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动脉粥样硬化是导致心血管疾病的主要原因之一,涉及代谢紊乱、遗传易感性、环境、细胞功能紊乱等多因素的慢性炎症。大动脉脂质沉积、发生纤维化以及巨噬细胞源性泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化的主要病理特点[1]。其中血管壁内皮细胞下的脂质沉积发生内质网应激(ERS)也是导致动脉粥样硬化发生的重要因素之一[2]。内质网(ER)广泛存在于真核细胞当中,是细胞内信号转导的重要调节位点,在蛋白质的成熟、正确折叠、维持钙离子稳态等方面起着重要的作用[3]。遗传或者环境损伤会引起的细胞内钙稳态失衡、氧化应激、营养缺乏、蛋白质的异常累积和蛋白质的错误折叠等均会造成ER功能的破坏,从而诱发ERS。ERS持续时间过久或者程度过强,则最终引起细胞的凋亡与死亡[4]。黄连碱是传统中药黄连的有效成分之一,具有调节血脂[5]、抗缺血再灌注损伤[6]、抑制血管平滑肌增殖[7]、抗粥样动脉硬化[6]等药理作用,有广泛的临床研究价值。研究[8]表明黄连碱可以通过降低低密度脂蛋白-胆固醇(LDL-C)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)等抑制粥样动脉硬化,但未见其在ERS方面的相关研究,本文就黄连碱对HUVECs的作用进行探讨。
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浓度在1~20 μmol/L范围内的黄连碱干预24 h,HUVECs的活性差异无统计学意义(P>0.05),而>25 μmol/L显著降低HUVECs的活性(P < 0.01)(后续实验黄连碱的浓度均采用20 μmol/L)(见表 1)。浓度为20 μmol/L黄连碱作用24 h后,对TM诱导的HUVECs活性具有保护作用(见表 2)。
浓度/(μmol/L) n 细胞存活率/% F P MS组内 0 4 99.97±2.07 10 4 98.78±1.87 20 4 98.23±0.87 168.87 < 0.01 5.500 25 4 80.72±3.82**##▲▲ 30 4 65.34±2.09**##▲▲■■ q检验:与0 μmol/L组比较**P < 0.01;与10 μmol/L组比较##P < 0.01;与20 μmol/L组比较▲▲P < 0.01;与25 μmol/L组比较■■P < 0.01 表 1 CCK8法检测不同浓度黄连碱对HUVECs活性的影响
分组 n 细胞存活率/% F P MS组内 对照组 3 99.98±0.34 TM 3 64.33±1.77** 607.33 < 0.01 1.433 TM+Cop 3 82.57±1.34**## Cop 3 99.99±0.83##▲▲ q检验:与对照组比较**P<0.01;与TM组比较##P < 0.01;与TM+Cop组比较▲▲P < 0.01 表 2 黄连碱对TM诱导后的HUVECs活性的影响
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加入TM诱导18 h后,HUVECs中CHOP、GRP78 mRNA水平表达较对照组相比明显升高(P < 0.01)(见表 3、4),表明HUVECsERS模型构建成功。Wesrern blotting结果与RT-PCR结果相符合,相同处理条件下,TM可以显著升高HUVECs中CHOP、GRP78蛋白表达水平(P < 0.01)(见表 5、6)。另外通过细胞免疫荧光检测,结果与Wesrern blotting结果相一致(P < 0.01)(见表 7、8)。
分组 n 相对表达量 F P MS组内 对照组 3 1.02±0.12 TM 3 1.63±0.01** 55.55 < 0.01 0.005 TM+Cop 3 1.15±0.03## Cop 3 0.99±0.06## q检验:与对照组比较**P<0.01;与TM组比较##P<0.01,##P < 0.01 表 3 qPCR检测各组细胞中CHOP mRNA的表达情况
分组 n 相对表达量 F P MS组内 对照组 3 1.05±0.07 TM 3 1.59±0.04** 84.35 < 0.01 0.004 TM+Cop 3 1.25±0.04## Cop 3 0.79±0.09*## ▲▲ q检验:与对照组比较*P<0.05,**P<0.01;与TM组比较##P < 0.01;与TM+Cop组比较▲▲P < 0.01 表 4 qPCR检测各组细胞中GRP98 mRNA的表达情况
分组 n 相对表达量 F P MS组内 对照组 3 0.45±0.017 TM 3 1.04±0.033** 174.18 < 0.01 0.001 TM+Cop 3 0.48±0.013## Cop 3 0.55±0.061## q检验:与对照组比较**P < 0.01;与TM组比较##P < 0.01 表 5 Western Blotting检测各组细胞中CHOP蛋白的表达情况
分组 n 相对表达量 F P MS组内 对照组 3 0.45±0.015 TM 3 0.65±0.018** 101.99 < 0.01 0.001 TM+Cop 3 0.56±0.016**## Cop 3 0.49±0.010##▲ q检验:与对照组比较**P < 0.01;与TM组比较##P < 0.01;与TM+Cop组比较▲P < 0.05 表 6 Western Blotting检测各组细胞中GRP78蛋白的表达情况
分组 n 阳性率/% F P MS组内 对照组 3 39.92±1.20 TM 3 71.85±1.11** 190.18 < 0.01 3.496 TM+Cop 3 42.15±1.50## Cop 3 45.06±3.01## q检验:与对照组比较**P < 0.01;与TM组比较##P < 0.01 表 7 细胞免疫荧光检测各组细胞中CHOP蛋白表达阳性细胞率
分组 n 阳性率/% F P MS组内 对照组 3 24.55±3.26 TM 3 68.41±2.31** 187.89 < 0.01 6.626 TM+Cop 3 28.99±1.46## Cop 3 30.37±2.90## q检验:与对照组比较**P < 0.01;与TM组比较##P < 0.01 表 8 细胞免疫荧光检测各组细胞中GRP78蛋白表达阳性细胞率
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加入TM诱导18 h,再加入黄连碱继续诱导24 h后,发现黄连碱可以显著抑制TM所诱导的HUVECs中CHOP、GRP78 mRNA水平的表达增高(P < 0.01)(见表 3、4)。
Wesrern blotting和细胞免疫荧光结果与RT-PCR结果相吻合,黄连碱可以抑制TM所诱导的HUVECs中CHOP、GRP78蛋白水平表达的升高(P < 0.01)(见表 5~8)。
黄连碱对人脐静脉内皮细胞内质网应激的影响
Effect of coptisine on endoplasmic reticulum stress in human umbilical vein endothelial cells
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摘要:
目的 建立人脐静脉内皮细胞(HUVECs)内质网应激细胞模型,观察黄连碱对HUVECs以及内质网模型细胞生长活性的影响,对CHOP、GRP78基因以及蛋白表达的影响。 方法 使用10 μg/mL的衣霉素诱导HUVECs 18 h后,加入不同浓度的黄连碱再处理24 h。CCK8法检测不同浓度黄连碱对HUVECs的活性影响以及黄连碱对衣霉素诱导后的HUVECs的活性影响;采用RT-RCR法比较各组细胞中CHOP、GRP78的mRNA的表达情况;采用Western blotting和细胞免疫荧光法比较各组细胞中CHOP,GRP78的蛋白表达情况。 结果 随着黄连碱浓度的增加,在1~20 μmol/L范围内的黄连碱对HUVECs的活性无影响,浓度为20 μmol/L黄连碱作用24 h后,对衣霉素诱导的HUVECs活性具有保护作用(P < 0.01)。加入衣霉素诱导18 h,HUVECs中CHOP、GRP78 mRNA水平的表达增高(P < 0.01),再加入黄连碱继续诱导24 h后,黄连碱可以抑制衣霉素所诱导的HUVECs中CHOP、GRP78 mRNA水平的表达增高(P < 0.01)。加入衣霉素诱导18 h,HUVECs中CHOP、GRP78蛋白水平的表达增高(P < 0.01),再加入黄连碱继续诱导24 h后,发现黄连碱可以抑制衣霉素所诱导的HUVECs中CHOP、GRP78蛋白水平的表达增高(P < 0.01),与衣霉素诱导组相比数据具有统计学意义,细胞免疫荧光染色结果与Western blotting结果相似。 结论 黄连碱可以减轻由衣霉素诱导的HUVECs过度内质网应激反应,并可提高受损细胞的活性;并可通过下调CHOP、GRP78的表达改善HUVECs过度内质网应激反应。 Abstract:Objective To endoplasmic reticulum stress cell model of human umbilical vein endothelial cells(HUVECs), to estoblish observe the effects of coptisine on the growth activity of HUVECs cells, and expression levels of CHOP and GRP78 gene and protein. Methods HUVECs were induced by tunicamycin(TM) at a concentration of 10 μg/mL for 18 h, and then treated with coptisine at different concentrations for 24 h.The CCK8 was used to detect the effects of different concentrations of coptisine on the activity of HUVECs and activity of HUVECs induced by TM.The mRNA expression levels of CHOP and GRP78 in each group were detected using RT-PCR.The protein expression levels of CHOP and GRP78 in each group were detected using Western blotting and cellular immunofluorescence. >Results With the concentration of coptisine increasing, the coptisine in the range of 1-20 μmol/L had no effect on the activity of HUVECs.After 24 hours, the concentration of coptisine in the range of 20 μmol/L played a protective effect on the activity of HUVECs induced by TM(P < 0.01).The mRNA expression levels of CHOP and GRP78 in HUVECS increased after 18 hours of TM induction(P < 0.01), after 24 hours of continuous induction with coptisine, it was found that coptisine could inhibit the mRNA expressions of CHOP and GRP78 in TM-induced HUVECs(P < 0.01).The protein expression levels of CHOP and GRP78 in HUVECs increased after 18 hours of TM induction(P < 0.01), and after 24 hours of continuous induction with coptisine, it was found that coptisine could inhibit the protein expression levels of CHOP and GRP78 in TM-induced HUVECs(P < 0.01).The results of cellular immunofluorescence staining were similar to those of Western blotting. Conclusions Coptisine can alleviate the excessive ER stress induced by TM in HUVECs, and improve the activity of damaged cells.Coptisine can improve the excessive ER stress response of HUVECs by down-regulating the expressions of CHOP and GRP78. -
表 1 CCK8法检测不同浓度黄连碱对HUVECs活性的影响
浓度/(μmol/L) n 细胞存活率/% F P MS组内 0 4 99.97±2.07 10 4 98.78±1.87 20 4 98.23±0.87 168.87 < 0.01 5.500 25 4 80.72±3.82**##▲▲ 30 4 65.34±2.09**##▲▲■■ q检验:与0 μmol/L组比较**P < 0.01;与10 μmol/L组比较##P < 0.01;与20 μmol/L组比较▲▲P < 0.01;与25 μmol/L组比较■■P < 0.01 表 2 黄连碱对TM诱导后的HUVECs活性的影响
分组 n 细胞存活率/% F P MS组内 对照组 3 99.98±0.34 TM 3 64.33±1.77** 607.33 < 0.01 1.433 TM+Cop 3 82.57±1.34**## Cop 3 99.99±0.83##▲▲ q检验:与对照组比较**P<0.01;与TM组比较##P < 0.01;与TM+Cop组比较▲▲P < 0.01 表 3 qPCR检测各组细胞中CHOP mRNA的表达情况
分组 n 相对表达量 F P MS组内 对照组 3 1.02±0.12 TM 3 1.63±0.01** 55.55 < 0.01 0.005 TM+Cop 3 1.15±0.03## Cop 3 0.99±0.06## q检验:与对照组比较**P<0.01;与TM组比较##P<0.01,##P < 0.01 表 4 qPCR检测各组细胞中GRP98 mRNA的表达情况
分组 n 相对表达量 F P MS组内 对照组 3 1.05±0.07 TM 3 1.59±0.04** 84.35 < 0.01 0.004 TM+Cop 3 1.25±0.04## Cop 3 0.79±0.09*## ▲▲ q检验:与对照组比较*P<0.05,**P<0.01;与TM组比较##P < 0.01;与TM+Cop组比较▲▲P < 0.01 表 5 Western Blotting检测各组细胞中CHOP蛋白的表达情况
分组 n 相对表达量 F P MS组内 对照组 3 0.45±0.017 TM 3 1.04±0.033** 174.18 < 0.01 0.001 TM+Cop 3 0.48±0.013## Cop 3 0.55±0.061## q检验:与对照组比较**P < 0.01;与TM组比较##P < 0.01 表 6 Western Blotting检测各组细胞中GRP78蛋白的表达情况
分组 n 相对表达量 F P MS组内 对照组 3 0.45±0.015 TM 3 0.65±0.018** 101.99 < 0.01 0.001 TM+Cop 3 0.56±0.016**## Cop 3 0.49±0.010##▲ q检验:与对照组比较**P < 0.01;与TM组比较##P < 0.01;与TM+Cop组比较▲P < 0.05 表 7 细胞免疫荧光检测各组细胞中CHOP蛋白表达阳性细胞率
分组 n 阳性率/% F P MS组内 对照组 3 39.92±1.20 TM 3 71.85±1.11** 190.18 < 0.01 3.496 TM+Cop 3 42.15±1.50## Cop 3 45.06±3.01## q检验:与对照组比较**P < 0.01;与TM组比较##P < 0.01 表 8 细胞免疫荧光检测各组细胞中GRP78蛋白表达阳性细胞率
分组 n 阳性率/% F P MS组内 对照组 3 24.55±3.26 TM 3 68.41±2.31** 187.89 < 0.01 6.626 TM+Cop 3 28.99±1.46## Cop 3 30.37±2.90## q检验:与对照组比较**P < 0.01;与TM组比较##P < 0.01 -
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