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双氢青蒿素通过调节Th17/Treg平衡改善银屑病小鼠皮损机制研究

江从军 周艳梅

引用本文:
Citation:

双氢青蒿素通过调节Th17/Treg平衡改善银屑病小鼠皮损机制研究

    作者简介: 江从军(1981-), 男, 硕士, 副主任医师
  • 基金项目:

    蚌埠医学院自然科学重点项目 2020byzd146

  • 中图分类号: R758.63

Dihydroartemisinin alleviates skin lesions in mouse of psoriasis by regulating Th17/Treg balance

  • CLC number: R758.63

  • 摘要: 目的验证双氢青蒿素(DHA)是否能改善咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠皮损, 并探讨其可能的机制。方法24只雌性BALB/c小鼠随机分为4组:空白对照组(Control组)、模型组(Model组)、25 mg/kg DHA治疗组(DHA-L组)、50 mg/kg DHA治疗组(DHA-H组),每组6只。每天观测小鼠皮肤变化并进行PASI评分。连续给药6 d,取小鼠皮肤进行HE染色和Ki67免疫组织化学染色;流式细胞仪检测小鼠脾Th17细胞和调节性T细胞(Treg);ELISA检测小鼠血清白细胞介素17A(IL-17A)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。结果IMQ成功诱导银屑病小鼠模型,DHA治疗后小鼠皮损改善,组织病理学改善,DHA-L和DHA-H组PASI评分及Ki67阳性细胞数量均低于Model组(P < 0.05);Model组脾Th17细胞比例较Control组升高(P < 0.05),DHA-L组和DHA-H组均较Model组降低(P < 0.05);DHA-L组和DHA-H组脾Treg细胞比例较Model组升高(P < 0.05);Model组血清IL-17A和TNF-α水平均较Control组升高(P < 0.05),与Model组相比,血清IL-17A水平在DHA-L和DHA-H组均降低(P < 0.05),而血清TNF-α水平仅DHA-H组降低(P < 0.05)。结论DHA可以改善IMQ诱导的银屑病小鼠皮损,其机制可能和调节Th17/Treg细胞平衡有关。
  • 图 1  小鼠皮肤外观

    图 2  小鼠皮肤组织HE染色及Ki67阳性细胞(免疫组化染色)

    表 1  各组小鼠6d后PASI评分比较(x±s)

    分组 n PASI评分 F P MS组内
    Model组 6 8.83±1.47 11.45 < 0.01 1.761
    DHA-L组 6 6.83±1.47*
    DHA-H组 6 5.17±0.98*#
    q检验:与Model组比较*P < 0.05;与DHA-L组比较#P < 0.05
    下载: 导出CSV

    表 2  各组小鼠表皮厚度、Baker评分及表皮Ki67阳性细胞数比较(x±s)

    分组 n 表皮厚度/μm Baker评分/分 Ki67阳性细胞数/个
    Control组 6 20.17±3.54 0.17±0.26 40.33±8.19
    Model组 6 103.17±10.72* 6.58±0.58* 277.00±37.17*
    DHA-L组 6 62.17±9.49*# 4.50±0.84*# 182.17±17.80*#
    DHA-H组 6 50.17±7.65*#▲ 3.83±0.82*# 158.00±17.03*#
    F 102.79 96.61 110.61
    P < 0.01 < 0.01 < 0.01
    MS组内 69.067 0.444 514.008
    q检验:与Control组比较*P < 0.05;与Model组比较#P < 0.05;与DHA-L组比较▲P < 0.05
    下载: 导出CSV

    表 3  各组小鼠脾Th17细胞和Treg细胞比例比较(x±s)

    分组 n Th17细胞/% Treg细胞/%
    Control组 6 0.67±0.25 5.15±1.62
    Model组 6 1.64±0.60* 7.02±3.02
    DHA-L组 6 1.24±0.49*# 9.48±0.98*#
    DHA-H组 6 0.91±0.18*# 10.78±2.14*#
    F 6.07 8.78
    P < 0.05 < 0.01
    MS组内 0.175 4.321
    q检验:与Control组比较*P < 0.05;与Model组比较#P < 0.05
    下载: 导出CSV

    表 4  各组小鼠血清IL-17A和TNF-α水平比较(x±s)

    分组 n IL-17A/(pg/mL) TNF-α/(pg/mL)
    Control组 6 9.59±1.39 52.76±16.45
    Model组 6 30.89±3.45* 207.63±36.95*
    DHA-L组 6 15.34±2.16*# 180.64±23.66*
    DHA-H组 6 12.87±1.42*# 155.78±21.02*#
    F 107.50 41.70
    P < 0.01 < 0.01
    MS组内 4.978 659.264
    q检验:与Control组比较*P < 0.05;与Model组比较#P < 0.05
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-02-09
  • 录用日期:  2022-08-30
  • 刊出日期:  2022-10-15

双氢青蒿素通过调节Th17/Treg平衡改善银屑病小鼠皮损机制研究

    作者简介: 江从军(1981-), 男, 硕士, 副主任医师
  • 1. 蚌埠医学院第一附属医院 皮肤科, 安徽 蚌埠 233004
  • 2. 蚌埠医学院 基础医学院 组织胚胎学教研室, 安徽 蚌埠 233030
基金项目:  蚌埠医学院自然科学重点项目 2020byzd146

摘要: 目的验证双氢青蒿素(DHA)是否能改善咪喹莫特(IMQ)诱导的银屑病小鼠皮损, 并探讨其可能的机制。方法24只雌性BALB/c小鼠随机分为4组:空白对照组(Control组)、模型组(Model组)、25 mg/kg DHA治疗组(DHA-L组)、50 mg/kg DHA治疗组(DHA-H组),每组6只。每天观测小鼠皮肤变化并进行PASI评分。连续给药6 d,取小鼠皮肤进行HE染色和Ki67免疫组织化学染色;流式细胞仪检测小鼠脾Th17细胞和调节性T细胞(Treg);ELISA检测小鼠血清白细胞介素17A(IL-17A)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。结果IMQ成功诱导银屑病小鼠模型,DHA治疗后小鼠皮损改善,组织病理学改善,DHA-L和DHA-H组PASI评分及Ki67阳性细胞数量均低于Model组(P < 0.05);Model组脾Th17细胞比例较Control组升高(P < 0.05),DHA-L组和DHA-H组均较Model组降低(P < 0.05);DHA-L组和DHA-H组脾Treg细胞比例较Model组升高(P < 0.05);Model组血清IL-17A和TNF-α水平均较Control组升高(P < 0.05),与Model组相比,血清IL-17A水平在DHA-L和DHA-H组均降低(P < 0.05),而血清TNF-α水平仅DHA-H组降低(P < 0.05)。结论DHA可以改善IMQ诱导的银屑病小鼠皮损,其机制可能和调节Th17/Treg细胞平衡有关。

English Abstract

  • 银屑病是一种常见的慢性皮肤病,除了累及皮肤外,合并症的风险也很高,包括银屑病关节炎、克罗恩病、恶性肿瘤、肥胖症和心血管疾病,对病人的生活质量造成重大影响[1]。虽然银屑病的发病机制仍未完全阐明,但Th17细胞已被认为在银屑病免疫炎症中起关键作用[2];相反,调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)主要负责抑制免疫炎症反应,其数量和功能缺陷也参与银屑病的发病[3-4]。双氢青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)近年来备受关注,具有强大的药用价值,其对自身免疫性疾病和肿瘤的治疗具有强效作用,且无明显不良反应[5]。DHA抑制MRL/lpr狼疮小鼠脾细胞中Toll样受体4信号转导通路的激活和Ⅰ型干扰素和抗ds-DNA的产生,以改善狼疮性肾炎的病理损伤[6]。DHA通过调节哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian marget of rapamycin, mTOR)途径下调Th17细胞,上调Treg细胞,从而抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE) 的发生[7]。此外,DHA衍生物DC32通过抑制IL-6恢复Th17/Treg平衡,从而抑制类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA) 滑膜炎中的免疫系统失衡和淋巴细胞浸润[8]。然而,DHA对银屑病的作用鲜有报道。基于以上研究,我们推测DHA对银屑病具有治疗作用,并基于Th17/Treg平衡角度初步探讨DHA调控银屑病的作用机制,为银屑病提供新的治疗药物。

    • BALB/c小鼠(雌性,18~20 g,6~8周龄)购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司;咪喹莫特(imiquimod, IMQ)乳膏(H20030129)购自四川明欣药业有限公司;DHA(71939-50-9)、羧甲基纤维素钠(Sodium carboxymethyl cellulos,CMC-Na)(9004-32-4)购自MCE公司,PMA/Ionomycin Mixture(CS1001)、BFA/Monensin Mixture(CS1002)购自联科生物技术有限公司;RPMI1640培养基购自Hyclone公司;流氏细胞术所需抗体PE/Cyanine7 anti-mouse CD3 Antibody(100220)、FITC anti-mouse CD4 Antibody(100406)、APC anti-mouse CD25 Antibody(101910)、PE anti-mouse FOXP3 Antibody(126404)、PE anti-mouse IL-17A Antibody(506904)购于美国Biolegend公司;anti-Ki67 Antibody (ab16667)购自ABcam公司;小鼠淋巴细胞分离液及ELISA试剂盒购自于深圳达科为生物工程有限公司。

    • 将24只雌性BALB/c小鼠随机分为4组,每组6只:空白对照组(Control组)、模型组(Model组)、25 mg/kg DHA治疗组(DHA-L组)、50 mg/kg DHA治疗组(DHA-H组)。所有小鼠用剃须刀剔除背部毛发(2 cm×3 cm),然后用脱毛膏进一步去除残余毛发,饲养1 d后开始造模,Model组和DHA治疗组每天脱毛区域给予62.5 mgIMQ外涂,Control组给予等量的白凡士林外涂。DHA溶解于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中,分别配成终浓度为2.5 mg/mL和5 mg/mL,现配现用,以防沉淀。各组小鼠均灌胃给药,外涂IMQ或凡士林前1 h给药,每只小鼠灌胃体积为10 mL·kg-1·d-1,Control组和Model组灌胃相应体积的0.5%CMC-Na溶液,连续给药6 d。参照银屑病面积严重程度指数(psoriasis area severity index, PASI)对鳞屑、红斑和皮肤厚度进行评分[9],计算PASI累积评分,以反映皮损的严重程度,评分范围为0~12分。在连续6 d DHA治疗后的第7天实验结束时,对所有动物腹腔注射巴比妥麻醉,眼眶采血后脱颈椎处死。

    • 用眼科剪小心获取小鼠皮肤,制成石蜡切片,常规HE染色。使用Olympus显微镜观察拍照,测量表皮厚度,并采用银屑病病理(Baker)评分系统进行评分[10]

    • 首先用乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)缓冲液修复皮肤组织石蜡切片,并在3%过氧化氢溶液中孵育;切片与一抗anti-Ki67 Antibody在4 ℃的潮湿室中孵育过夜;冲洗后,切片与二抗(HRP-山羊抗兔IgG)孵育1 h,然后二氨基联苯胺显色。为了定量分析Ki67阳性细胞,每张切片在光学显微镜视野下使用Olympus显微镜随机取每个样品的3个区域进行拍照,使用ImagePro Plus 6软件计数表皮基底层Ki67阳性细胞的数量(不计数毛囊中的Ki67阳性细胞)。

    • 采用小鼠淋巴细胞分离液分离获取脾淋巴细胞。取1×106个脾淋巴细胞用于Treg细胞检测;另取1×106个脾淋巴细胞加入24孔版中,每孔体积约1 mL,分别加入PMA/Ionomycin Mixture和BFA/Monensin Mixture各4 μL,置于37 ℃、5%CO2的培养箱培养6 h,用于Th17细胞检测。之后进行小鼠脾淋巴细胞染色,按照说明书先加入PE/Cyanine7 anti-mouse CD3、FITC anti-mouse CD4和APC anti-mouse CD25抗体进行表面染色,固定破膜后加入PE anti-mouse IL-17A或PE anti-mouse FOXP3抗体进行细胞内染色,上机检测后使用FlowJo 10软件分析数据。

    • 小鼠麻醉后摘取眼球取血,室温静置30 min后,4 ℃、2 000 r/min离心获取血清。血清IL-17A和TNF-α通过商品化ELISA试剂盒测定。

    • 采用方差分析和q检验。

    • Control组小鼠皮肤外观正常,Model组小鼠出现红斑、鳞屑和皮肤增厚,DHA治疗后皮损改善(见图 1);治疗6 d后,DHA-L和DHA-H组的评分均明显低于未用DHA的Model组(P < 0.05)(见表 1)。

      图  1  小鼠皮肤外观

      分组 n PASI评分 F P MS组内
      Model组 6 8.83±1.47 11.45 < 0.01 1.761
      DHA-L组 6 6.83±1.47*
      DHA-H组 6 5.17±0.98*#
      q检验:与Model组比较*P < 0.05;与DHA-L组比较#P < 0.05

      表 1  各组小鼠6d后PASI评分比较(x±s)

    • 组织病理学分析显示,与Control组相比,Model组小鼠的表皮增厚、角化过度、表皮突延长、毛细血管扩张和充血以及细胞浸润明显增多。与Model组小鼠相比,接受DHA治疗的小鼠皮肤病理逐渐恢复,表皮厚度和Baker评分下降(P < 0.05);此外,免疫组织化学染色显示,与Model组小鼠相比,DHA-L组和DHA-H组表皮Ki67阳性细胞均减少(P < 0.05)(见图 2表 2)。

      图  2  小鼠皮肤组织HE染色及Ki67阳性细胞(免疫组化染色)

      分组 n 表皮厚度/μm Baker评分/分 Ki67阳性细胞数/个
      Control组 6 20.17±3.54 0.17±0.26 40.33±8.19
      Model组 6 103.17±10.72* 6.58±0.58* 277.00±37.17*
      DHA-L组 6 62.17±9.49*# 4.50±0.84*# 182.17±17.80*#
      DHA-H组 6 50.17±7.65*#▲ 3.83±0.82*# 158.00±17.03*#
      F 102.79 96.61 110.61
      P < 0.01 < 0.01 < 0.01
      MS组内 69.067 0.444 514.008
      q检验:与Control组比较*P < 0.05;与Model组比较#P < 0.05;与DHA-L组比较▲P < 0.05

      表 2  各组小鼠表皮厚度、Baker评分及表皮Ki67阳性细胞数比较(x±s)

    • 与Control组相比,Model组小鼠脾Th17细胞比例升高(P < 0.05),DHA治疗降低了Th17细胞比例,DHA-L和DHA-H组均较Model组降低(P < 0.05);与Model组相比,DHA-L组和DHA-H组小鼠脾Treg细胞比例升高(P < 0.05)(见表 3)。

      分组 n Th17细胞/% Treg细胞/%
      Control组 6 0.67±0.25 5.15±1.62
      Model组 6 1.64±0.60* 7.02±3.02
      DHA-L组 6 1.24±0.49*# 9.48±0.98*#
      DHA-H组 6 0.91±0.18*# 10.78±2.14*#
      F 6.07 8.78
      P < 0.05 < 0.01
      MS组内 0.175 4.321
      q检验:与Control组比较*P < 0.05;与Model组比较#P < 0.05

      表 3  各组小鼠脾Th17细胞和Treg细胞比例比较(x±s)

    • 与Control组相比,Model组血清IL-17A和TNF-α水平均升高(P < 0.05);与Model组相比,DHA-L组和DHA-H组血清IL-17A水平均降低(P < 0.05),而DHA-H组血清TNF-α水平降低(P < 0.05)(见表 4)。

      分组 n IL-17A/(pg/mL) TNF-α/(pg/mL)
      Control组 6 9.59±1.39 52.76±16.45
      Model组 6 30.89±3.45* 207.63±36.95*
      DHA-L组 6 15.34±2.16*# 180.64±23.66*
      DHA-H组 6 12.87±1.42*# 155.78±21.02*#
      F 107.50 41.70
      P < 0.01 < 0.01
      MS组内 4.978 659.264
      q检验:与Control组比较*P < 0.05;与Model组比较#P < 0.05

      表 4  各组小鼠血清IL-17A和TNF-α水平比较(x±s)

    • 银屑病是一种常见的慢性皮肤病,确切病因仍未完全了解,但有证据表明它是一种自身免疫性疾病[11]。银屑病的传统治疗主要包括免疫抑制剂,如甲氨蝶呤和环孢素。然而,传统的免疫抑制药物可能会引起各种不良反应,包括肾毒性、肿瘤和感染[12]。最近,生物治疗包括抑制IL-17和其他促炎细胞因子的抗体,已被证明比传统的免疫抑制剂更有效[13]。不幸的是,它们也比传统药物贵得多, 而且也存在较高的感染风险[14-15]。因此,需要寻求一种有效、安全且廉价的药物来治疗这种慢性皮肤炎症。青蒿素是一种从中草药青蒿中分离出的活性成分,几十年来一直用于治疗疟疾。由于青蒿素的溶解性差和半衰期短,研究人员开发了其具有更好生物利用度的衍生物。DHA是青蒿素的衍生物,比青蒿素具有更好的生物利用度[16],在实验动物模型中已证实对脑脊髓炎、甲状腺炎、系统性红斑狼疮等炎症性疾病具有免疫抑制作用[7, 17-18]。尽管DHA改善自身免疫性疾病的机制在很大程度上仍然未知,但现有的研究表明其作用机制主要包括抑制氧化应激和NF-κB炎症通路以及通过调控mTOR信号转导调节Th17/Treg平衡[7, 16, 19]。本研究首次证明DHA可以通过调节Th17/Treg平衡改善IMQ诱导的银屑病小鼠皮损。

      本研究中,为了确定DHA是否会改善银屑病小鼠皮肤炎症,我们建立了IMQ诱导的银屑病小鼠模型。未涂抹IMQ的对照小鼠皮肤正常,没有任何炎症或病变迹象,而模型组小鼠皮肤表现出与银屑病外观高度相似的红斑、鳞屑和皮肤增厚迹象,皮肤组织病理也与银屑病组织病理学特征相一致,而这些特征在正常对照组小鼠中没有出现。用低剂量或高剂量DHA治疗均可减轻皮肤病变的严重程度,减少红斑、鳞屑和皮肤厚度,组织病理角化过度和角化不全减少,表皮厚度变薄,与CHEN等报道结果一致[20]。角质形成细胞的增生和分化异常是银屑病的重要病理改变。因为Ki67在细胞周期进展的所有活跃阶段都表达,但在静息阶段(G0)不表达,它经常被用作细胞增殖的标志。为了确定DHA是否可以改善角质形成细胞的过度增殖,采用免疫组织化学染色的方法检测小鼠表皮Ki67蛋白表达水平。结果表明,DHA治疗可以明显减少小鼠表皮中Ki67阳性细胞数,证明DHA确实可以通过抑制角质形成细胞的增殖达到治疗银屑病的作用。

      已经证实DHA可以通过调节Th17细胞及其相关细胞因子的产生从而防止EAE的发生[9]。Th17细胞参与了IMQ诱导的银屑病小鼠皮损的形成,为了评估DHA治疗是否影响银屑病中的Th17细胞,本研究检测了DHA治疗前后银屑病小鼠脾Th17细胞比例,发现DHA治疗能降低银屑病小鼠脾脏中Th17细胞的比例。这些发现表明DHA确实抑制了银屑病小鼠Th17细胞的生成,与LIU等的研究结果相一致[21]。与Th17细胞的促炎作用不同,Treg细胞具有抗炎作用,其数量或功能异常导致不能有效抑制炎症[22], 通过恢复其数量或功能有望发挥抗银屑病的作用,常见的免疫抑制剂甲氨蝶呤已被证明有此作用[23]。Treg细胞在IMQ诱导的银屑病小鼠模型中同样发挥重要的作用,其可以通过抑制γδT细胞以及IL-17A和TNF-α来发挥抗银屑病的作用,去除Treg细胞明显加重了银屑病小鼠的症状[24]。因此,我们探讨了DHA是否会通过上调Treg细胞来发挥其对银屑病的治疗作用。我们通过流式细胞术分析检测了小鼠脾脏中Treg细胞比例,发现DHA增加脾脏中Treg细胞的比例。研究[25]发现,DHA在炎症性肠病小鼠模型中可以通过上调Treg细胞发挥抗炎作用。因此,在我们的研究中,DHA通过增加Treg细胞数量来减轻银屑病皮肤损伤和炎症也很正常。DHA促进Treg细胞生成的确切机制仍有待未来研究确定, 先前的研究表明,DHA可能通过抑制mTOR信号转导诱导Treg细胞的表达[7];DHA也有可能通过抑制促炎细胞因子的表达来维持Treg细胞的数量,因为一些促炎细胞因子,如IL-6,会影响FOXP3的表达[8]。本研究没有对其机制做进一步的研究,这也是笔者未来将要研究的内容。总之,我们的研究结果首次证明,DHA不仅可以抑制Th17细胞,也可以通过上调Treg细胞的途径,达到治疗银屑病皮损的目的。

      IL-23/Th17通路是银屑病发病机制的关键轴,IL-17A是该通路的主要效应物,IL-17A的过度表达会导致表皮过度增生和强烈的炎症反应,从而导致银屑病皮疹和全身炎症,靶向抗IL-17A疗法已证明可有效治疗银屑病[26]。LIU等[21]研究发现,DHA可以降低银屑病小鼠皮肤炎症因子IL-17A、IL-23的表达,也可以降低小鼠脾脏Th17细胞的数量,认为DHA可以通过调控IL-23/TH17轴减轻银屑病小鼠的皮损。本研究在此基础上,进一步检测DHA治疗后银屑病小鼠血清IL-17A的表达,发现血清中的IL-17A也是降低的。TNF-α也是银屑病发病机制中重要的炎症因子,针对TNF-α的生物制剂在银屑病的治疗中取得了非常好的疗效[27]。本研究发现,DHA也可以通过抑制血清中的TNF-α的水平来发挥治疗银屑病的作用。

      综上所述,本研究发现DHA通过改善银屑病小鼠皮损、抑制表皮增生、抑制促炎细胞因子如IL-17A和TNF-α的表达,对银屑病发挥有效的抗炎和治疗作用。本研究还发现DHA可以增加IMQ诱导的银屑病小鼠脾脏Treg细胞的数量,同时降低银屑病小鼠脾脏Th17细胞的数量。本研究为DHA治疗银屑病提供了实验依据。

参考文献 (27)

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