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肺微血管内皮细胞作为保护肺脏的第一道门户,其屏障功能在其中发挥着至关重要的作用。在感染性疾病诱发的急性肺损伤(ALI)时,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)引起肺内微血管内皮细胞与中性粒细胞黏附增加以及巨噬细胞细胞炎症因子的释放,细胞骨架相关信号通路被激活,下游肌动蛋白细胞骨架重构,从而导致内皮细胞损伤继而引发肺内微血管内皮屏障破坏。因此,通过LPS建立在体或离体炎症模型[1-2]成为研究ALI的常用实验方法。
Ras相关的C3肉毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Rac1)是小G蛋白家族成员之一,其活性形式Rac1-GTPase能够对细胞骨架的调节产生重要影响。Rac1通过作用下游靶点cAMP依赖的蛋白激酶A(PAK)激活LIM激酶(LIMK)[3], LIMK通过磷酸化抑制丝切蛋白(cofilin)诱导的肌动蛋白解聚,间接促进肌动蛋白应力纤维形成、细胞骨架重构,继而引发细胞通透性的改变[4]。川芎嗪(tetramethylpyrazine, TMP)的化学成分是四甲基吡嗪,主要来源于中国传统中药川芎的根茎提取物,可以通过抑制炎症反应减轻机体脓毒症症状[5],临床上广泛应用于扩张血管、改善微循环等方面[6]。课题组前期实验研究发现TMP可以降低通路中相关蛋白的表达来减弱LPS对内皮细胞骨架的损伤[7]。但是TMP对于Rac1/LIMK1信号通路上游分子的调控机制并不确定。为此本实验通过检测TMP在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)体外模型上引起的通透性的改变,以明确TMP对LPS诱导损伤血管内皮细胞后通透性升高的改善情况;Western blotting检测Rac1/LIMK1信号通路相关蛋白表达情况;从分子水平探讨Rac1/LIMK1信号通路是否参与LPS诱导的内皮细胞损伤,探讨TMP干预Rac1/LIMK1信号通路的具体分子学机制。
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使用0.25%胰酶灌注成功将HUVECs消化下来,12h后倒置显微镜下观察发现大多数细胞处于贴壁状态,亮空泡状的无活性细胞较少(见图 1A)。原代培养4d后观察内皮细胞融合为单层,密度可高达90%以上,细胞形态呈饱满的不规则铺路石状紧密排列(见图 1B)。镜下观察细胞质内大量黄褐色颗粒聚集于细胞核周围(见图 1C),Ⅷ因子相关抗原蛋白呈阳性表达,可证明培养的细胞为内皮细胞。
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与正常对照组相比,LPS组Pa升高明显(P < 0.01);与LPS组相比,3组TMP防治组Pa呈下降趋势(P < 0.05~P < 0.01), 并且具有一定的浓度依赖性(见表 1)。
分组 n TEER值(LPS作用12 h)/Ω×cm2 正常对照组 3 1 LPS组 3 1.50±0.20** TMP低剂量防治组 3 1.19±0.14# TMP中剂量防治组 3 1.12±0.08## TMP高剂量防治组 3 1.00±0.16## 纯TMP组 3 0.92±0.23 F — 5.676 P — < 0.01 MS组内 — 0.023 q检验:与正常对照组比较**P < 0.01;与LPS组比较#P < 0.05,##P < 0.01 表 1 各组间内皮细胞单层通透性比较(x±s)
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细胞接种Transwell小室12h内,TEER值受细胞贴壁影响明显升高,12~84h这一阶段细胞TEER值呈稳定趋势增长[12、24、36、48、60、72 h分别为4.59±0.53、5.69±0.10、6.58±0.51、7.63±0.60、9.01±0.19、(10.28±0.60)Ω×cm2],84h后细胞TEER值增长明显减缓[84、96、108 h分别为12.55±0.19、13.54±1.26、(13.60±0.33)Ω×cm2](F=189.042, P < 0.05, MS组内=0.301)。LPS作用12h时,与正常对照组相比,LPS组TEER值显著性降低(P < 0.05);与LPS组相比,TMP中、高剂量防治组TEER显著升高(P < 0.05~P < 0.01)(见表 2)。
分组 n TEER值/Ω×cm2 LPS作用0 h LPS作用12 h 正常对照组 3 13.55±1.26 13.60±0.33 LPS组 3 13.77±0.29 11.94±0.17* TMP低剂量防治组 3 14.92±0.67 13.21±0.95 TMP中剂量防治组 3 14.87±1.13 14.09±1.01## TMP高剂量防治组 3 14.15±0.82 13.54±1.08# 纯TMP组 3 13.33±0.58 14.04±0.35 F — 1.884 3.366 P — >0.05 < 0.05 MS组内 — 0.729 0.558 q检验:与正常对照组比较*P < 0.05;与LPS组比较#P < 0.05,##P < 0.01 表 2 LPS作用12 h前后各处理组TEER值变化情况比较(x±s)
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与正常对照组比较,LPS组Rac1-GTPase、Rac1、LIMK1、p-LIMK1蛋白表达均明显上调(P < 0.01);TMP高剂量防治组与LPS组比较,Rac1-GTPase、Rac1、LIMK1、p-LIMK1蛋白表达均明显下调(P < 0.05~P < 0.01)(见图 2、表 3)。
分组 Rac1-GTPase蛋白相对表达量 Rac1蛋白相对表达量 LIMK1蛋白相对表达量 P-LIMK1蛋白相对表达量 正常对照组 0.85±0.04 1.15±0.06 0.82±0.04 0.26±0.02 LPS组 1.30±0.08** 1.61±0.05** 1.03±0.08** 0.34±0.04** TMP低剂量防治组 1.12±0.16* 1.50±0.07** 1.01±0.01** 0.32±0.03* TMP中剂量防治组 1.09±0.14* 1.46±0.07**## 0.91±0.04# 0.28±0.01# TMP高剂量防治组 1.01±0.18## 1.36±0.07**## 0.87±0.03## 0.26±0.04## 纯TMP组 0.93±0.13 1.37±0.08** 0.79±0.09 0.24±0.02 F值 4.303 17.388 9.931 5.727 P值 < 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.018 0.004 0.003 0.001 q检验:与正常对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01;与LPS组比较#P < 0.05, ##P < 0.01 表 3 各组Rac1-GTPase、Rac1、LIMK1、p-LIMK1蛋白相对表达量比较(x±s;ni=3)
川芎嗪对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞高通透性的保护作用研究
Protective effect of tetramethylpyrazine on lipopolysaccharide-induced high permeability of human umbilical vein endothelial cells
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摘要:
目的观察川芎嗪(tetramethylpyrazine, TMP)对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)通透性变化和细胞骨架相关蛋白表达影响。 方法以体外培养的HUVECs为实验对象,将细胞随机分6组:正常对照组, LPS组(1μg/mL LPS), TMP低、中、高剂量防治组(60μg/mL TMP+1μg/mL LPS、120μg/mL TMP+1μg/mL LPS、240μg/mL TMP+1μg/mL LPS), 纯TMP组(240μg/mL TMP)。Transwell小室内建立内皮细胞通透性模型;细胞电压电阻仪测定各组细胞跨内皮细胞电阻值(TEER);FITC-葡聚糖法检测各组细胞通透性变化,Pull-Down实验拉下Rac1-GTPase活性蛋白,Western blotting检测各组细胞Rac1-GTPase、Rac1、LIMK1和p-LIMK1的蛋白表达。 结果3组不同浓度的TMP均可以抑制LPS诱导的内皮细胞TEER降低以及降低LPS导致的内皮细胞通透性的增加(P < 0.05~P < 0.01);Western blotting实验显示TMP可以有效抑制LPS诱导的HUVECs中的Rac1-GTPase、p-LIMK1、Rac1、LIMK1表达(P < 0.05~P < 0.01)。 结论TMP可以有效抑制LPS诱导的HUVECs通透性升高,其机制可能与其下调Rac1/LIMK1信号通路中Rac1-GTPase活性蛋白、LIMK1磷酸化蛋白表达有关。 -
关键词:
- 川芎嗪 /
- 脂多糖 /
- 内皮细胞通透性 /
- Rac1/LIMK1信号通路
Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of tetramethylpyrazine (TMP) on the permeability of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) induced by lipopolysaccharide (LPS) and the expression of cytoskeleton-related proteins. MethodsHUVECs cultured in vitro were randomly divide into normal control group, LPS group (1 μg/mL LPS), TMP low, medium and high dose group (60 μg/mL TMP+1 μg/mL LPS, 120 μg/mL TMP+1 μg/mL LPS, 240 μg/mL TMP+1 μg/mL LPS), pure TMP group (240 μg/mL TMP).Endothelial cell permeability model was established in Transwell chamber; cell voltage resistance meter was used to measure the trans-endothelial electrical resistance in each group; FITC-dextran method was used to detect the permeability change in each group, and Pull-Down experiment was used to collect Rac1-GTPase active protein, Western blotting was used to detect the protein expression of Rac1-GTPase, Rac1, LIMK1 and p-LIMK1 in each group. ResultsTEER and permeability coefficient showed that three different concentrations of TMP inhibited the decrease of TEER induced by LPS in endothelial cells and decreased LPS-induced endothelial cell permeability(P < 0.05 to P < 0.01);Western blotting analysis showed that TMP could effectively inhibit the LPS-induced up-regulation of Rac1-GTPase, p-LIMK1, Rac1 and LIMK1 in HUVECs(P < 0.05 to P < 0.01). ConclusionsTMP can effectively inhibit the increase of permeability of HUVECs induced by LPS, which may be related to the down-regulation of Rac1-GTPase active protein and LIMK1 phosphorylation protein expression in Rac1/LIMK1 signaling pathway. -
表 1 各组间内皮细胞单层通透性比较(x±s)
分组 n TEER值(LPS作用12 h)/Ω×cm2 正常对照组 3 1 LPS组 3 1.50±0.20** TMP低剂量防治组 3 1.19±0.14# TMP中剂量防治组 3 1.12±0.08## TMP高剂量防治组 3 1.00±0.16## 纯TMP组 3 0.92±0.23 F — 5.676 P — < 0.01 MS组内 — 0.023 q检验:与正常对照组比较**P < 0.01;与LPS组比较#P < 0.05,##P < 0.01 表 2 LPS作用12 h前后各处理组TEER值变化情况比较(x±s)
分组 n TEER值/Ω×cm2 LPS作用0 h LPS作用12 h 正常对照组 3 13.55±1.26 13.60±0.33 LPS组 3 13.77±0.29 11.94±0.17* TMP低剂量防治组 3 14.92±0.67 13.21±0.95 TMP中剂量防治组 3 14.87±1.13 14.09±1.01## TMP高剂量防治组 3 14.15±0.82 13.54±1.08# 纯TMP组 3 13.33±0.58 14.04±0.35 F — 1.884 3.366 P — >0.05 < 0.05 MS组内 — 0.729 0.558 q检验:与正常对照组比较*P < 0.05;与LPS组比较#P < 0.05,##P < 0.01 表 3 各组Rac1-GTPase、Rac1、LIMK1、p-LIMK1蛋白相对表达量比较(x±s;ni=3)
分组 Rac1-GTPase蛋白相对表达量 Rac1蛋白相对表达量 LIMK1蛋白相对表达量 P-LIMK1蛋白相对表达量 正常对照组 0.85±0.04 1.15±0.06 0.82±0.04 0.26±0.02 LPS组 1.30±0.08** 1.61±0.05** 1.03±0.08** 0.34±0.04** TMP低剂量防治组 1.12±0.16* 1.50±0.07** 1.01±0.01** 0.32±0.03* TMP中剂量防治组 1.09±0.14* 1.46±0.07**## 0.91±0.04# 0.28±0.01# TMP高剂量防治组 1.01±0.18## 1.36±0.07**## 0.87±0.03## 0.26±0.04## 纯TMP组 0.93±0.13 1.37±0.08** 0.79±0.09 0.24±0.02 F值 4.303 17.388 9.931 5.727 P值 < 0.05 < 0.01 < 0.01 < 0.01 MS组内 0.018 0.004 0.003 0.001 q检验:与正常对照组比较*P < 0.05, **P < 0.01;与LPS组比较#P < 0.05, ##P < 0.01 -
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