40只）和PCL损伤组（40只），假手术组行右后肢髌旁内侧切口后，显露PCL，再缝合切口，PCL损伤组行右后肢髌旁内侧切口后，将PCL切断1/2，再缝合切口。分别于造模术后第3、7、14和21天随机处死假手术组和PCL损伤组的大白兔各10只，留取右后肢膝关节关节液、滑膜和PCL组织，酶联免疫吸附实验检测关节液中的白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α（TNF-α），实时荧光定量PCR检测滑膜和PCL组织中MMP-1、MMP-2、MMP-3 mRNA的表达。 结果造模术后，PCL损伤组灌洗液中的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量均较假手术组增高（P < 0.01），术后第3天，PCL损伤组灌洗液中的各炎性因子含量均达到高峰值，第7、14和21天，PCL损伤组灌洗液中的各炎性因子含量虽然有所下降，但仍高于假手术组，差异有统计学意义（P < 0.01）。造模术后，PCL损伤组的滑膜组织和PCL组织中的MMP-1、MMP-2、MMP-3 mRNA表达均较假手术组增高（P < 0.01），术后第3天，PCL损伤组的滑膜组织和PCL组织中的MMPs mRNA表达均达到高峰值，第7、14和21天，PCL损伤组的滑膜组织和PCL组织中的MMPs mRNA表达虽然有所下降，但仍高于假手术组，差异有统计学意义（P < 0.01）。 结论兔膝PCL损伤后，关节液中炎性因子增高、滑膜及PCL组织中MMPs活性增强引发的细胞外基质过度降解，可能是PCL损伤后自我修复困难的重要原因。 Abstract:ObjectiveTo observe the contents of inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, IL-8 and TNF-α) and levels of MMPs mRNA expression in knee joints of rabbits after posterior cruciate ligament (PCL) injury, and explore the mechanism of difficult repair by itself after PCL injury. MethodsEighty adult New Zealand white rabbits were divided into the sham operation group (40 rats) and PCL injury group (40 rats) according to the random number table method.The PCL was revealed after the posterior paratellar medial incision of the right posterior limb, and the incision was sutured in sham operation group.The 1/2 PCL was cut after the posterior paratellar medial incision of the right posterior limb, and the incision was sutured in PCL injury group.Ten rabbits in each group were randomly sacrificed on the 3rd, 7th, 14th and 21st day after modeling, respectively, and the knee joint fluid of right hind limb, synovial membrane and PCL tissue were harvested.The contents of inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, IL-8 and TNF-α) in joint fluid were detected using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the levels of MMP-1, MMP-2 and MMP-3 mRNA in synovial membrane and PCL tissue were detected using RT-PCR. ResultsAfter modeling, the levels of IL-1β, IL-6, IL-8 and TNF-α in joint fluid of PCL injury group increased compared with the sham operation group.On the 3rd day after modeling, the contents of inflammatory cytokines in joint fluid of PCL injury group reached the peak.On the 7th, 14th and 21st day, the contents of inflammatory cytokines in PCL injury group decreased, but which was still higher than those in sham operation group (P < 0.01).After modeling, the levels of MMP-1, MMP-2 and MMP-3 mRNA expression in synovial and PCL tissue of PCL injury group increased compared with the sham operation group.On the 3rd day after modeling, the levels of MMPs mRNA expression of PCL injury group reached the peak.On the 7th, 14th and 21st day, the levels of MMPs mRNA expression in PCL injury group decreased, but which was still higher than those in sham operation group (P < 0.01). ConclusionsAfter the PCL injury of rabbits, the contents of inflammatory cytokines in joint fluid, and the enhanced activity of MMPs induces the excessive degradation of extracellular matrix in synovial tissue and PCL tissue, which may be an important cause of difficult repair by itself after PCL injury. -
表 1 造模术后第3、7、14和21天PCL损伤组和假手术组灌洗液中IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α含量的变化情况(x±s; pg/mL)
分组 n 术后第3天 术后第7天 术后第14天 术后第21天 IL-1β PCL损伤组 10 20.75±2.23 15.28±1.93 13.68±1.70 17.13±1.82 假手术组 10 5.88±1.20 5.23±0.92 4.97±0.85 5.03±1.10 t — 18.57 14.86* 14.49 17.99 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 IL-6 PCL损伤组 10 297.58±33.13 125.44±13.90 142.37±15.82 169.13±18.82 假手术组 10 67.28±9.95 59.15±9.22 62.51±9.44 64.17±9.80 t — 21.05* 12.57 13.71 15.64 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 IL-8 PCL损伤组 10 99.52±12.41 43.71±5.52 47.35±6.80 56.34±8.11 假手术组 10 22.38±2.79 19.73±2.81 20.51±2.93 21.23±3.02 t — 19.18* 12.24 11.46* 12.83* P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 TNF-α PCL损伤组 10 10.52±1.21 7.52±0.87 6.22±0.63 8.33±1.08 假手术组 10 2.31±0.47 1.57±0.26 1.36±0.21 1.44±0.28 t — 20.00* 20.72* 23.14* 19.53* P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 *示t′值 
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表 2 造模术后第3、7、14和21天PCL损伤组和假手术组滑膜组织中MMPs mRNA表达的变化情况(x±s)
分组 n 术后第3天 术后第7天 术后第14天 术后第21天 MMP-1 mRNA PCL损伤组 10 4.37±0.93 2.16±0.66 2.83±0.78 3.72±0.87 假手术组 10 1.00±0.24 0.89±0.16 0.92±0.18 0.97±0.22 t′ — 11.10 5.91 7.55 9.69 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MMP-2 mRNA PCL损伤组 10 2.78±0.81 1.68±0.54 2.21±0.63 2.46±0.72 假手术组 10 1.00±0.24 0.92±0.18 0.95±0.18 0.98±0.16 t′ — 6.66 4.22 6.08 6.35 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MMP-3 mRNA PCL损伤组 10 5.37±1.26 3.12±0.96 3.87±1.05 4.24±1.14 假手术组 10 1.00±0.18 0.91±0.14 0.92±0.18 0.97±0.22 t′ — 10.86 7.20 8.76 8.91 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
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表 3 造模术后第3、7、14和21天PCL损伤组和假手术组PCL组织中MMPs mRNA表达的变化情况(x±s)
分组 n 术后第3天 术后第7天 术后第14天 术后第21天 MMP-1 mRNA PCL损伤组 10 3.32±0.78 1.97±0.54 2.54±0.63 3.06±0.75 假手术组 10 1.00±0.16 0.89±0.18 0.92±0.20 0.97±0.18 t′ — 9.21 6.00 7.75 8.57 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MMP-2 mRNA PCL损伤组 10 2.86±0.63 1.85±0.39 2.02±0.54 2.28±0.60 假手术组 10 1.00±0.22 0.90±0.16 0.93±0.18 0.95±0.21 t′ — 8.81 7.13 6.06 6.62 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MMP-3 mRNA PCL损伤组 10 4.61±1.05 2.88±0.81 3.24±0.94 3.82±0.96 假手术组 10 1.00±0.16 0.89±0.14 0.92±0.18 0.97±0.18 t′ — 10.75 7.66 7.67 9.23 P — < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
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