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口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是生长快速、具有早期浸润和转移特点的细胞高增殖性肿瘤，是口腔颌面部恶性肿瘤最常见的病理类型，约占90%[1]。OSCC的发生、发展是多因素相互作用的结果，多种蛋白和基因的异常表达是病变形成的重要促进因素[2]。此外，长期吸烟、饮酒及HPV感染等都是OSCC发生的高危因素[3-4]。临床针对OSCC病人多采用综合序列治疗，但OSCC早期症状不明显, 晚期常伴随远处淋巴结转移，致其5年总体生存率低于50%[5]。研究[6]发现，SOX基因家族成员的异常表达参与肿瘤增殖、转移及凋亡等进程，在肿瘤发生、发展过程中起重要作用。SOX9基因属于SOXE亚族，在卵巢癌[7]、睾丸癌[8]等癌症中呈强阳性表达，且表达水平的高低与肿瘤的生长和转移有关[9]。SOX3基因属于SOXB1亚族，可抑制祖细胞分化[10]，其在卵巢癌细胞中亦呈高表达[11]。研究[12-13]显示，SOX3、SOX9都可通过激活Wnt/β-catenin通路促进肿瘤细胞的增殖、迁移。本研究采用免疫组织化学染色法检测SOX3、SOX9在OSCC中的蛋白表达情况，分析其与临床病理参数之间的相关性，探讨SOX3、SOX9在OSCC临床病理诊断中的应用价值。现作报道。
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选择2015-2020年我院口腔颌面外科收治并经组织病理确诊的口腔鳞癌初治病人(经化疗、放疗及其他头颈部鳞癌相关治疗后的病人除外)60例。其中男40例，女20例；年龄41~89岁；部位：舌17例，面部14例，唇9例，颊黏膜7例，牙龈4例，颈部4例，上腭3例，口底2例；TNM分期：Ⅰ期+Ⅱ期38例，Ⅲ期+Ⅳ期22例。选择相应癌旁组织60例为对照组。甲醛固定-石蜡包埋病理组织及配对癌旁组织均保存于我院病理科标本库。
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兔抗人SOX3多克隆抗体(ab229626，Abcam公司，英国)，兔抗人SOX9多克隆抗体(ab185966，Abcam公司，英国)，免疫组织化学试剂盒(SP9001，中杉金桥生物，中国)，二氨基联苯胺(diaminobenzidine, DAB)试剂盒(ZLI-9018, 中杉金桥生物，中国)。
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病理医师检索调取组织后对标本进行观察并制作组织芯片，60 ℃恒温箱中烘烤过夜，二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，枸橼酸钠溶液微波加热修复抗原，3% H2O2阻断内源性过氧化物酶，山羊血清封闭，SOX3、SOX9(稀释浓度均为1∶ 100)抗体4 ℃孵育过夜，PBS震洗后二抗孵育，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。显微镜下对切片拍照并进行SOX3、SOX9染色强度评分。
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切片均在10倍镜下观察5个完整视野，共计数500个细胞，在高倍镜(×400)下对切片结果进行观察，实验结果由病理科2位经验丰富医师随机双盲阅片并评分。根据染色强度评分：无色(0分)、浅棕色(1分)、棕黄色(2分)、棕褐色(3分)。根据着色细胞百分比评价染色范围：0%~5%(0分)、6%~25%(1分)、26%~50%(2分)、51%~75%(3分)、76%~100%(4分)。结果分数=染色强度×染色范围，其中0~1分为阴性，2~12分为阳性。
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采用χ2检验、logistic回归分析和Spearman相关分析。
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SOX3、SOX9在OSCC及相应癌旁组织中均呈阳性表达，细胞核见黄色或棕褐色颗粒(见图 1)；SOX3、SOX9在OSCC组织中阳性表达率均明显高于相应癌旁组织(P < 0.01)(见表 1)。
图 1 SOX3和SOX9在OSCC及相应癌旁组织中表达
分组 n SOX3 SOX9 OSCC 60 33(55.00) 31(51.67) 癌旁组织 60 10(16.67) 9(15.00) χ2 — 19.17 18.15 P — < 0.01 < 0.01 表 1 SOX3、SOX9蛋白在OSCC及相应癌旁组织中阳性表达率比较[n；百分率(%)]
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单因素分析显示，不同TNM分期和淋巴结转移情况病人的SOX3、SOX9蛋白表达水平差异均有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01)，而不同性别、年龄、肿瘤分化程度病人的SOX3、SOX9表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)(见表 2)。Logistic多因素回归分析显示，TNM分期、淋巴结转移均为SOX3、SOX9表达的独立影响因素(P < 0.01)(见表 3~4)。相关分析显示，OSCC组织中SOX3与SOX9蛋白表达呈明显正相关关系(r=0.398，P < 0.01)。
临床参数 n SOX3 χ2 P SOX9 χ2 P + - + - 性别 男 40 23 17 0.30 >0.05 20 20 0.13 >0.05 女 20 10 10 11 9 年龄/岁 ≥60 44 23 21 0.50 >0.05 22 22 0.18 >0.05 < 60 16 10 6 9 7 TNM分期 T1+T2 38 16 22 6.96 < 0.05 15 23 6.17 < 0.05 T3+T4 22 17 5 16 6 肿瘤分化程度 高 42 23 19 0.00 >0.05 19 23 2.32 >0.05 中低 18 10 8 12 6 淋巴结转移 有 15 13 2 6.49 < 0.05 14 1 13.90 < 0.01 无 45 20 25 17 28 表 2 SOX3、SOX9表达与OSCC病人临床病理参数的单因素分析(n)
因素 B SE Waldχ2 P OR 95%CI TNM分期 3.121 0.801 15.168 < 0.01 22.667 4.713~109.017 淋巴结转移 3.769 0.980 14.793 < 0.01 43.333 6.349~295.759 表 3 SOX3阳性表达与OSCC临床病理参数的logistic回归分析
因素 B SE Waldχ2 P OR 95%CI TNM分期 4.072 1.129 13.008 < 0.01 58.667 6.418~536.279 淋巴结转移 5.730 1.455 15.511 < 0.01 308.000 17.787~5 333.441 表 4 SOX9阳性表达与OSCC临床病理参数的logistic回归分析
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当代医疗对OSCC病人采用综合序列治疗，提高了整体治疗水平，但总体5年生存率仍较低[14]。分子生物学在医学中的应用证实，肿瘤的发生、发展及预后受到各基因的调控，积极寻找OSCC早期诊断基因对提高总体生存率具有重要意义。SOX3是位于染色体Xq27.1的一种转录因子，常见于脊椎动物神经系统发育过程中，在神经细胞的发育分化过程中表达逐渐下降[15]。SOX3蛋白表达异常会导致认知功能障碍、性别决定异常[16]。近年研究发现，SOX3可能是一种影响肿瘤生物学行为的原癌基因，SOX3可能作为骨肉瘤的致癌基因，下调SOX3可抑制骨肉瘤进展[17]；神经胶质瘤组织中的SOX3表达高于非肿瘤组织，SOX3可以促进胶质母细胞瘤细胞的恶性行为[18]；SOX3在人上皮性卵巢癌细胞株中高表达与病人总体生存时间有关[11]；李坤等[12, 19]研究SOX3在食管鳞癌中表达及发生发展机制，结果表明SOX3在食管鳞癌中高表达，与病人预后有关。抑制SOX3后检测食管鳞癌细胞Wnt/β-catenin信号通路关键因子表达，证实SOX3通过Wnt/β-catenin信号通路调控食管鳞癌细胞的生物学行为。
SOX9是定位在染色体17q24的重要转录因子，与软骨形成、神经发育及多种器官的分化和发育成熟相关，在维持细胞干性及组织稳态中具有重要意义[20-21]。有研究[22]显示，SOX9是对肿瘤的发生、转移有促进作用的癌基因，SOX9蛋白的异常表达与多种肿瘤生长及病理变化有关。YU等[23]研究表明，SOX9可能是一种引起乳腺癌的原癌基因，参与乳腺癌进展中的各种重要过程。WANG等[24]对197例食管癌组织研究发现，Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)、SOX9的表达水平升高，YAP可激活其下游靶SOX9，SOX9诱导的YAP靶向mRNA转录后抑制了YAP的表达，促成了负反馈机制。YAP和SOX9的双重作用抑制了恶性表型。YAP基因过度激活破坏了YAP-SOX9反馈环，表明YAP-SOX9回路是一个潜在的治疗靶点。更有研究[25]表明，上调SOX9可促进食管鳞状细胞癌进展，高表达的SOX9与更高的TNM分期、转移和更差的预后有关。而SOX9下调可以减弱OSCC细胞侵袭、迁移和克隆形成能力[26]。提示SOX3可能是影响肿瘤生物学行为的原癌基因，SOX9亦是对肿瘤的发生、转移有促进作用的癌基因。本研究结果显示，OSCC组织中SOX3、SOX9呈高表达，且SOX3、SOX9表达水平与OSCC病人TNM分期和淋巴结转移情况相关，与病人年龄、性别、肿瘤分化程度无关，且SOX3与SOX9表达呈明显正相关关系，提示SOX3、SOX9可能参与OSCC的发生、发展及转移过程。
综上，SOX3、SOX9在OSCC中高表达，且与病人TNM分期、淋巴结转移情况相关，可能参与OSCC的发生、发展，有望作为口腔鳞癌早期诊断的生物标志物。
SOX3、SOX9在口腔鳞状细胞癌中的表达及其临床意义
Expression and clinical significance of SOX3 and SOX9 in oral squamous cell carcinoma
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摘要:
目的 探讨口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)和癌旁组织中SOX3、SOX9蛋白表达情况及临床意义。 方法 采用免疫组织化学染色法检测60例OSCC组织及相应癌旁正常组织中SOX3、SOX9蛋白表达情况，分析SOX3、SOX9在OSCC中的表达及其与临床病理因素的相关性。 结果 SOX3、SOX9在OSCC组织中阳性表达率均明显高于相应癌旁组织(P < 0.01)。单因素分析显示，不同TNM分期和淋巴结转移情况的病人其SOX3、SOX9蛋白表达水平差异均有统计学意义(P < 0.05~P < 0.01)，而不同性别、年龄、肿瘤分化程度病人的SOX3、SOX9表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。Logistic多因素回归分析显示，TNM分期、淋巴结转移均为SOX3、SOX9表达的独立影响因素(P < 0.01)。相关分析显示，OSCC组织中SOX3与SOX9蛋白表达呈明显正相关关系(r=0.398，P < 0.01)。 结论 SOX3、SOX9可能参与OSCC的发生、发展过程，对肿瘤的侵袭和转移起促进作用。 Abstract:Objective To investigate the expression levels and clinical significance of SOX3 and SOX9 in the oral squamous cell carcinoma(OSCC). Methods The expression levels of SOX3 and SOX9 protein in 60 cases of OSCC tissue and adjacent normal tissue were detected using immunohistochemistry method.The relationship between the expression levels SOX3 and SOX9, and clinicopathologic features were analyzed. Results The positive rates of SOX3 and SOX9 in OSCC tissue were significantly higher than those in paracancerous normal tissue(P < 0.01).The results of univariate analysis showed that the differences of the expression levels of SOX3 and SOX9 protein in patients with different TNM stages and lymph node metastasis were statistically significant(P < 0.05 to P < 0.01), while there was no statistical significance in the protein expression levels of SOX3 and SOX9 in patients with different gender, age and degree of tumor differentiation(P>0.05).The results of logistic multifactor regression analysis showed that the TNM stage and lymph node metastasis were the independent influencing factors of SOX3 and SOX9 expression(P < 0.01).The results of correlation analysis showed that the expression of SOX3 was positively correlated with expression level of SOX9 protein in OSCC tissue(r=0.398, P < 0.01). Conclusions The SOX3 and SOX9 may be involved in the occurrence and development of oral squamous cell carcinoma, and promote the invasion and metastasis of tumor cells. -
Key words:
- oral squamous cell carcinoma /
- SOX3 /
- SOX9
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表 1 SOX3、SOX9蛋白在OSCC及相应癌旁组织中阳性表达率比较[n；百分率(%)]
分组 n SOX3 SOX9 OSCC 60 33(55.00) 31(51.67) 癌旁组织 60 10(16.67) 9(15.00) χ2 — 19.17 18.15 P — < 0.01 < 0.01 
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表 2 SOX3、SOX9表达与OSCC病人临床病理参数的单因素分析(n)
临床参数 n SOX3 χ2 P SOX9 χ2 P + - + - 性别 男 40 23 17 0.30 >0.05 20 20 0.13 >0.05 女 20 10 10 11 9 年龄/岁 ≥60 44 23 21 0.50 >0.05 22 22 0.18 >0.05 < 60 16 10 6 9 7 TNM分期 T1+T2 38 16 22 6.96 < 0.05 15 23 6.17 < 0.05 T3+T4 22 17 5 16 6 肿瘤分化程度 高 42 23 19 0.00 >0.05 19 23 2.32 >0.05 中低 18 10 8 12 6 淋巴结转移 有 15 13 2 6.49 < 0.05 14 1 13.90 < 0.01 无 45 20 25 17 28
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表 3 SOX3阳性表达与OSCC临床病理参数的logistic回归分析
因素 B SE Waldχ2 P OR 95%CI TNM分期 3.121 0.801 15.168 < 0.01 22.667 4.713~109.017 淋巴结转移 3.769 0.980 14.793 < 0.01 43.333 6.349~295.759
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表 4 SOX9阳性表达与OSCC临床病理参数的logistic回归分析
因素 B SE Waldχ2 P OR 95%CI TNM分期 4.072 1.129 13.008 < 0.01 58.667 6.418~536.279 淋巴结转移 5.730 1.455 15.511 < 0.01 308.000 17.787~5 333.441
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