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缺血性脑卒中作为脑卒中常见的一种类型，占所有脑卒中病例的60%~70%。缺血性脑卒中是世界范围内导致脑卒中病人死亡和致残的主要原因之一，而且缺血性脑卒中后很大可能出现的认知功能障碍(post-stroke cognitive impairment，PSCI) 严重影响卒中病人的生活质量，卒中后PSCI已成为当前国际卒中研究和干预的热点[1]。缺血性脑卒中的流行是遗传易感性和众多血管危险因素协同作用的结果[2]，但是对于缺血性脑卒中后PSCI，近年来相关性研究较少。孟德尔随机化方法(Mendelian randomisation，MR)是运用孟德尔独立分配定律，将不同基因型导致不同的中间表型(即待研究的相关暴露因素)，用基因-疾病的因果链来推导暴露因素对疾病的作用，计算出暴露因素对疾病或其他结局的真实效应值。近30年来，MR在心脑血管疾病领域的病因预测开发中发挥了举足轻重的作用[3]。
线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)是代谢乙醛和多种有毒醛的重要酶。在ALDH2 rs671位点G突变为A的基因突变个体中，ALDH2酶活性严重降低，在东亚人中尤为明显[4]。越来越多的流行病学调查[5]显示，ALDH2基因多态性与心血管危险因素和脑卒中发病率的增加密切相关。来自实验研究的证据也表明，ALDH2有助于活性醛的清除，并缩小脑梗死的范围，改善卒中后神经功能损伤状态，有利于病人预后[6]。因此，本研究拟通过工具变量如饮酒代谢强相关基因ALDH2 rs671的改变探究饮酒相关暴露因素如饮酒史和饮酒是否脸红等变量对缺血性脑卒中PSCI影响的因果关系，为缺血性脑卒中后PSCI的预防和治疗提供参考依据。
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将2018年7月至2019年1月蚌埠医学院第一附属医院神经内科收治的缺血性脑卒中病人纳入本研究。研究获得了蚌埠医学院第一附属医院伦理委员会的批准，符合赫尔辛基宣言。所有参与者或其亲属提供书面知情同意，纳入标准：(1)年龄18~90岁；(2)入院时通过计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)证实缺血性脑卒中的诊断；(3)病人有能力和意愿签署知情同意书。排除标准：(1)原发性出血性脑卒中或短暂性脑缺血发作；(2)任何中枢神经系统疾病如脑卒中前痴呆或帕金森氏病；(3)严重失语或构音障碍，视觉或听觉障碍及急性或慢性炎症性疾病病人。
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通过课题组前期制定的标准化问卷采用面对面访谈收集人口学和临床特征信息。人群一般特征信息调查包括年龄、性别、种族和教育水平，其他临床资料包括脑梗死种类(按照OSCP分型)、饮酒状况(曾经饮酒为过去任何时候饮酒量≥1标准杯，现饮酒为过去30 d内至少有一次饮酒量≥1标准杯[7])等。病人的认知功能用蒙特利尔认知评估(MoCA)量表评估。MoCA量表有30项测试，评估以下7个认知领域：视觉空间/执行功能、命名、记忆、注意力、语言、抽象和方向。MoCA量表已被翻译成中文，并被验证为中国人群PSCI和痴呆的筛查工具[8]。量表评分均按标准执行，MoCA量表总分30分，得分 < 26分为PSCI[9-10]。
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在病人签署知情同意书后，抽取空腹静脉血5 mL左右，一管血含抗凝剂乙二胺四乙酸(EDTA)，防止其在运送过程中凝血，利用Tiangen血液基因组DNA提取试剂盒(货号：DP348-02)用于提取血液基因组DNA；另一管血为不含EDTA的生化检测管，其作用是分出血清进行酶联免疫吸附法(ELISA)测定病人血清中4-羟基壬烯醛(4-HNE)的水平。
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聚合酶链式反应(PCR)扩增目标序列：从血液中提取的基因组DNA，经过酶标仪测得质量浓度20 ng/μL以上, 纯度用OD260/OD280表示，数值在1.7~1.9之间为纯度合格，PCR扩增目标序列，目标序列中含有所研究的ALDH2 rs671基因位点，体系共50 μL，其中50 ng的DNA样本、2 μL上游产物和2 μL下游产物(上海生工公司合成)、25 μL PCR Master Mix(2X)(thermo scientific公司，Lithuania，K0171)、其余用ddH2O或DEPC水配到50 μL。PCR反应体系经课题组前期文献研究及验证确定为：预变性95 ℃ 3 min、变性95 ℃ 30 s、退火55 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 1 min、变性到延伸共40个循环，最后延伸72 ℃ 10 min、4 ℃保存半个小时以稳定反应产物。结束后经1%琼脂糖凝胶，125 V，30 min电泳，电泳结果经凝胶成像系统鉴定。
纯化PCR产物及基因序列测定：经过PCR扩增的DNA产物经过Tiangen普通DNA产物纯化试剂盒(DP204-02)纯化后，测定得出目标序列的正向碱基对序列，经过Gene Bank中找到的ALDH2 rs671位置附近的序列及引物序列核对，根据位置所处的峰值显示，最终确定ALDH2的基因型。
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MR基本原理的三个假设：(1)遗传变异G与暴露或中间表型X有关；(2)除了通过暴露或中间表型X外，遗传变异G与结果Y无关；(3)遗传变异G与已知或未知的混杂因素C无关。
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采用逆方差加权法(IVW)、方差分析、Hardy-Weinberg平衡分析、二元logistic回归分析。
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将131例病人按照MoCA量表 26分划分标准分为PSCI组94例和非PSCI组37例，文化程度、饮酒后是否脸红和是否有饮酒史对病人PSCI的影响具有统计学意义(P < 0.05)。缺血性脑卒中有部分前循环梗死24例(18.32%)、腔隙性脑梗死71例(54.20%)、后循环梗死36例(27.48%)，PSCI分组中梗死类型分布的差异无统计学意义(P>0.05)(见表 1)。
分组 n 男 女 年龄/岁 受教育程度 ≤60 >60 未接受教育 小学未毕业 小学毕业 初中毕业 高中中专技校 大专及以上 PSCI组 94 55 39 32 62 32 13 19 17 10 3 非PSCI组 37 21 16 19 18 2 1 8 13 9 4 χ2 — 0.03 3.35 23.82 P — >0.05 >0.05 < 0.05 分组 n 脑梗死类型 饮酒史 饮酒是否脸红 饮酒种类 部分前循环梗死 腔隙性脑梗死 后循环梗死 不饮酒 曾经饮酒 现在饮酒 经常 偶尔 不脸红 白酒 红酒 啤酒 PSCI组 94 17 49 28 56 19 19 19 26 49 35 1 1 非PSCI组 37 7 22 8 15 7 15 22 5 10 21 1 1 χ2 — 0.92 6.02 19.03 0.25 P — >0.05 < 0.05 < 0.05 >0.05 表 1 缺血性脑卒中PSCI的一般人群特征(n)
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从病人全血中提取DNA浓度为(54.88±20.59)ng/μL，纯度(OD260/OD280)均在1.7~1.9之间，通过ALDH2 rs671位点的多态性决定其基因型，其中G突变为A，野生GG型76例，突变杂合AG型52例和突变纯和AA型3例，该基因位点经过Hardy-Weinberg遗传平衡定量分析显示具有恒定性(P>0.05)(见表 2)。
基因型 n 构成比/% Hardy-Weinberg平衡分析检验 P AA型 3 2.29 AG型 52 39.69 GG型 76 58.02 合计 131 100.00 等位基因 1.63 >0.05 A等位基因 58 22.14 G等位基因 204 77.86 合计 262 100.00 表 2 ALDH2 rs671基因的Hardy-Weinberg遗传平衡分析结果
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ALDH2各基因型MoCA得分差异经过单因素方差分析发现不具有统计学意义(P>0.05)，根据ALDH2基因型分组分析病人调查问卷中相关变量，发现相关协变量(如性别，年龄和梗死类型等)中ALDH2基因型的分布差异不具有统计学意义(P>0.05)，说明该工具变量ALDH2基因与一些协变量无关，而对于各ALDH2基因型分组的血清4-HNE浓度的差异经过单因素方差分析发现具有统计学意义(P < 0.05)，饮酒暴露相关变量如饮酒史情况和饮酒后是否脸红等变量，对ALDH2基因型野生型和突变型分布的影响具有统计学意义(P < 0.05)(见表 3)。
分组 MoCA得分/分 4-HNE/(ng/μL) 男 女 年龄 脑梗死类型 饮酒史 饮酒是否脸红 ≤60岁 >60岁 部分前循环梗死 腔隙性脑梗死 后循环梗死 不饮酒 曾经饮酒 现在饮酒 经常 偶尔 不脸红 AA型 19.67±5.31 71.17±37.01 1 2 2 1 0 1 2 3 0 0 2 1 0 AG型 20.52±6.67 40.28±12.29# 31 21 15 37 5 30 17 31 13 8 22 18 12 GG型 20.78±6.77 39.90±9.74# 44 32 34 42 19 40 17 37 13 26 35 13 28 F 0.06 10.36 0.80* 4.32* 7.32* 9.77* 8.08* P >0.05 < 0.05 >0.05 >0.05 >0.05 < 0.05 < 0.05 MS组内 2.522 421.241 — — — — — *示χ2值；q检验：与AA比较#P < 0.05 表 3 ALDH2不同基因型相关变量的比较(x±s)
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将上述符合MR假设的ALDH2基因型与饮酒后是否脸红及饮酒史纳入MR，进一步利用ALDH2基因型作为工具变量分析饮酒相关暴露因素与缺血性脑卒中PSCI之间的效应值(见表 4)。因此有饮酒史与PSCI之间的因果关系值βIVW有饮酒史=βXY有饮酒史=0.606(OR=3.334，95%CI：3.038~3.653)；饮酒后脸红与PSCI之间的因果关系值为βIVW脸红=βXY脸红=0.320(OR=4.908，95%CI：4.739~6.475)。
工具变量 B SE Waldχ2 P OR(95%CI) PSCI GG野生型 — — — — 1 AA+AG突变型 0.563 0.408 1.91 0.167 1.757(0.790~3.905) 饮酒史 GG野生型 — — — — 1 AA+AG突变型 -0.640 0.361 3.15 0.076 0.527(0.260~1.069) 饮酒脸红 GG野生型 — — — — 1 AA+AG突变型 -1.037 0.421 5.97 0.023 0.358(0.122~0.824) 注：以GG野生型为参照的回归分析结果 表 4 ALDH2基因对PSCI和饮酒相关暴露因素的多因素分析结果
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有研究[11]表明ALDH2基因第12外显子中常见的功能单核苷酸多态性(SNP)是缺血性脑卒中的危险指标，SNP是基因组中存在的最丰富和最稳定的遗传变异。本研究对酒精代谢强相关基因ALDH2 rs671位点基因型进行Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验得差异无统计学意义(P>0.05)，说明本研究人群样本具有区域群体代表性[12]。本研究满足MR因果分析原理的3个基础假设，即遗传工具变量与暴露或中间表型有关，通过ALDH2基因野生型和突变型之间饮酒相关暴露因素分析，发现饮酒暴露因素中饮酒史和饮酒是否脸红与ALDH2基因型的差异具有统计学意义(P < 0.05)；除了通过暴露或中间表型外，遗传变异与结果无关，ALDH2基因型对缺血性脑卒中认知功能是否损伤的差异不具有统计学意义(P>0.05)；遗传变异与已知或未知的混杂因素无关，经过Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，ALDH2 rs671基因位点具有恒定性，不受妊娠和其他环境因素的影响。研究发现是否具有饮酒史与病人PSCI间的差异具有统计学意义(P < 0.05)，证明饮酒是脑卒中的独立危险因素，影响疾病的严重程度及预后转归[13]。在调整相关协变量后，采用二分类logistics回归分析发现饮酒后脸红是PSCI的危险性因素。MR分析饮酒相关暴露因素时发现饮酒后脸红与PSCI之间的因果关系值为βIVW脸红=βXY脸红=0.320(OR=4.908，95%CI：4.739~6.475)，有饮酒史与PSCI之间的因果关系值为βIVW有饮酒史=βXY有饮酒史=0.606(OR=3.334，95%CI：3.038~3.653)，显示有饮酒史及饮酒后脸红与缺血性脑卒中后PSCI之间存在因果关系，即有有饮酒史和饮酒后脸红是PSCI的危险因素，相关饮酒暴露如饮酒或饮酒后脸红会增加缺血性脑卒中PSCI的危险性。
本研究是基于MR分析原理来探究饮酒相关暴露与缺血性脑卒中病人PSCI的因果关系，利用与饮酒代谢强相关基因ALDH2基因作为工具变量来分析饮酒暴露与病人PSCI之间的因果关系。最终结果显示，有饮酒史和饮酒后脸红是缺血性脑卒中PSCI的危险因素，相关饮酒暴露如饮酒或饮酒后脸红会增加PSCI的发生概率(OR>1，95%CI均>1)。此结果提示缺血性脑卒中病人入院前有饮酒史和喝酒后脸红是导致病人PSCI的重要危险因素，在健康人群或高危人群中倡导减少酒精的摄入，喝酒后脸红病人尽量减少饮用酒精或者不喝酒，能够有效地降低缺血性脑卒中PSCI的发生风险，其机制可能与人体在饮酒后，机体内酒精不能及时、完全代谢消除时，易产生一些有毒的醛类和一些自由基，引起正常膜结构功能的破坏，造成皮下一些微血管的破裂，引起酒后脸红，酒精的代谢产物还能与脑组织中的卵磷脂结合，会直接损伤脑内神经细胞。大脑中的脑白质由神经纤维聚集而成，参与执行、注意、记忆以及视觉空间等脑功能活动，而大脑完整的白质连接是维持正常认知功能的结构基础[14]。酒精及其一些代谢产物的神经毒性均可降低神经元活动，干扰神经递质的释放与表达。酒精通过以上作用机制造成病人学习记忆等PSCI[15]。
本研究首次基于孟德尔随机化分析方法研究饮酒暴露与缺血性脑卒中PSCI间的因果关系，发现缺血性脑卒中病人入院前有饮酒史和饮酒后脸红与其PSCI间存在正向因果关联。但本研究人群中完全前循环梗死病人出现完全大脑中动脉综合征即三偏症、意识障碍和失语，无法完成问卷调查。其次一些调查者拒绝参与抽血检测，导致部分抽样偏倚。其次是利用MR和横断面调查资料进行因果推断，虽然MR研究对生物标志物与缺血性脑卒中PSCI的因果关系提供了大量证据，但这方面依托的队列研究较少，是进一步研究的方向。最后，ALDH2等位突变基因是缺血性脑卒中的重要危险因素，但不同民族、不同国家和不同地区的研究结果不完全一致，对于不同人群的基因研究还需进一步综述和论证。
基于孟德尔随机化分析的饮酒与缺血性脑卒中PSCI因果关联研究
Causal association between alcohol consumption and post-stroke cognitive impairment based on Mendelian randomization study
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摘要:
目的采用孟德尔随机化分析方法探讨饮酒与缺血性脑卒中认知功能障碍（post-stroke cognitive impairment，PSCI）之间因果关联。 方法基于孟德尔随机化逆方差加权法（inverse-variance weighted，IVW），利用工具变量如酒精代谢强相关基因ALDH2不同基因型评估饮酒相关暴露因素和PSCI的因果关系，采用二分类logistic分析方法检验相关显著性。 结果文化程度、饮酒后是否脸红和是否有饮酒史对病人PSCI的影响具有统计学意义（P < 0.05）。从病人全血中提取DNA浓度为（54.88±20.59）ng/μL，纯度均在1.7~1.9之间，通过ALDH2 rs671位点的多态性决定其基因型，其中G突变为A，野生GG型76例，突变杂合AG型52例和突变纯和AA型3例，该基因位点经过Hardy-Weinberg遗传平衡定量分析显示具有恒定性（P>0.05）。有饮酒史与PSCI之间的因果关系值为βIVW有饮酒史=0.606（OR=3.334，95%CI：3.038~3.653），饮酒后脸红与PSCI之间的因果关系值为βIVW脸红=0.320（OR=4.908，95%CI：4.739~6.475）。 结论缺血性脑卒中病人入院前有饮酒史和饮酒后脸红与其PSCI存在正向因果关联。 Abstract:ObjectiveTo explore the causal relationship between alcohol consumption and post-stroke cognitive impairment(PSCI) based on Mendelian. MethodsBased on Mendelian randomization inverse-variance weighted(IVW), the causal relationship between drinking-related exposure factors and PSCI was evaluated using instrumental variables such as ALDH2 genotypes, and two-classification logistics analysis was used to test the significance of correlation. ResultsThe differences of the effects of the education level, flush after drinking and history of alcohol consumption on PSCI were statistically significant(P < 0.05).The concentration and purity of DNA in whole blood of patients were(54.88±20.59)ng/μL and(1.7-1.9), respectively.The genotype was determined by the polymorphism of ALDH2 rs671 site, and the G mutated to A.There were 76 cases of wild GG type, 52 cases of mutant heterozygous AG type and 3 cases of mutant pure and AA type, the results of quantitative analysis of Hardy-Weinberg genetic balance showed that this gene locus was stable(P>0.05).The causality between PSCI and history of alcohol consumption was βIVW alcohol consumption history=0.606(OR=3.334, 95%CI: 3.038-3.653), and the causality between PSCI and blush after alcohol consumption was βIVW blush after drinking=0.320(OR=4.908, 95%CI: 4.739-6.475). ConclusionsThere is a positive causality between PSCI, and history of alcohol consumption and blush after drinking in patients with ischemic stroke before admission. -
表 1 缺血性脑卒中PSCI的一般人群特征(n)
分组 n 男 女 年龄/岁 受教育程度 ≤60 >60 未接受教育 小学未毕业 小学毕业 初中毕业 高中中专技校 大专及以上 PSCI组 94 55 39 32 62 32 13 19 17 10 3 非PSCI组 37 21 16 19 18 2 1 8 13 9 4 χ2 — 0.03 3.35 23.82 P — >0.05 >0.05 < 0.05 分组 n 脑梗死类型 饮酒史 饮酒是否脸红 饮酒种类 部分前循环梗死 腔隙性脑梗死 后循环梗死 不饮酒 曾经饮酒 现在饮酒 经常 偶尔 不脸红 白酒 红酒 啤酒 PSCI组 94 17 49 28 56 19 19 19 26 49 35 1 1 非PSCI组 37 7 22 8 15 7 15 22 5 10 21 1 1 χ2 — 0.92 6.02 19.03 0.25 P — >0.05 < 0.05 < 0.05 >0.05 
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表 2 ALDH2 rs671基因的Hardy-Weinberg遗传平衡分析结果
基因型 n 构成比/% Hardy-Weinberg平衡分析检验 P AA型 3 2.29 AG型 52 39.69 GG型 76 58.02 合计 131 100.00 等位基因 1.63 >0.05 A等位基因 58 22.14 G等位基因 204 77.86 合计 262 100.00
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表 3 ALDH2不同基因型相关变量的比较(x±s)
分组 MoCA得分/分 4-HNE/(ng/μL) 男 女 年龄 脑梗死类型 饮酒史 饮酒是否脸红 ≤60岁 >60岁 部分前循环梗死 腔隙性脑梗死 后循环梗死 不饮酒 曾经饮酒 现在饮酒 经常 偶尔 不脸红 AA型 19.67±5.31 71.17±37.01 1 2 2 1 0 1 2 3 0 0 2 1 0 AG型 20.52±6.67 40.28±12.29# 31 21 15 37 5 30 17 31 13 8 22 18 12 GG型 20.78±6.77 39.90±9.74# 44 32 34 42 19 40 17 37 13 26 35 13 28 F 0.06 10.36 0.80* 4.32* 7.32* 9.77* 8.08* P >0.05 < 0.05 >0.05 >0.05 >0.05 < 0.05 < 0.05 MS组内 2.522 421.241 — — — — — *示χ2值；q检验：与AA比较#P < 0.05
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表 4 ALDH2基因对PSCI和饮酒相关暴露因素的多因素分析结果
工具变量 B SE Waldχ2 P OR(95%CI) PSCI GG野生型 — — — — 1 AA+AG突变型 0.563 0.408 1.91 0.167 1.757(0.790~3.905) 饮酒史 GG野生型 — — — — 1 AA+AG突变型 -0.640 0.361 3.15 0.076 0.527(0.260~1.069) 饮酒脸红 GG野生型 — — — — 1 AA+AG突变型 -1.037 0.421 5.97 0.023 0.358(0.122~0.824) 注：以GG野生型为参照的回归分析结果
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