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慢病毒介导沉默SOCS3基因对糖尿病大鼠相关胰岛素通路蛋白表达的影响

孙志兵 杨娟

引用本文:
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慢病毒介导沉默SOCS3基因对糖尿病大鼠相关胰岛素通路蛋白表达的影响

    作者简介: 孙志兵(1983-),男,硕士研究生,主治医师
    通讯作者: 杨娟, 416091307@qq.com
  • 中图分类号: R587.1

Effect of lentivirus-mediated silencing SOCS3 gene on the expression of related insulin pathway proteins in diabetic rats

    Corresponding author: YANG Juan, 416091307@qq.com
  • CLC number: R587.1

  • 摘要: 目的构建糖尿病大鼠模型,探讨慢病毒介导沉默细胞因子信号转导抑制因子3(suppressors of cytokine signaling 3,SOCS3)基因对大鼠相关胰岛素通路蛋白表达的影响。方法选取SD大鼠40只,构建2型糖尿病大鼠模型成功后,随机分为空白对照组、空白载体组和观察组,各10只。空白对照组不进行其他处理,空白载体组通过大鼠尾部静脉注射空慢病毒载体,观察组通过大鼠尾部静脉注射SOCS3 RNAi慢病毒载体。注射载体4周后,测定3组大鼠血糖、血脂、胰岛素水平;采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测SOCS3、IRS1、IRS2、STAT5b、JAK2和STAT3 mRNA表达,Western blotting法检测SOCS3、IRS1、pIRS1、IRS2、pIRS2、STAT5b、pSTAT5b、JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表达。结果注射载体4周后,观察组大鼠空腹血糖、胰岛素、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平均明显低于空白对照组和空白载体组(P<0.01),高密度脂蛋白胆固醇水平均明显高于空白对照组和空白载体组(P<0.01);观察组SOCS3 mRNA和STAT5b mRNA表达均低于空白对照组和空白载体组(P<0.01),IRS1 mRNA、IRS2 mRNA和JAK2 mRNA表达均高于空白对照组和空白载体组(P<0.05~P<0.01),3组STAT3 mRNA差异无统计学意义(P>0.05);观察组SOCS3、STAT5b、pSTAT5b表达均明显低于空白对照组和空白载体组(P<0.01),IRS1、pIRS1、IRS2、pIRS2、JAK2、pJAK2、pSTAT3蛋白表达均明显高于空白对照组和空白载体组(P<0.01),3组STAT3蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论沉默SOCS3基因可降低糖尿病大鼠血糖水平,SOCS3基因可能通过相关信号通路介导胰岛素抵抗。
  • 表 1  各目的基因引物序列

    目的基因 引物序列
    GAPDH
    上游引物 5′-GGT CAT TCA TCT GCA TCG GTA GTG-3′
    下游引物 5′-AGC GAG TGA GCT AGT GCG TCA TC-3′
    SOCS3
    上游引物 5′-CAA GAG GTC CTG TCT TCA GAT G-3′
    下游引物 5′-TCT GTA GTC CAT TTC CTG GTT CA-3′
    IRS1
    上游引物 5′- GAG ATG GAG AGC CCA CAG ATG -3′
    下游引物 5′- CTA GAG GTC TCG CAA CGT CCG-3′
    IRS2
    上游引物 5′-ACG CCT AAT GGA TCC GTC ACA A-3′
    下游引物 5′- ATG TGC AGT GAT TCT CCG ACT G-3′
    STAT5b
    上游引物 5′-GTG ATA AAG GTT TCG GTT GCT G-3′
    下游引物 5′-TGT ATC TGT GAC TCC TAG TCT G-3′
    JAK2
    上游引物 5′-CGT CAG ACA CCC AGT GGT CCT G-3′
    下游引物 5′-ATG CTG CTG AGG CGT CGA GAG G-3′
    STAT3
    上游引物 5′-AAC GTG TGA TAG CTA TGT GTA CG-3′
    下游引物 5′-CTC TGT GAT CTG ACA TCG TGC AT-3′
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    表 2  3组大鼠不同时点体质量比较(x±s;g)

    分组 n 入组时 构建糖尿病模型后 注入载体后4周
    空白对照组 10 201.63±25.47 352.77±33.84 398.41±32.18
    空白载体组 10 208.77±18.23 361.93±23.46** 403.27±29.22
    观察组 10 205.93±20.18 359.85±29.84** 411.36±31.56
    F 0.28 45.22 0.44
    P >0.05 <0.01 >0.05
    MS组内 462.762 861.981 961.798
    q检验:与空白对照组比较**P<0.01
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    表 3  3组大鼠血糖、胰岛素和血脂水平比较(x±s)

    分组 n 空腹血糖/(mmol/L) 胰岛素/(mU/L) HDL-C/(mmol/L) TG/(mmol/L) LDL-C/(mmol/L) TC/(mmol/L)
    空白对照组 10 19.28±2.57 26.18±2.87 1.10±0.17 1.82±0.24 1.98±0.23 3.15±0.31
    空白载体组 10 20.14±3.42 25.36±3.22 1.03±0.21 1.79±0.21 1.95±0.21 3.11±0.25
    观察组 10 12.37±3.10**△△ 14.26±3.26**△△ 1.58±0.33**△△ 1.03±0.19**△△ 1.29±0.13**△△ 2.10±0.34**△△
    F 19.50 45.49 14.78 43.64 40.06 38.73
    P <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
    MS组内 9.303 9.744 0.061 0.046 0.038 0.091
    q检验:与空白对照组比较**P<0.01;与空白载体组比较△△P<0.01
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    表 4  3组大鼠相关mRNA表达比较(x±s)

    分组 n SOCS3 IRS1 IRS2 STAT5b JAK2 STAT3
    空白对照组 10 0.60±0.09 0.36±0.10 0.34±0.08 0.64±0.10 0.40±0.09 0.52±0.11
    空白载体组 10 0.62±0.11 0.37±0.08 0.35±0.09 0.66±0.07 0.42±0.08 0.54±0.12
    观察组 10 0.42±0.07**△△ 0.56±0.09**△△ 0.51±0.10**△△ 0.52±0.08**△△ 0.53±0.09**△ 0.59±0.11
    F 14.50 15.55 11.14 8.08 6.50 1.01
    P <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 >0.05
    MS组内 0.008 0.008 0.008 0.007 0.008 0.013
    q检验:与空白对照组比较**P<0.01;与空白载体组比较△P<0.05,△△P<0.01
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    表 5  3组大鼠胰岛素通路蛋白表达的比较(x±s)

    分组 n SOCS3 IRS1 pIRS1 IRS2 pIRS2 STAT5b pSTAT5b JAK2 pJAK2 STAT3 pSTAT3
    空白对照组 10 0.67±0.06 0.27±0.05 0.18±0.04 0.50±0.05 0.31±0.07 1.40±0.18 1.02±0.20 2.00±0.21 0.88±0.09 1.90±0.20 1.00±0.12
    空白载体组 10 0.69±0.08 0.29±0.07 0.16±0.08 0.51±0.07 0.32±0.08 1.42±0.21 1.03±0.18 2.01±0.23 0.87±0.10 1.89±0.23 1.01±0.11
    观察组 10 0.45±0.09**△△ 0.42±0.06**△△ 0.28±0.07**△△ 0.72±0.11**△△ 0.51±0.09**△△ 1.12±0.20**△△ 0.73±0.12**△△ 2.32±0.19**△△ 1.23±0.09**△△ 1.96±0.17 1.29±0.18**△△
    F 29.39 18.09 9.61 23.74 19.64 7.24 10.03 7.46 48.13 0.35 13.80
    P <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 >0.05 <0.01
    MS组内 0.006 0.004 0.004 0.007 0.007 0.039 0.029 0.044 0.009 0.041 0.020
    q检验:与空白对照组比较**P<0.01;与空白载体组比较△△P<0.01
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-07-06
  • 录用日期:  2020-01-31
  • 刊出日期:  2020-05-15

慢病毒介导沉默SOCS3基因对糖尿病大鼠相关胰岛素通路蛋白表达的影响

    通讯作者: 杨娟, 416091307@qq.com
    作者简介: 孙志兵(1983-),男,硕士研究生,主治医师
  • 1. 湖北省孝感市中心医院 内分泌Ⅱ风湿科, 432000
  • 2. 湖北省宜昌市第二人民医院, 三峡大学第二人民医院 内分泌科, 443111

摘要: 目的构建糖尿病大鼠模型,探讨慢病毒介导沉默细胞因子信号转导抑制因子3(suppressors of cytokine signaling 3,SOCS3)基因对大鼠相关胰岛素通路蛋白表达的影响。方法选取SD大鼠40只,构建2型糖尿病大鼠模型成功后,随机分为空白对照组、空白载体组和观察组,各10只。空白对照组不进行其他处理,空白载体组通过大鼠尾部静脉注射空慢病毒载体,观察组通过大鼠尾部静脉注射SOCS3 RNAi慢病毒载体。注射载体4周后,测定3组大鼠血糖、血脂、胰岛素水平;采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测SOCS3、IRS1、IRS2、STAT5b、JAK2和STAT3 mRNA表达,Western blotting法检测SOCS3、IRS1、pIRS1、IRS2、pIRS2、STAT5b、pSTAT5b、JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3蛋白表达。结果注射载体4周后,观察组大鼠空腹血糖、胰岛素、三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平均明显低于空白对照组和空白载体组(P<0.01),高密度脂蛋白胆固醇水平均明显高于空白对照组和空白载体组(P<0.01);观察组SOCS3 mRNA和STAT5b mRNA表达均低于空白对照组和空白载体组(P<0.01),IRS1 mRNA、IRS2 mRNA和JAK2 mRNA表达均高于空白对照组和空白载体组(P<0.05~P<0.01),3组STAT3 mRNA差异无统计学意义(P>0.05);观察组SOCS3、STAT5b、pSTAT5b表达均明显低于空白对照组和空白载体组(P<0.01),IRS1、pIRS1、IRS2、pIRS2、JAK2、pJAK2、pSTAT3蛋白表达均明显高于空白对照组和空白载体组(P<0.01),3组STAT3蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论沉默SOCS3基因可降低糖尿病大鼠血糖水平,SOCS3基因可能通过相关信号通路介导胰岛素抵抗。

English Abstract

  • 糖尿病在中国已经成为影响居民生活质量的主要问题之一,在经济发展、生活条件富足以及人口老龄化等多种因素驱使下,糖尿病的发病人数仍在逐年上升[1-2]。糖尿病发病机制主要为胰岛素相对分泌不足及胰岛素抵抗,2型糖尿病是我国主要的糖尿病类型,胰岛素抵抗在2型糖尿病发病中发挥重要作用[3-4]。当前对于介导胰岛素抵抗信号的转导通路有较多研究,其中有关细胞因子信号转导抑制因子3(suppressors of cytokine signaling 3,SOCS3)介导胰岛素抵抗信号转导通路的研究也有一定进展[5-6],但目前较少有文献对SOCS3介导多条信号转导通路引起胰岛素抵抗进行报道。本研究通过构建2型糖尿病大鼠模型,探讨慢病毒介导沉默SOCS3基因对大鼠相关胰岛素通路蛋白表达的影响。现作报道。

    • 雄性5周龄SD大鼠40只,购自北京维通达生物技术有限公司,大鼠许可证号:SCXK(京)20170011,体质量170~230 g,所有SD大鼠均饲养于SPF级动物房。实验动物操作程序符合《实验动物管理和使用指南》规定,本实验研究方案通过医院伦理委员会批准。

    • 链脲佐菌素(streptozocin,STZ)试剂购自美国Sigma公司;空慢病毒载体购自北京义翘神州科技有限公司;葡萄糖测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;大鼠胰岛素ELISA试剂盒购自上海一基实业有限公司;血脂生化检测试剂盒购自上海透景诊断科技有限公司;Trizol RNAiso购自日本Takara公司;实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)试剂盒购自北京九州天瑞科技有限公司;总RNA提取试剂盒购自北京凯瑞基生物科技有限公司;反转录试剂盒均购自美国Applied Biosystems公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京金克隆生物技术有限公司;兔抗鼠SOCS3蛋白、胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate-1,IRS1)、磷酸化IRS1(pIRS1)、胰岛素受体底物2(insulin receptor substrate-2,IRS2)、磷酸化IRS2(pIRS2)、信号传导及转录激活因子-5b(signal transducers and activators of transcription-5b,STAT5b)、磷酸化STAT5b(pSTAT5b)一抗购自美国Novus Biologicals公司;兔抗鼠酪氨酸激酶2(janus kinase 2,JAK2)、磷酸化JAK2(pJAK2)、信号转导及转录激活因子-3(signal transducers and activators of transcription-3,STAT3)、磷酸化STAT3(pSTAT3)一抗均购自美国Abcam公司;羊抗兔辣根过氧化物酶标记二抗购自美国Santa Cruz公司。KETA S凝胶成像分析系统购自美国Wealtec Corp公司;PCR仪购自美国Bio-rad公司,CFX96型;全自动生化分析系统购自美国Beckman Coulter公司,AU5800型。

    • 慢病毒SOCS3 RNAi构建由北京义翘神州科技有限公司完成,载体构建完成后由该公司提供基因测序结果,由我实验室人员进行确认。

    • 大鼠糖尿病模型构建:40只大鼠给予高糖高脂饲料(配比:胆固醇5%、猪油脂10%、蔗糖10%、普通饲料65%)喂养,饲养4周后,大鼠腹腔注射STZ缓冲液(STZ溶液1%,柠檬酸缓冲液99%)30 mg/kg。注射5 d后,随机3次测量鼠尾血糖,血糖值>16.7 mmol/L为大鼠2型糖尿病模型构建成功。建模成功大鼠按照随机数字表法分为空白对照组、空白载体组和观察组,各10只。分组后1、15 d,观察组大鼠尾部注射SOCS3 RNAi慢病毒载体,每次1.5 mL;空白载体组大鼠尾部注射空慢病毒载体,每次1.5 mL;空白对照组不进行处理。继续饲养4周,所有大鼠禁食,收集血清、肝脏组织标本,肝脏组织标本于-80 ℃保存待检。

    • 载体注射4周后,检测大鼠空腹血糖、胰岛素、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及总胆固醇(TC)水平。其中空腹血糖采用葡萄糖氧化酶法检测,胰岛素测定采用ELISA法,HDL-C、TG、LDL-C和TC采用全自动生化分析仪测定。

    • 取大鼠肝脏组织1 g,以研磨棒充分研磨,加入1 mL Trizol RNAiso,提取总RNA,反转录操作参照反转录试剂盒说明书,提取20 μg RNA反转录为cDNA,GAPDH、SOCS3、IRS1、IRS2、STAT5b、JAK2、STAT3引物由北京义翘神州科技有限公司合成,引物序列见表 1。PCR反应条件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40个循环,循环完成后在72 ℃条件下继续延伸10 min。采用FS2000系统进行分析,并采用2-△△CT法计算mRNA相对表达量。

      目的基因 引物序列
      GAPDH
      上游引物 5′-GGT CAT TCA TCT GCA TCG GTA GTG-3′
      下游引物 5′-AGC GAG TGA GCT AGT GCG TCA TC-3′
      SOCS3
      上游引物 5′-CAA GAG GTC CTG TCT TCA GAT G-3′
      下游引物 5′-TCT GTA GTC CAT TTC CTG GTT CA-3′
      IRS1
      上游引物 5′- GAG ATG GAG AGC CCA CAG ATG -3′
      下游引物 5′- CTA GAG GTC TCG CAA CGT CCG-3′
      IRS2
      上游引物 5′-ACG CCT AAT GGA TCC GTC ACA A-3′
      下游引物 5′- ATG TGC AGT GAT TCT CCG ACT G-3′
      STAT5b
      上游引物 5′-GTG ATA AAG GTT TCG GTT GCT G-3′
      下游引物 5′-TGT ATC TGT GAC TCC TAG TCT G-3′
      JAK2
      上游引物 5′-CGT CAG ACA CCC AGT GGT CCT G-3′
      下游引物 5′-ATG CTG CTG AGG CGT CGA GAG G-3′
      STAT3
      上游引物 5′-AAC GTG TGA TAG CTA TGT GTA CG-3′
      下游引物 5′-CTC TGT GAT CTG ACA TCG TGC AT-3′

      表 1  各目的基因引物序列

    • 取大鼠肝脏组织1 g,以研磨棒充分研磨,加入1 mL RIPA细胞裂解液,各组细胞在冰上裂解30 min,移入1.5 mL离心管中,在预冷的4 ℃离心机中5 000 r/min离心5 min后提取上清,95 ℃煮沸后,收集蛋白备用。提取40 μg总蛋白,在120 g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离,采用电转移法转移至聚偏氟乙烯膜上,室温下用50 g/L脱脂奶粉进行封闭2 h。随后加入稀释的兔抗鼠SOCS3、IRS1、pIRS1、IRS2、pIRS2、STAT5b、pSTAT5b、JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3一抗(1∶1 000),在4 ℃条件下进行孵育过夜备用。第2天用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)稀释液洗涤孵育后的溶液3次,然后加入山羊抗兔稀释二抗(1∶1 000)孵育2 h,用PBST稀释液洗涤3次,然后用二氨基联苯胺(DAB)显影液处理样本。采用Image J软件分析蛋白条带。

    • 采用方差分析和q检验。

    • 3组大鼠均精神状态较好,毛发光滑。3组大鼠入组时和注入载体后4周体质量差异均无统计学意义(P>0.05);构建糖尿病模型后,空白载体组和观察组大鼠体质量均明显高于空白对照组(P<0.01),空白载体组和观察组差异无统计学意义(P>0.05)(见表 2)。

      分组 n 入组时 构建糖尿病模型后 注入载体后4周
      空白对照组 10 201.63±25.47 352.77±33.84 398.41±32.18
      空白载体组 10 208.77±18.23 361.93±23.46** 403.27±29.22
      观察组 10 205.93±20.18 359.85±29.84** 411.36±31.56
      F 0.28 45.22 0.44
      P >0.05 <0.01 >0.05
      MS组内 462.762 861.981 961.798
      q检验:与空白对照组比较**P<0.01

      表 2  3组大鼠不同时点体质量比较(x±s;g)

    • 观察组大鼠空腹血糖、胰岛素、TG、LDL-C和TC水平均明显低于空白对照组和空白载体组(P<0.01),HDL-C水平均明显高于空白对照组和空白载体组(P<0.01);空白对照组和空白载体组大鼠上述指标差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 3)。

      分组 n 空腹血糖/(mmol/L) 胰岛素/(mU/L) HDL-C/(mmol/L) TG/(mmol/L) LDL-C/(mmol/L) TC/(mmol/L)
      空白对照组 10 19.28±2.57 26.18±2.87 1.10±0.17 1.82±0.24 1.98±0.23 3.15±0.31
      空白载体组 10 20.14±3.42 25.36±3.22 1.03±0.21 1.79±0.21 1.95±0.21 3.11±0.25
      观察组 10 12.37±3.10**△△ 14.26±3.26**△△ 1.58±0.33**△△ 1.03±0.19**△△ 1.29±0.13**△△ 2.10±0.34**△△
      F 19.50 45.49 14.78 43.64 40.06 38.73
      P <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01
      MS组内 9.303 9.744 0.061 0.046 0.038 0.091
      q检验:与空白对照组比较**P<0.01;与空白载体组比较△△P<0.01

      表 3  3组大鼠血糖、胰岛素和血脂水平比较(x±s)

    • 除STAT3mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)外, 3组大鼠SOCS3mRNA、STAT5bmRNA、IRS1mRNA、IRS2mRNA及JAK2mRNA表达间差异均有统计学意义(P<0.01)。其中, 观察组大鼠SOCS3mRNA和STAT5bmRNA表达均明显低于空白对照组和空白载体组(P<0.01), IRS1mRNA、IRS2mRNA和JAK2mRNA表达均高于空白对照组和空白载体组(P<0.05~P<0.01);空白对照组和空白载体组相关mRNA 表达差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 4)。

      分组 n SOCS3 IRS1 IRS2 STAT5b JAK2 STAT3
      空白对照组 10 0.60±0.09 0.36±0.10 0.34±0.08 0.64±0.10 0.40±0.09 0.52±0.11
      空白载体组 10 0.62±0.11 0.37±0.08 0.35±0.09 0.66±0.07 0.42±0.08 0.54±0.12
      观察组 10 0.42±0.07**△△ 0.56±0.09**△△ 0.51±0.10**△△ 0.52±0.08**△△ 0.53±0.09**△ 0.59±0.11
      F 14.50 15.55 11.14 8.08 6.50 1.01
      P <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 >0.05
      MS组内 0.008 0.008 0.008 0.007 0.008 0.013
      q检验:与空白对照组比较**P<0.01;与空白载体组比较△P<0.05,△△P<0.01

      表 4  3组大鼠相关mRNA表达比较(x±s)

    • 除STAT3蛋白表达间差异无统计学意义(P>0.05)外,3组大鼠相关通路蛋白表达间差异均有统计学意义(P<0.01)。其中,观察组SOCS3、STAT5b、pSTAT5b蛋白表达均明显低于空白对照组和空白载体组(P<0.01),IRS1、pIRS1、IRS2、pIRS2、JAK2、pJAK2、pSTAT3蛋白表达均明显高于空白对照组和空白载体组(P<0.01);空白对照组和空白载体组各通路蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 5)。

      分组 n SOCS3 IRS1 pIRS1 IRS2 pIRS2 STAT5b pSTAT5b JAK2 pJAK2 STAT3 pSTAT3
      空白对照组 10 0.67±0.06 0.27±0.05 0.18±0.04 0.50±0.05 0.31±0.07 1.40±0.18 1.02±0.20 2.00±0.21 0.88±0.09 1.90±0.20 1.00±0.12
      空白载体组 10 0.69±0.08 0.29±0.07 0.16±0.08 0.51±0.07 0.32±0.08 1.42±0.21 1.03±0.18 2.01±0.23 0.87±0.10 1.89±0.23 1.01±0.11
      观察组 10 0.45±0.09**△△ 0.42±0.06**△△ 0.28±0.07**△△ 0.72±0.11**△△ 0.51±0.09**△△ 1.12±0.20**△△ 0.73±0.12**△△ 2.32±0.19**△△ 1.23±0.09**△△ 1.96±0.17 1.29±0.18**△△
      F 29.39 18.09 9.61 23.74 19.64 7.24 10.03 7.46 48.13 0.35 13.80
      P <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 >0.05 <0.01
      MS组内 0.006 0.004 0.004 0.007 0.007 0.039 0.029 0.044 0.009 0.041 0.020
      q检验:与空白对照组比较**P<0.01;与空白载体组比较△△P<0.01

      表 5  3组大鼠胰岛素通路蛋白表达的比较(x±s)

    • SOCS3基因参与了多个细胞因子的信号转导通路,目前认为其主要通过JAK-STAT信号通路对相关因子发挥作用。有研究[7-8]显示,其在糖尿病发生、发展过程中发挥一定作用。有研究[9]通过不同小鼠模型诱导SOCS3基因失活,对瘦素敏感性及胰岛素抵抗进行观察,发现失活SOCS3基因对瘦素的表达有一定影响,并通过瘦素信号转导介导血糖变化,同时降低了胰岛素抵抗作用。WANG等[10]对糖尿病小鼠进行FGF-21基因敲除,对血糖、胰岛素、STAT3-SOCS3通路蛋白进行检测,结果显示,小鼠糖原异生、糖原分解增加,而后血糖水平升高,同时降低了STAT3-SOCS3通路磷酸化水平,导致胰岛素抵抗增加,也进一步印证了STAT3-SOCS3通路的激活与胰岛素抵抗有一定相关性。本研究沉默SOCS3基因表达后,对STAT5b介导信号通路蛋白表达及血清指标变化进行检测,以探讨SOCS3介导胰岛素抵抗的信号通路情况。

      本研究以STZ诱导大鼠糖尿病模型,共30只大鼠构建成功,在注射载体4周后,大鼠体质量差异未见统计学意义。研究[11]显示,在糖尿病大鼠饲料中添加苦瓜提取物,能够有效降低大鼠体质量,同时大鼠肝脏中SOCS3及JNK基因表达具有明显差异,说明苦瓜提取物影响大鼠体质量过程中,SOCS3可能参与了胰岛素抵抗的过程,进而影响体质量变化。这与本研究结论不一致,原因可能包括选取的试剂不一致、研究目的不同,可能还存在其他通路影响大鼠的胰岛素抵抗水平,因此得到结论存在差异。在血清指标方面,观察组大鼠血糖、胰岛素水平均低于其他2组,分析其原因可能为沉默SOCS3基因表达后,能够降低胰岛素抵抗,从而降低血糖。ZHOU等[12]对幽门螺杆菌感染诱导肝脏胰岛素抵抗信号通路进行研究,结果显示,SOCS3在幽门螺杆菌介导胰岛素抵抗中发挥了一定作用,支持本研究结果。同时,我们也发现观察组血脂指标变化也优于其他2组,我们推测SOCS3基因表达与血脂指标具有一定相关性,拟在以后的研究中进行进一步探索。

      本研究对SOCS3基因和蛋白表达进行检测,结果显示,观察组表达水平低于其他2组,提示慢病毒介导沉默SOCS3基因载体注入后,达到了预期目的,为后续实验做好了准备;而空白对照组和空白载体组在基因表达方面未见差异,排除慢病毒载体的干扰。结合上述空腹血糖和胰岛素表达,进一步证实SOCS3在胰岛素抵抗病理机制中发挥了作用,与相关研究[13-15]结论一致。此外,观察组STAT5b mRNA低于其他2组,IRS1 mRNA、IRS2 mRNA及JAK2 mRNA高于其他2组,而3组STAT3 mRNA无明显差异,提示下调SOCS3基因表达可抑制STAT5b mRNA,增加IRS1 mRNA、IRS2 mRNA及JAK2 mRNA的表达,对STAT3 mRNA的表达影响不大。

      本研究结果显示,在信号通路蛋白表达及磷酸化方面,沉默SOCS3基因后,抑制了STAT5b蛋白及其磷酸化,上调了IRS1、IRS2蛋白表达及磷酸化。推测可能为SOCS3基因通过调节STAT5b的表达及磷酸化介导IRS1、IRS2的表达,进而介导胰岛素抵抗。有研究[16]显示,上调SOCS3表达可下调IRS1表达,同时增加IRS1磷酸化,进而介导胰岛素抵抗,与本次研究结论存在差异,还需进一步研究探讨。我们在研究中还发现,下调SOCS3基因后,JAK2的表达水平及磷酸化增加,STAT3磷酸化增加,但STAT3蛋白表达未见明显增加,分析可能为SOCS3不仅介导了JAK2/STAT3通路,过程中可能STAT3蛋白也介导了其他通路的信号转导。MAHONY等[17-18]提出,SOCS3是多种细胞因子信号转导的基础,SOCS3高表达通过调控JAK/STAT信号通路介导糖尿病发生。BLUYSSEN等[19]研究指出,SOCS3基因与 JAK2/STAT3通路互相形成一个反馈回路,糖尿病病人出现胰岛素抵抗时,伴随着多种细胞因子增加,激活JAK2/STAT3通路,诱导SOCS3表达增加,同时SOCS3又能够负反馈调节JAK2/STAT3通路,从而进一步诱导胰岛素抵抗。这与本研究结果存在差异。而张旭等[20]研究显示,SOCS3通过负性调节STAT3活化,介导胰岛素抵抗,支持本次研究结论。可认为目前该通路介导胰岛素抵抗的机制尚不十分准确,还需进一步实验研究证实。

      综上,SOCS3可能通过相关信号通路介导胰岛素抵抗,沉默SOCS3基因,可介导相关信号通路抑制胰岛素抵抗,进而改善糖尿病症状。

参考文献 (20)

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