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卵巢恶性肿瘤发病率在女性生殖器肿瘤中占第三位，但其死亡率是最高的, 严重威胁女性健康[1]。当病人发生不适就诊时，大多数已进入晚期。虽然近几十年来，已经成功探索出在肿瘤细胞减灭术基础上辅助化疗的治疗策略，但晚期卵巢癌的5年生存率仍然很低。因此，发现卵巢癌的早期诊断方法、探索其发生、发展机制具有重要临床价值。微小RNA (microRNA, miR)是一类内生的、长度为20~24个核苷酸的小RNA[2]，其通过降解靶基因mRNA或抑制其翻译，在转录后水平调控基因的表达进而发挥功能。随着对miR研究的深入，人们发现其在肿瘤的发生、发展中发挥重要的作用，包括肿瘤细胞的增殖、侵袭与凋亡转移等。有研究[3]表明，miR-506在宫颈癌中低表达，可显著抑制宫颈癌细胞的转移能力。而miR-873在卵巢癌组织与细胞中的表达明显高于正常组织和细胞，其通过靶向ABCB1介导卵巢癌的耐药[4]。miR作为肿瘤治疗的靶点越来越受到人们的重视。近来有报道[5-6]发现miR-655在多种肿瘤中的表达下调，可能在肿瘤发生过程中发挥着抑癌的作用，但其在卵巢癌发生、发展中的作用及机制尚未见报道。本研究采用RT-PCR、CCK-8以及流式细胞术方法检测上皮性卵巢癌组织以及细胞中miR-655表达量以及调节miR-655对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响，并通过Western blotting研究其相关分子机制。现作报道。
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标本采自2010年1月至2015年1月经我院妇科行手术切除治疗的上皮性卵巢癌病人40例，另选取正常卵巢组织40例(来自子宫肌瘤或卵巢良性肿瘤需切除全子宫及卵巢的病人)，术后均经我院病理科确诊。入组病人术前均未接受过放疗、化疗或激素治疗。组织标本离体后切取并迅速置于液氮罐内-80 ℃保存备用。本研究获得我院伦理委员会批准并征得病人及家属的知情同意。
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应用miR特异性TaqMan探针和TaqMan Universal PCR Master Mix进行miR-655的实时定量PCR检测。反应在ABI StepOne Plus Detection system进行，扩增条件为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃延伸1 min，扩增40个循环。选择U6作为内参，2-△△CT(CT示循环阈值，△CT=CTmiR-655-CTU6)计算miR-655相对表达量。肿瘤组织中miR-655表达高于对应癌旁组织为高表达组，反之为低表达组。
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人卵巢癌细胞SKOV3和A2780及正常上皮细胞IOSE80购于上海中国科学院细胞库，所有细胞均采用DMEM培养基加10%胎牛血清及1%青、链霉素培养，培养环境为37 ℃、5%CO2湿化培养箱。
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转染前24 h将细胞以40%~50%密度铺于6孔板中，运用miR-655 mimics(GenePharma公司)、Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)转染试剂上调miR-655。转染6 h后更换新鲜培养基继续孵育。24~48 h后收集细胞检测转染效率并进行功能试验。
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采用CCK-8方法检测细胞增殖能力。细胞转染后24 h，将细胞按每孔3 000个接种于96孔板，分别于24、48、72、96 h进行检测，在酶标仪上以波长450 nm测各孔的吸光度值，以上实验重复3次。
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转染后48 h收集6孔板中细胞，冰PBS洗涤两遍后加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶(PI)室温避光15 min，用流式细胞仪分析，以上实验重复3次。
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用RIPA裂解细胞，提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量，加入蛋白上样缓冲液后100 ℃煮10 min。SDS-PAGE进行电泳分离后，采用湿转膜法转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次15 min, 加入二抗孵育2 h，PBST洗3次，每次15 min，加入发光反应液，凝胶电泳成像系统进行读片分析，实验重复3次。
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采用t检验、方差分析和χ2检验。
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首先检测了miR-655在40对卵巢癌及正常组织中的表达情况，结果显示癌组织中miR-655表达量(0.16±0.03)明显低于正常组织(0.33±0.04)(t=21.50，P < 0.01)。进一步检测miR-655在细胞中的表达情况，结果显示，卵巢癌细胞SKOV3和A2780中miR-655表达均明显低于正常细胞IOSE80(P < 0.01)(见表 1)。
分组 MiR-655相对表达量 F P MS组内 IOSE80 0.42±0.05 SKOV3 0.10±0.05** 8.95 < 0.01 0.001 A2780 0.06±0.01** q检验：与IOSE80比较** P < 0.01 表 1 卵巢癌细胞与正常细胞中miR-655的表达比较(ni=3；x±s)
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以卵巢癌病人miR-655相对表达量中位数为参照，将miR-655表达分为高表达组18例和低表达组22例，进一步分析miR-655相对表达量与卵巢癌病人临床资料之间的关系，结果显示，miR-655表达水平在不同肿瘤大小、病理分化程度和是否淋巴结转移病人间差异均有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01)，而不同年龄、CA-125病人间miR-655表达差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 2)。
特征 miR-655高表达(n=18) miR-655低表达(n=22) χ2 P 年龄/岁 < 55
≥ 559(50.00)
9(50.00)8(36.36)
14(63.64)0.75 ＞0.05 肿瘤直径/cm < 3
≥312(66.67)
6(33.33)6(27.27)
16(72.73)6.21 < 0.05 CA-125/(U/mL) < 500
≥50011(61.11)
7(38.89)9(40.91)
13(59.09)1.62 ＞0.05 淋巴结转移 有
无10(55.56)
8(44.44)5(22.73)
17(77.27)4.55 < 0.05 病理分化程度 高、中
低14(77.78)
4(22.22)7(31.82)
15(68.18)8.39 < 0.01 表 2 miR-655相对表达与卵巢癌病人临床病理特征的关系[n；百分率(%)]
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为探讨miR-655在卵巢癌细胞中的作用，首先对A2780和SKOV3两株细胞进行miR-655过表达，通过RT-PCR验证miR-655的转染效率，结果显示，SKOV3和A2780细胞中miR-655表达量在转染后均明显高于转染前(P < 0.01)(见表 3)。
细胞系 转染前 转染后 t P SKOV3 0.064±0.013 1.413±0.013 127.09 < 0.01 A2780 0.159±0.088 1.432±0.062 20.48 < 0.01 表 3 miR-655过表达后细胞内的miR-655相对表达水平(ni=3；x±s)
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转染miR-655 mimics后24、48、72 h，卵巢癌细胞A2780和SKOV3细胞增殖均明显低于未转染组，miR-655上调明显抑制SKOV3和A2780细胞生长(P < 0.01)(见表 4)。
分组 0 h 24 h 48 h 72 h F P MS组内 SKOV3 未转染 0.48±0.04 0.90±0.04 1.46±0.06 1.90±0.04 6.78 < 0.05 0.17 转染 0.50±0.04 0.65±0.03 0.90±0.04 1.25±0.07 8.62 < 0.01 0.038 t 0.61 8.66 13.45 13.96 — — — P ＞0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 — — — A2780 未转染 0.96±0.05 1.54±0.06 1.96±0.06 2.39±0.07 12.56 < 0.01 0.09 转染 0.97±0.05 1.23±0.06 1.45±0.07 1.74±0.07 9.92 < 0.01 0.03 t 0.24 6.33 9.58 11.37 — — — P ＞0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 — — — 表 4 转染与未转染miR-655 mimics卵巢癌细胞增殖比较(ni=3；x±s)
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转染miR-655 mimics后，卵巢癌细胞SKOV3和A2780的细胞凋亡明显高于未转染组，miR-655上调明显促进SKOV3和A2780细胞凋亡(P < 0.01)(见表 5)。
分组 SKOV3 A2780 未转染 3.78±0.51 4.14 ±0.49 转染 10.53±0.51 13.35±1.21 t 16.24 12.24 P < 0.01 < 0.01 表 5 miR-655过表达与对照组凋亡细胞数(ni=3；x±s)
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为进一步探讨，miR-655调节卵巢癌细胞生长，凋亡的分子机制，采用Western blotting检测A2780和SKOV3细胞在转染miR-655 mimics之后PI3K/AKT/mTOR信号通路活性的变化，结果表明，miR-655过表达可明显降低PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平(P < 0.01)(见表 6)。
分组 p-PI3K p-AKT p-mTOR SKOV3 转染前 0.32±0.01 0.38±0.001 0.41±0.01 转染后 0.21±0.01 0.23±0.009 0.23±0.001 t 13.47 28.69 31.02 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 A2780 转染前 0.25±0.03 0.39±0.010 0.55±0.030 转染后 0.15±0.01 0.16±0.020 0.12±0.001 t 5.48 17.82 24.81 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 表 6 miR-655过表达后PI3K/AKT/mTOR信号通路活性的变化(ni=3)
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卵巢癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。早期卵巢癌的治疗可取得较好的疗效，然而对于进展期的病人由于明显的耐药以及早期复发仍无有效的治疗方法[7]。由于卵巢位于盆腔深部，早期没有明显症状，多数病人诊断时在中期或晚期，5年存活率约30%[8]。而卵巢癌预后差的主要原因是早期诊断难、容易产生耐药和复发[9]。因此，发现卵巢癌的诊断指标、探索其增殖机制具有一定临床价值，为临床治疗提供治疗靶点。
miR-655是近年来新报道的一个小分子RNA，已有研究显示miR-655在一些肿瘤中低表达，起到抑制肿瘤的作用。有研究[5]表明miR-655在乳腺重度不典型增生和乳腺癌病人血浆中的表达明显低于健康人群，在乳腺癌的早期诊断中具有一定的临床价值。HARAZONO等[10]研究显示miR-655通过靶向调节ZEB1和TGFBR2抑制上皮间质转化的发生抑制肿瘤细胞的发生、发展。本研究通过实时定量-PCR检测miR-655在卵巢癌组织中的表达量显著低于正常组织，且不同肿瘤直径、淋巴结是否转移及分级病人的miR-655表达水平差异有统计学意义，而不同CA-125及年龄病人miR-655表达水平差异无统计学意义。为进一步研究其在卵巢癌中的作用，我们检测了其在卵巢癌细胞株中的表达情况，结果显示miR-655在卵巢癌细胞SKOV3和A2780的表达较正常卵巢上皮细胞明显降低。转染miR-655 mimics至SKOV3和A2780细胞，通过CCK-8以及流式细胞术检测miR-655对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响，结果发现过表达miR-655可显著抑制细胞的生长并促进凋亡。以上结果表明miR-655在卵巢癌中发挥同其他肿瘤一样的抑癌作用。
PI3K/AKT/mTOR信号通路在肿瘤的发生发展起重要的作用，该通路的异常活化可明显促进肿瘤细胞的生长、转移并抑制其凋亡[11-12]。例如Annexin A5通过活化AKT/mTOR，在体内外促进肾癌细胞的增殖、侵袭与转移[13]，而达努塞替可通过抑制AKT/mTOR通路诱导卵巢癌细胞的凋亡、阻断细胞周期，发挥抑癌作用[14]。因此，本实验探讨miR-655是否通过该通路发挥作用，结果表明当SKOV3和A2780细胞转染miR-655 mimics后，PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平明显降低。
综上所述，miR-655在卵巢癌中的表达量明显降低，在卵巢癌的生长与凋亡过程中发挥重要作用，其潜在机制可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥抑制卵巢癌的作用。
miR-655在上皮性卵巢癌中的表达研究
Study on the miR-655 expression in epithelial ovarian cancer
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摘要:
目的探讨微小RNA（microRNA，miR）-655在上皮性卵巢癌中的表达、作用及其可能的分子机制。 方法采用实时定量-PCR检测miR-655在40对上皮性卵巢癌组织和正常组织中的表达，分析miR-655表达水平与临床病理之间的关系。Cell Counting Kit-8（CCK-8）和流式细胞术检测miR-655对卵巢癌细胞增殖及凋亡的影响。Western blotting检测PI3K、AKT和mTOR蛋白的表达。 结果miR-655在上皮性卵巢癌组织中的表达量明显低于正常组织（P < 0.01）。miR-655表达水平在不同肿瘤直径、病理分化程度和是否淋巴结转移病人间差异均有统计学意义（P < 0.05~P < 0.01），而不同年龄、CA-125病人间miR-655 mimics表达差异均无统计学意义（P>0.05）。转染miR-655 mimics可明显抑制卵巢癌细胞的增殖并促进细胞的凋亡（P < 0.01）；miR-655 mimics转染明显抑制卵巢癌细胞中PI3K、AKT和mTOR活性（P < 0.01）。 结论miR-655在卵巢癌组织中明显低表达，miR-655低表达可能与卵巢癌的肿瘤生长和分化程度相关，miR-655可明显抑制卵巢癌细胞的增殖，并促进其凋亡，其在卵巢癌病人中具有一定的靶向治疗价值。 Abstract:ObjectiveTo investigate the expression level, function and possible molecular mechanism of microRNA (miR)-655 in epithelial ovarian cancer. MethodsThe expression levels of miR-655 in 40 cases of epithelial varian cancer tissues and normal tissues were detected using real-time quantitative-PCR, and the relationship between miR-655 expression and clinicopathological features was analyzed.The cell counting Kit-8(CCK-8) and flow cytometry were used to detect the effects of miR-655 on the proliferation and apoptosis of ovarian cancer cells.Western blotting was used to detect the expression of PI3K, AKT and mTOR. ResultsThe expression level of miR-655 in epithelial ovarian carcinoma was significantly lower than that in normal tissues(P < 0.01).The differences of the expression levels of miR-655 among patients with different tumor diameter, degree of pathological differentiation and lymph node metastasis were statistically significant(P < 0.05 to P < 0.01), and the differences of the expression levels of miR-655 among patients with different ages and CA-125 were not statistically significant(P>0.05).The transfection of miR-655 mimics could significantly inhibit the proliferation and promote apoptosis of ovarian cancer cells(P < 0.01).The transfection of MiR-655 mimics significantly could significantly inhibit the expression of PI3K, AKT and mTOR in ovarian cancer cells(P < 0.01). ConclusionsThe low expression of miR-65 in ovarian cancer tissue is significant, which may be related to the growth and differentiation of ovarian cancer.miR-655 can significantly inhibit the proliferation and induce apoptosis of ovarian cancer cells.miR-655 has a certain value of target therapy in ovarian cancer patients. -
Key words:
- ovarian neoplasms /
- miR-655 /
- proliferation /
- apoptosis
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表 1 卵巢癌细胞与正常细胞中miR-655的表达比较(ni=3；x±s)
分组 MiR-655相对表达量 F P MS组内 IOSE80 0.42±0.05 SKOV3 0.10±0.05** 8.95 < 0.01 0.001 A2780 0.06±0.01** q检验：与IOSE80比较** P < 0.01 
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表 2 miR-655相对表达与卵巢癌病人临床病理特征的关系[n；百分率(%)]
特征 miR-655高表达(n=18) miR-655低表达(n=22) χ2 P 年龄/岁 < 55
≥ 559(50.00)
9(50.00)8(36.36)
14(63.64)0.75 ＞0.05 肿瘤直径/cm < 3
≥312(66.67)
6(33.33)6(27.27)
16(72.73)6.21 < 0.05 CA-125/(U/mL) < 500
≥50011(61.11)
7(38.89)9(40.91)
13(59.09)1.62 ＞0.05 淋巴结转移 有
无10(55.56)
8(44.44)5(22.73)
17(77.27)4.55 < 0.05 病理分化程度 高、中
低14(77.78)
4(22.22)7(31.82)
15(68.18)8.39 < 0.01
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表 3 miR-655过表达后细胞内的miR-655相对表达水平(ni=3；x±s)
细胞系 转染前 转染后 t P SKOV3 0.064±0.013 1.413±0.013 127.09 < 0.01 A2780 0.159±0.088 1.432±0.062 20.48 < 0.01
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表 4 转染与未转染miR-655 mimics卵巢癌细胞增殖比较(ni=3；x±s)
分组 0 h 24 h 48 h 72 h F P MS组内 SKOV3 未转染 0.48±0.04 0.90±0.04 1.46±0.06 1.90±0.04 6.78 < 0.05 0.17 转染 0.50±0.04 0.65±0.03 0.90±0.04 1.25±0.07 8.62 < 0.01 0.038 t 0.61 8.66 13.45 13.96 — — — P ＞0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 — — — A2780 未转染 0.96±0.05 1.54±0.06 1.96±0.06 2.39±0.07 12.56 < 0.01 0.09 转染 0.97±0.05 1.23±0.06 1.45±0.07 1.74±0.07 9.92 < 0.01 0.03 t 0.24 6.33 9.58 11.37 — — — P ＞0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 — — —
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表 5 miR-655过表达与对照组凋亡细胞数(ni=3；x±s)
分组 SKOV3 A2780 未转染 3.78±0.51 4.14 ±0.49 转染 10.53±0.51 13.35±1.21 t 16.24 12.24 P < 0.01 < 0.01
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表 6 miR-655过表达后PI3K/AKT/mTOR信号通路活性的变化(ni=3)
分组 p-PI3K p-AKT p-mTOR SKOV3 转染前 0.32±0.01 0.38±0.001 0.41±0.01 转染后 0.21±0.01 0.23±0.009 0.23±0.001 t 13.47 28.69 31.02 P < 0.01 < 0.01 < 0.01 A2780 转染前 0.25±0.03 0.39±0.010 0.55±0.030 转染后 0.15±0.01 0.16±0.020 0.12±0.001 t 5.48 17.82 24.81 P < 0.01 < 0.01 < 0.01
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