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硫化氢对糖尿病大鼠空间学习记忆和海马组织氧化应激的影响

贾强 李焱 刘小粉 王元元 杨锐 马善峰

引用本文:
Citation:

硫化氢对糖尿病大鼠空间学习记忆和海马组织氧化应激的影响

    作者简介: 贾强(1976-), 男, 硕士, 讲师
    通讯作者: 马善峰, msfbio@163.com
  • 基金项目:

    安徽省高校自然科学研究重点项目 KJ2018A0994

    大学生创新创业训练项目 201810367054

    大学生创新创业训练项目 201910367038

    蚌埠医学院科技发展项目 BYKF17114

  • 中图分类号: R363.2

Effects of hydrogen sulfide on spatial learning and memory and oxidative stress in hippocampus tissue of diabetic rat

    Corresponding author: MA Shan-feng, msfbio@163.com
  • CLC number: R363.2

  • 摘要: 目的 观察硫化氢(H2S)对糖尿病大鼠空间学习记忆的影响,并探讨其机制。 方法 雄性SD大鼠随机分为正常(CON)组、糖尿病(STZ)组、糖尿病+硫氢化钠(NaHS)组(SH组)和正常+NaHS(CH)组,每组8只。采用一次性腹腔注射链脲佐菌素的方法制备1型糖尿病大鼠模型。造模成功4周后,SH组和CH组大鼠每天腹腔注射NaHS溶液56 μmol/kg。处理4周后,测定大鼠空腹血糖(FBG)和体质量(BW);利用Morris水迷宫测试各组大鼠的空间学习记忆能力(逃避潜伏期、正确象限停留时间和到达正确象限的潜伏期);HE染色观察海马组织病理结构改变;利用试剂盒检测海马组织总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)水平;实时荧光定量聚合酶链式反应检测海马组织核因子E2相关因子2(Nrf2)和血红素氧化酶1(HO-1)mRNA表达情况。 结果 与CON组比较,CH组各项指标差异均无统计学意义(P>0.05);STZ组逃避潜伏期和到达正确象限的潜伏期延长,在正确象限停留时间缩短,大鼠海马组织病理结构损伤明显,FBG和MDA含量增加,BW、T-AOC、SOD、GSH-Px活性和Nrf2、HO-1 mRNA表达下降,差异均有统计学意义(P < 0.01)。与STZ组比较,除FBG外,SH组中以上各项指标均明显改善,差异均有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01)。 结论 H2S可以改善糖尿病大鼠的认知功能障碍,其机制可能与抑制海马组织氧化应激损伤、上调Nrf2/HO-1通路的表达相关。
  • 图 1  各组大鼠海马组织病理学变化(HE)染色

    表 1  各组大鼠FBG和BW水平比较(x±s)

    分组 n FBG/ (mmol/L) BW/g
    CON组 8 5.38±0.72 452.14±28.49
    STZ组 8 23.46±2.15** 218.58±22.80**
    SH组 8 21.95±2.08** 246.61±24.52**##
    CH组 8 5.56±0.64##△△ 443.72±29.26##△△
    F 322.05 178.99
    P < 0.01 < 0.01
    MS组内 2.469 697.225
    q检验:与CON组比较**P < 0.01;与STZ组比较##P < 0.01;与SH组比较△△P < 0.01
    下载: 导出CSV

    表 2  各组大鼠Morris水迷宫行为学测试结果比较(x±sni=8)

    分组 逃避潜伏期/s 正确象限
    停留时间/s
    到达正确象限的
    潜伏期/s
    第1天 第2天 第3天 第4天 第5天
    CON组 69.59±5.62 62.04±4.96 44.35±3.87 27.62±2.79 20.43±2.05 48.52±3.24 9.65±1.27
    STZ组 74.52±5.21 68.35±4.89 64.01±4.50** 55.22±5.68** 52.17±4.13** 28.13±2.86** 22.64±2.38**
    SH组 75.47±5.17 66.72±4.83 57.61±4.75**# 43.62±4.19**# 37.50±4.36**# 39.58±3.11**# 15.27±1.46**#
    CH组 70.05±5.73 63.22±5.38 46.79±4.64##△△ 27.33±3.75##△△ 22.13±3.41##△△ 49.27±3.38##△△ 9.28±1.34##△△
    F 2.47 2.76 34.39 81.70 136.50 78.32 111.70
    P > 0.05 > 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
    MS组内 29.570 25.200 19.830 17.920 12.970 9.943 2.801
    q检验:与CON组比较**P < 0.01;与STZ组比较#P < 0.05,##P < 0.01;与SH组比较△△P < 0.01
    下载: 导出CSV

    表 3  各组大鼠海马组织T-AOC、SOD、GSH-Px和MDA水平(x±sni=8)

    分组 T-AOC/(U/mg) SOD/(U/mg) GSH-Px/(U/mg) MDA/(nmol/mg)
    CON组 25.62±2.37 143.27±18.49 95.40±9.85 4.72±0.54
    STZ组 13.24±1.76** 84.63±9.73** 54.82±6.49** 8.96±1.07**
    SH组 19.53±2.15**# 119.86±12.21**# 77.56±8.64**# 6.53±0.85**#
    CH组 24.85±2.29##△△ 145.50±17.65##△△ 98.63±10.22##△△ 4.81±0.59##△△
    F 56.49 28.52 40.69 50.36
    P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
    MS组内 4.645 224.300 79.560 0.627
    q检验:与CON组比较**P < 0.01;与STZ组比较#P < 0.05, ##P < 0.01;与SH组比较△△P < 0.01
    下载: 导出CSV

    表 4  各组大鼠海马组织Nrf2和HO-1 mRNA表达(x±sni=8)

    分组 Nrf2/β-actin HO-1/β-actin
    CON组 0.98±0.10 0.97±0.11
    STZ组 0.52±0.08** 0.65±0.09**
    SH组 0.85±0.15**## 1.25±0.16**##
    CH组 1.03±0.13##△△ 1.03±0.12##△△
    F 30.22 32.66
    P < 0.01 < 0.01
    MS组内 0.014 0.015
    q检验:与CON组比较**P < 0.01;与STZ组比较##P < 0.01;与SH组比较△△P < 0.01
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2020-01-31
  • 录用日期:  2020-04-02
  • 刊出日期:  2020-04-15

硫化氢对糖尿病大鼠空间学习记忆和海马组织氧化应激的影响

    通讯作者: 马善峰, msfbio@163.com
    作者简介: 贾强(1976-), 男, 硕士, 讲师
  • 1. 蚌埠医学院 生理学教研室, 安徽 蚌埠 233030
  • 2. 蚌埠医学院 临床医学院, 安徽 蚌埠 233030
  • 3. 蚌埠医学院 机能实验中心, 安徽 蚌埠 233030
基金项目:  安徽省高校自然科学研究重点项目 KJ2018A0994大学生创新创业训练项目 201810367054大学生创新创业训练项目 201910367038蚌埠医学院科技发展项目 BYKF17114

摘要:  目的 观察硫化氢(H2S)对糖尿病大鼠空间学习记忆的影响,并探讨其机制。 方法 雄性SD大鼠随机分为正常(CON)组、糖尿病(STZ)组、糖尿病+硫氢化钠(NaHS)组(SH组)和正常+NaHS(CH)组,每组8只。采用一次性腹腔注射链脲佐菌素的方法制备1型糖尿病大鼠模型。造模成功4周后,SH组和CH组大鼠每天腹腔注射NaHS溶液56 μmol/kg。处理4周后,测定大鼠空腹血糖(FBG)和体质量(BW);利用Morris水迷宫测试各组大鼠的空间学习记忆能力(逃避潜伏期、正确象限停留时间和到达正确象限的潜伏期);HE染色观察海马组织病理结构改变;利用试剂盒检测海马组织总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)水平;实时荧光定量聚合酶链式反应检测海马组织核因子E2相关因子2(Nrf2)和血红素氧化酶1(HO-1)mRNA表达情况。 结果 与CON组比较,CH组各项指标差异均无统计学意义(P>0.05);STZ组逃避潜伏期和到达正确象限的潜伏期延长,在正确象限停留时间缩短,大鼠海马组织病理结构损伤明显,FBG和MDA含量增加,BW、T-AOC、SOD、GSH-Px活性和Nrf2、HO-1 mRNA表达下降,差异均有统计学意义(P < 0.01)。与STZ组比较,除FBG外,SH组中以上各项指标均明显改善,差异均有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01)。 结论 H2S可以改善糖尿病大鼠的认知功能障碍,其机制可能与抑制海马组织氧化应激损伤、上调Nrf2/HO-1通路的表达相关。

English Abstract

  • 糖尿病是以机体持续高血糖为主要特征的代谢性疾病[1]。长期的高血糖,会导致各种器官组织,特别是神经、肾、心血管等的慢性损害及功能障碍。糖尿病引起的认知功能障碍也是其慢性损害之一,主要表现为学习能力下降、记忆功能减退、空间定向困难等[2]。目前,关于糖尿病认知功能障碍的发病机制尚不清楚,糖代谢紊乱、氧化应激、炎症反应等均参与其中[3]。硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)是新型气体信号分子,具有抗炎症、抗氧化等作用[4-6]。内源性H2S主要以L-半胱氨酸为底物,在胱硫醚-β-合成酶(cystathionine-β-synthetase,CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶的催化作用下产生。其中CBS主要存在于神经系统,且在海马组织中高度表达[7]。研究证据[8]显示H2S在中枢神经系统中发挥着关键性的调节作用。硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)常作为H2S的外源性供体。研究[9]发现,外源性H2S对糖尿病引起的抑郁症具有一定的抑制作用,但是对糖尿病大鼠认知障碍影响及作用机制尚不清楚。因此,本研究通过建立糖尿病大鼠模型,观察外源性H2S对糖尿病大鼠空间学习记忆的影响,并探讨其作用机制。

    • 雄性SD大鼠32只购于蚌埠医学院实验动物中心,体质量160~200 g,自由饮食、饮水。链脲佐菌素(steptozotocin,STZ)和NaHS购自Sigma公司;总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司;逆转录试剂盒和实时荧光定量聚合酶链式反应(real time-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)试剂盒购自大连宝生物公司;核因子E2相关因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、血红素氧化酶1(heme oxygenase-1,HO-1)和β-actin的引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成,Nrf2引物序列:5′-TAG ATG ACC ATG AGT CGC TTG C-3′ (正向),5′-GCC AAA CTT GCT CCA TGT CC-3′(反向),扩增产物长度151 bp;HO-1引物序列:5′-GTG CAG AGA ATT CTG AGT TCA-3′(正向),5′-GCC GTA TAG ATA TGG TAC AAG-3′(反向),扩增产物长度100 bp;β-actin引物序列:5′-CGT AAA GAC CTC TAT GCC AAC A-3′(正向),5′-AGC CAC CAA TCC ACA CAG AG-3′(反向),扩增产物长度163 bp。

    • 所有大鼠适应性饲养1周后,进行水迷宫训练2次,选择认知能力正常的大鼠为实验大鼠,随机分为正常组和糖尿病组(STZ)。大鼠禁食12 h后,STZ组一次性腹腔注射STZ 55 mg/kg(溶于新鲜配制的pH 4.5的柠檬酸溶液中),正常组大鼠腹腔注射等体积柠檬酸溶液。3 d后,尾静脉采血测空腹血糖(fasting blood glucose,FBG),取FBG≥ 16.7 mmol/L为1型糖尿病模型。模型建立成功4周后,将STZ组大鼠随机分为糖尿病对照(STZ)组和STZ+NaHS(SH)组,正常组大鼠随机分为正常对照(CON)组和CON+NaHS(CH)组,每组均8只。SH组和CH组大鼠每天腹腔注射56 μmol/kg NaHS(溶于0.9%氯化钠溶液中,现配现用);CON组和STZ组大鼠每天腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液,共干预4周。每周监测大鼠FBG和体质量(body weight,BW)。

    • 从NaHS干预第4周的第3天上午9:00开始,进行水迷宫实验。训练时,先将大鼠放置在平台上适应30 s,然后以非平台象限为起始点,将大鼠头部朝向水池壁轻放入水中,摄像头连续记录90 s内找到平台的所需时间作为逃避潜伏期。若在90 s内大鼠仍未找到平台,则将其引导至平台上休息30 s后移出水池,将时间记为90 s。每天随机排序3个非平台象限,以每个非平台象限作为起始点,记录3次时间并计算平均值。连续训练5 d后,于第6天撤去平台。将大鼠从原先固定平台的对侧象限放入。摄像仪记录其在120 s内在水池中的路径,分析大鼠在正确象限停留时间和到达正确象限的潜伏期。

    • 大鼠Morris水迷宫测试结束后半小时,将大鼠放入密闭容器内,充入异氟烷麻醉后,断头取全脑组织,用预冷的0.9%氯化钠溶液清洗,滤纸吸干水分。用直镊将两侧的大脑皮层拨开,暴露出双侧的海马组织,再将海马组织与大脑皮层及周围的脑组织分开(1~1.5 g),取左侧的海马组织,用4%多聚甲醛溶液固定,脱水、石蜡包埋后切片,进行HE染色。

    • 取各组大鼠海马组织,加入9倍体积的0.9%氯化钠溶液,制备海马组织匀浆,离心后取上清,利用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度,分别按相应试剂盒说明书方法检测T-AOC、SOD、GSH-Px和MDA水平。

    • 采用TRIzol试剂提取海马组织总RNA,逆转录成cDNA后,利用RT-qPCR试剂盒扩增Nrf2、HO-1和β-actin基因。扩增条件:95 ℃预变性3 min后,以95 ℃变性30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 50 s,反应35个循环,最后72 ℃延伸8 min,以β-actin作为内参,按2-ΔΔCt计算相对表达量。

    • 采用方差分析和q检验。

    • 与CON组比较,STZ组和SH组大鼠FBG增加(P < 0.01),BW降低(P < 0.01)。与STZ组比较,SH组中FBG差异无统计学意义(P>0.05),BW增高(P < 0.01)。CON组和CH组FBG和BW水平差异无统计学意义(P>0.05)(见表 1)。

      分组 n FBG/ (mmol/L) BW/g
      CON组 8 5.38±0.72 452.14±28.49
      STZ组 8 23.46±2.15** 218.58±22.80**
      SH组 8 21.95±2.08** 246.61±24.52**##
      CH组 8 5.56±0.64##△△ 443.72±29.26##△△
      F 322.05 178.99
      P < 0.01 < 0.01
      MS组内 2.469 697.225
      q检验:与CON组比较**P < 0.01;与STZ组比较##P < 0.01;与SH组比较△△P < 0.01

      表 1  各组大鼠FBG和BW水平比较(x±s)

    • 与CON组大鼠比较,STZ组和SH组大鼠第3~5天的逃避潜伏期延长,且在第6天的空间探索实验中在正确象限停留时间减少,到达正确象限的潜伏期延长,差异均有统计学意义(P < 0.01)。与STZ组比较,SH组大鼠第3~5天的逃避潜伏期缩短,且在第6天的空间探索实验中在正确象限停留时间延长,到达正确象限的潜伏期缩短,差异均有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01)。CH组与CON组比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表 2)。

      分组 逃避潜伏期/s 正确象限
      停留时间/s
      到达正确象限的
      潜伏期/s
      第1天 第2天 第3天 第4天 第5天
      CON组 69.59±5.62 62.04±4.96 44.35±3.87 27.62±2.79 20.43±2.05 48.52±3.24 9.65±1.27
      STZ组 74.52±5.21 68.35±4.89 64.01±4.50** 55.22±5.68** 52.17±4.13** 28.13±2.86** 22.64±2.38**
      SH组 75.47±5.17 66.72±4.83 57.61±4.75**# 43.62±4.19**# 37.50±4.36**# 39.58±3.11**# 15.27±1.46**#
      CH组 70.05±5.73 63.22±5.38 46.79±4.64##△△ 27.33±3.75##△△ 22.13±3.41##△△ 49.27±3.38##△△ 9.28±1.34##△△
      F 2.47 2.76 34.39 81.70 136.50 78.32 111.70
      P > 0.05 > 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
      MS组内 29.570 25.200 19.830 17.920 12.970 9.943 2.801
      q检验:与CON组比较**P < 0.01;与STZ组比较#P < 0.05,##P < 0.01;与SH组比较△△P < 0.01

      表 2  各组大鼠Morris水迷宫行为学测试结果比较(x±sni=8)

    • CON组大鼠海马神经元细胞核呈圆形,大而规则,未见明显的核固缩或体积缩小。STZ组大鼠海马神经元中部分出现细胞核固缩、深染及空泡变性。与STZ组比较,SH组大鼠海马区的病变相对减轻,大鼠海马神经元形态较完整,固缩变性的神经元少见。CH组大鼠海马神经元细胞核呈圆形,未见明显的核固缩和空泡(见图 1)。

      图  1  各组大鼠海马组织病理学变化(HE)染色

    • 与CON组比较,CH组各项指标差异无统计学意义(P>0.05);STZ组海马组织中MDA含量升高,T-AOC、SOD和GSH-Px活性下降(P < 0.01)。与STZ组比较,SH组中MDA含量降低,T-AOC、SOD和GSH-Px活性增高,差异均有统计学意义(P < 0.05)(见表 3)。

      分组 T-AOC/(U/mg) SOD/(U/mg) GSH-Px/(U/mg) MDA/(nmol/mg)
      CON组 25.62±2.37 143.27±18.49 95.40±9.85 4.72±0.54
      STZ组 13.24±1.76** 84.63±9.73** 54.82±6.49** 8.96±1.07**
      SH组 19.53±2.15**# 119.86±12.21**# 77.56±8.64**# 6.53±0.85**#
      CH组 24.85±2.29##△△ 145.50±17.65##△△ 98.63±10.22##△△ 4.81±0.59##△△
      F 56.49 28.52 40.69 50.36
      P < 0.01 < 0.01 < 0.01 < 0.01
      MS组内 4.645 224.300 79.560 0.627
      q检验:与CON组比较**P < 0.01;与STZ组比较#P < 0.05, ##P < 0.01;与SH组比较△△P < 0.01

      表 3  各组大鼠海马组织T-AOC、SOD、GSH-Px和MDA水平(x±sni=8)

    • 与CON组比较,STZ组Nrf2和HO-1 mRNA表达降低;与STZ组比较,SH组Nrf2和HO-1 mRNA表达增加,差异均有统计学意义(P < 0.01)。CH组与CON组比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表 4)。

      分组 Nrf2/β-actin HO-1/β-actin
      CON组 0.98±0.10 0.97±0.11
      STZ组 0.52±0.08** 0.65±0.09**
      SH组 0.85±0.15**## 1.25±0.16**##
      CH组 1.03±0.13##△△ 1.03±0.12##△△
      F 30.22 32.66
      P < 0.01 < 0.01
      MS组内 0.014 0.015
      q检验:与CON组比较**P < 0.01;与STZ组比较##P < 0.01;与SH组比较△△P < 0.01

      表 4  各组大鼠海马组织Nrf2和HO-1 mRNA表达(x±sni=8)

    • 本研究通过一次性腹腔注射STZ诱导制备1型糖尿病大鼠模型,并利用Morris水迷宫对各组大鼠进行学习和空间记忆能力测试,结果显示,与CON组大鼠比较,STZ组大鼠FBG明显增加,其逃避潜伏期和到达正确象限的潜伏期明显延长,在正确象限停留时间显著减少。这表明持续高血糖会损伤大鼠的学习和空间记忆能力,出现明显的认知功能障碍。海马组织的HE染色结果显示,STZ组大鼠神经元细胞核固缩、空泡变性。因此进一步说明,糖尿病可引起海马组织病理结构异常,诱发认知功能障碍。

      H2S是继一氧化氮和一氧化碳之后迄今观察到的第3种内源性气体信号分子,在神经系统发挥重要的生理调节作用。本研究结果显示,给予糖尿病大鼠外源性H2S干预后,虽然空腹血糖值无显著性差异,但大鼠BW减轻有所缓解,同时Morris水迷宫结果显示,与STZ组大鼠比较,逃避潜伏期和到达正确象限的潜伏期明显缩短,大鼠在正确象限停留时间明显延长,这提示外源性H2S具有改善糖尿病大鼠的学习和空间记忆能力。HE染色结果也进一步证实,H2S明显减轻糖尿病大鼠的海马组织病理改变。这些结果均证实,外源性H2S对糖尿病大鼠的认知功能障碍具有明显的改善作用。

      氧化应激是糖尿病认知功能障碍的重要诱导因素[10]。当机体长期处于持续高血糖的状态下,会产生过量的活性氧簇,氧化应激损伤明显加重,进而引起海马组织结构异常,导致学习记忆功能障碍[11]。T-AOC反映组织的总抗氧化能力。SOD和GSH-Px是重要的抗氧化酶,其活性高低反映了组织抵抗氧化应激的能力。MDA是机体脂质过氧化反应的终产物,可以反映组织氧化损伤的程度。本实验结果显示,与CON组比较,STZ组大鼠海马组织中总抗氧化水平和抗氧化酶活性显著下降,MDA含量明显升高,证实糖尿病大鼠海马组织中存在氧化应激损伤。JIANG等[12]研究发现,外源性H2S可以增强创伤性脑损伤大鼠脑组织的抗氧化酶活性,减少氧化产物含量。本实验结果也显示,给予外源性H2S干预后,与STZ组相比,SH组中T-AOC水平、SOD和GSH-Px活性明显升高,MDA含量显著降低,提示外源性H2S可以通过增强抗氧化酶活性、减少脂质过氧化,抑制海马组织的氧化应激损伤。

      Nrf2是细胞氧化还原稳态的主要调节因子。在生理条件下,Nrf2分布于细胞质内,当组织氧化应激增高时,Nrf2易位至细胞核,激活下游抗氧化基因HO-1的表达[13]。HO-1又称热休克蛋白32,机体各处均可见其表达,是一种受多种因素诱导的应激蛋白。在还原型辅酶Ⅱ和氧气同时存在的条件下,HO-1可催化血红素分解释放胆绿素,然后进一步降解为抗氧化活性更强的胆红素,可有效抑制脂质过氧化。因此,Nrf2/HO-1通路在体内发挥重要的抗氧化作用[14]。研究[15]表明,通过上调海马组织Nrf2/HO-1通路的表达可明显减轻因脑缺血引起的氧化应激损伤。此外,CHEN等[16]研究发现,外源性H2S可激活神经性疼痛大鼠脊髓中的Nrf2/HO-1通路,减轻大鼠的疼痛。本研究结果显示,与CON组比较,STZ组大鼠海马组织中Nrf2和HO-1表达明显降低,氧化应激损伤加重。外源性给予H2S干预后,与STZ组比较,SH组大鼠海马组织中Nrf2和HO-1表达明显升高,提示外源性H2S可通过上调海马组织Nrf2/HO-1通路,增强糖尿病大鼠海马组织抗氧化应激损伤的能力。

      综上所述,外源性H2S可明显改善糖尿病大鼠的认知功能障碍,减轻海马组织的病理结构变化,其机制可能与抑制海马组织氧化应激损伤,上调Nrf2/HO-1通路表达相关。

参考文献 (16)

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