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乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤之一。过去20年中国女性乳腺癌发病率呈现持续增长的趋势,预计到2030年,全球乳腺癌的发病人数和死亡人数将分别达到264万和170万[1-2]。化疗在降低乳腺癌转移率和死亡率方面发挥着至关重要的作用[3]。
紫杉醇(paclitaxel,PTX)是从红豆杉属植物提取的一种具有广谱、高效抗癌活性的二萜类化合物,能够有效抑制微管蛋白的解聚并保持其稳定,从而抑制癌细胞有丝分裂的进程,最终达到抑制肿瘤增殖的作用[4]。紫杉醇对乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌等具有良好的治疗作用,是治疗复发和转移性乳腺癌的临床一线化疗药,但存在水溶性低,生物利用度较差,不良反应大等缺点[5],同时,紫杉醇是P-糖蛋白(P-gp)底物,P-gp泵可将药物转运出细胞外从而导致肿瘤细胞耐药性的产生,也是导致乳腺癌紫杉醇化疗失败的主要原因[6]。
纳米载药系统在有效进行药物输送、提高药物靶向浓度、降低药物对正常组织的毒性和克服化疗药物耐药性等方面为化疗药物的发展提供了新的解决途径[7]。PEG-DSPE是聚乙二醇的磷脂衍生物,为两性高分子化合物,既含有亲水的聚乙二醇又含有疏水的脑磷脂,在水中的性质近似于表面活性剂,以胶束的形式存在[8]。当PEG-DSPE与脂质体混合时,其疏水端插入脂质体双分子膜,使PEG-DSPE亲油的羧基嵌入脂质体形成稳定的聚乙二醇保护层,避免了网状内皮系统对它的吞噬作用,延长了脂质体在血液中的循环时间[9]。
维生素E聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)在纳米药物系统的应用得到广泛研究。美国FDA早已批准TPGS作为一种安全的药用辅料,可广泛应用于药用处方中,在制剂中可作为增溶剂、吸收促进剂、乳化剂、增塑剂、致孔剂及固体分散体的载体等[10]。TPGS作为一种生物材料,具有良好的促进吸收作用和抗多重药耐药作用,增强细胞摄取和细胞毒性,具有良好的生物粘附性能,尤其是对ATP结合盒(ATP binding cattle,ABC)转运蛋白家族有较强的抑制作用[11]。TPGS作为一种非离子表面活性剂,不仅能够抑制ABC转运蛋白家族中的P-gp泵,其本身也是一种两亲性共聚物,具有较强的药物乳化能力,因此可将其应用于纳米混悬剂的辅助稳定剂[12]。
为了有效提高紫杉醇抗肿瘤效应,降低不良反应及提高逆转肿瘤多药耐药作用,本研究拟选用PEG-DSPE作为纳米载体,构建TPGS修饰的紫杉醇长循环胶束给药系统,考察该给药系统在体外的抗肿瘤效应及逆转多药耐药作用,为开发新型的抗癌药物给药系统提供参考依据。
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采用“薄膜分散法”制备了紫杉醇长循环胶束纳米粒,游离的紫杉醇在PBS中溶解度差,而经搭载的紫杉醇胶束在PBS中溶解性较好,分散较均匀(见图 1A)。紫杉醇胶束经负染后在电镜下观察呈圆球形,粒径30~40 nm,PCS分析水合粒径也在30 nm左右,与电镜结果一致(见图 1B、1C)。紫杉醇胶束电位为-5.4 mV,利用紫外分光光度计测得紫杉醇在胶束系统中的载药量为25.37%(见图 1D)。
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各浓度紫杉醇胶束组细胞存活率均低于紫杉醇组和对照组(P<0.01)(P<0.01)(见表 1)。
分组 0.1 μmol/L 0.5μmol/L 1μmol/L 对照组 101.44±1.86 102.21±1.31 100.68±1.99 紫杉醇组 91.09±3.74 80.94±8.72 67.52±3.73 紫杉醇胶束组 76.57±0.72** 70.30±5.70** 55.41±4.49** F 78.121 21.547 183.120 P <0.01 <0.01 <0.01 MS组内 5.997 36.753 12.682 q检验:与对照组、紫杉醇组比较**P<0.01 表 1 紫杉醇及紫杉醇胶束对乳腺癌耐药细胞存活率的影响(ni=3;x±s; %)
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采用流式分析实验对紫杉醇和紫杉醇胶束(1 μmol/L)对MCF-7/PR凋亡的影响进行了研究,与紫杉醇组比较,紫杉醇胶束组诱导乳腺癌耐药细胞株的凋亡能力更强(P<0.01) (见图 2、表 2)。
分组 n 早期凋亡率 对照组 3 1.24±0.57 紫杉醇组 3 1.96±0.25 紫杉醇胶束组 3 2.93±1.36** F — 11.67 P — <0.01 MS组内 — 0.180 q检验:与对照组、紫杉醇组比较**P<0.01 表 2 紫杉醇组与紫杉醇胶束组乳腺癌耐药细胞的凋亡率比较(x±s;%)
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采用划痕实验和Transwell实验研究了紫杉醇以及紫杉醇胶束组对乳腺癌耐药细胞侵袭及迁移能力的影响。划痕实验结果表明,与对照组相比,紫杉醇组的迁移率明显下降,而紫杉醇胶束组的迁移率下降更为明显(见图 3)。Transwell实验结果表明,相对于对照组和紫杉醇组,紫杉醇胶束组细胞的侵袭数目和迁移率均明显降低(P<0.01)(见表 3)。
分组 n 侵袭细胞数/个 迁移率/% 对照组 3 162±6.11 74.46±2.11 紫杉醇组 3 127±4.36 42.92±0.46 紫杉醇胶束组 3 97±1.53** 19.80±0.56** F — 162.449 1357.43 P — <0.01 <0.01 MS组内 — 19.556 1.664 q检验:与对照组、紫杉醇组比较**P<0.01 表 3 紫杉醇及紫杉醇胶束对乳腺癌耐药细胞侵袭和迁移的影响(x±s)
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采用蛋白质印迹实验研究紫杉醇及紫杉醇胶束对乳腺癌耐药细胞凋亡蛋白和耐药相关蛋白的影响。与对照组和紫杉醇组比较,而紫杉醇胶束组Bcl-2的表达量明显减少,Caspase-3以及Bax的表达明显增加(P<0.01)。化疗后肿瘤细胞产生的MDR常导致化疗失败。MDR与P-gp和MRP高表达相关。相对于对照组和紫杉醇组,紫杉醇胶束组能够明显抑制P-gp和MRP的表达水平(P<0.01)(见图 4、表 4)。
分组 n MRP P-gp Caspase-3 Bax Bcl-2 对照组 3 1.00±0.002 1.00±0.008 1.00±0.005 1.00±0.008 1.00±0.001 紫杉醇组 3 0.97±0.005 0.95±0.015 1.18±0.012 1.13±0.006 0.85±0.004 紫杉醇胶束组 3 0.79±0.005** 0.81±0.008** 1.33±0.010** 1.38±0.048** 0.79±0.011** F — 2107.01 256.28 902.97 139.20 704.85 P — <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 MS组内 — 0.000 0.000 0.000 0.001 0.000 q检验:与对照组、紫杉醇组比较**P<0.01 表 4 紫杉醇和紫杉醇胶束处理乳腺癌耐药细胞后对凋亡相关蛋白和耐药蛋白表达的影响(x±s)
紫杉醇长循环纳米胶束的制备及其对乳腺癌多药耐药的研究
Preparation of paclitaxel long-circulating nanomicelles and their multidrug resistance to breast cancer
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摘要:
目的制备紫杉醇长循环胶束TPGS-PEG2000-DSPE-PTX,探讨紫杉醇胶束对乳腺癌MCF-7紫杉醇耐药细胞(MCF-7/PR)增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。 方法采用薄膜分散法制备负载紫杉醇的TPGS-PEG2000-DSPE-PTX胶束,对载药胶束进行形貌、粒径、电位等表征分析;采用磺酰罗丹明B染色法、Annexin V/PI染色法以及划痕和transwell实验检测紫杉醇胶束对乳腺癌耐药细胞株增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。 结果成功构建了紫杉醇载药胶束,透射电镜可见载药胶束成圆球形,粒径30~40 nm,Zeta电位为-5.4 mV,紫外分光光度计检测并计算载药量为25.37%。与对照组和紫杉醇组比较,紫杉醇胶束组有效抑制耐药细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,上调caspase3和Bax的蛋白表达水平(P < 0.01),下调Bcl-2、P-糖蛋白和多药耐药相关蛋白的表达水平(P < 0.01)。 结论成功构建TPGS修饰的紫杉醇长循环胶束给药系统,可有效在体外发挥抗肿瘤效应及逆转多药耐药作,为开发新型的抗癌药物给药系统提供了参考依据。 Abstract:ObjectiveTo prepare paclitaxel long-circulating micelle TPGS-PEG2000-DSPE-PTX and investigate the effects of paclitaxel micelles on proliferation, apoptosis, migration and invasion of paclitaxel-resistant cells (MCF-7/PR) in breast cancer. MethodsThe paclitaxel-loaded TPGS-PEG2000-DSPE-PTX micelles were prepared by membrane dispersion method.The morphology, particle size and potential of the drug-loaded micelles were characterized..The sulfonyl rhodamine B method, flow cytometry and migration were performed.Sulfonylrhodamine B staining, Annexin V/PI staining, scratch and transwell assays were used to detect the effects of paclitaxel micelles on proliferation, apoptosis, migration, and invasion of paclitaxel resistant cell lines. ResultsPaclitaxel-loaded micelles were successfully constructed.The results of transmission electron microscopy showed that the drug-loaded micelles became spherical, with a particle size of 30-40 nm and a zeta potential of -5.4 mV.The UV spectrophotometer detected and calculated the drug loading amount to 25.37%.Compared with the control group and the paclitaxel group, the TPGS-PEG2000-DSPE-PTX group effectively inhibited the proliferation, migration and invasion of drug-resistant cells, induced apoptosis, up-regulated the protein expression levels of caspase3 and Bax(P < 0.01), and down-regulated Bcl-2, P-gp and MRP protein expression levels(P < 0.01). ConclusionsThe successful construction of TPGS modified paclitaxel long-circulating micelle delivery system can effectively exert anti-tumor effect and reverse multi-drug resistance in vitro, and provide a reference for the development of a new anti-cancer drug delivery system. -
Key words:
- breast neoplasms /
- nano drug-loaded /
- spherical micelle /
- paclitaxel
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表 1 紫杉醇及紫杉醇胶束对乳腺癌耐药细胞存活率的影响(ni=3;x±s; %)
分组 0.1 μmol/L 0.5μmol/L 1μmol/L 对照组 101.44±1.86 102.21±1.31 100.68±1.99 紫杉醇组 91.09±3.74 80.94±8.72 67.52±3.73 紫杉醇胶束组 76.57±0.72** 70.30±5.70** 55.41±4.49** F 78.121 21.547 183.120 P <0.01 <0.01 <0.01 MS组内 5.997 36.753 12.682 q检验:与对照组、紫杉醇组比较**P<0.01 表 2 紫杉醇组与紫杉醇胶束组乳腺癌耐药细胞的凋亡率比较(x±s;%)
分组 n 早期凋亡率 对照组 3 1.24±0.57 紫杉醇组 3 1.96±0.25 紫杉醇胶束组 3 2.93±1.36** F — 11.67 P — <0.01 MS组内 — 0.180 q检验:与对照组、紫杉醇组比较**P<0.01 表 3 紫杉醇及紫杉醇胶束对乳腺癌耐药细胞侵袭和迁移的影响(x±s)
分组 n 侵袭细胞数/个 迁移率/% 对照组 3 162±6.11 74.46±2.11 紫杉醇组 3 127±4.36 42.92±0.46 紫杉醇胶束组 3 97±1.53** 19.80±0.56** F — 162.449 1357.43 P — <0.01 <0.01 MS组内 — 19.556 1.664 q检验:与对照组、紫杉醇组比较**P<0.01 表 4 紫杉醇和紫杉醇胶束处理乳腺癌耐药细胞后对凋亡相关蛋白和耐药蛋白表达的影响(x±s)
分组 n MRP P-gp Caspase-3 Bax Bcl-2 对照组 3 1.00±0.002 1.00±0.008 1.00±0.005 1.00±0.008 1.00±0.001 紫杉醇组 3 0.97±0.005 0.95±0.015 1.18±0.012 1.13±0.006 0.85±0.004 紫杉醇胶束组 3 0.79±0.005** 0.81±0.008** 1.33±0.010** 1.38±0.048** 0.79±0.011** F — 2107.01 256.28 902.97 139.20 704.85 P — <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 MS组内 — 0.000 0.000 0.000 0.001 0.000 q检验:与对照组、紫杉醇组比较**P<0.01 -
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